방법 논문

디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

DOI:

10.3791/54460

⸱

2016년 9월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

염증성 장질환 치료를 위한 잠재적 신약의 평가에는 항염증 효과의 정확한 평가가 가장 중요합니다. 디지털 홀로그램 현미경은 쥐 및 인간 결장 조직 샘플의 염증 평가뿐만 아니라 상피 상처 치유의 체외 자동 다중 모드 평가를 제공합니다.

초록

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즉, 염증성 장 질환의 발생 빈도는, 크론 병과 궤양 성 대장염은 상당히 지난 10 년간 증가했다. IBD의 원인은 알 수없는 남아 있고 현재 치료 전략은 면역 시스템의 불특정 억제를 기준으로합니다. 특히 현저 IBD의 관리를 향상시킬 수있는 장내 염증과 상피 상처 치유를 표적 치료의 개발은, 그러나 이것은 염증성 변화의 정확한 검출을 필요로한다. 현재 잠재적 인 약물 후보는 일반적으로 생체 내 또는 시험 관내 세포 배양 기술을 기반으로, 동물 모델을 이용하여 평가된다. 조직 학적 검사는 일반적으로 샘플 특성을 변경할 수 있으며, 또한, 연구 결과의 해석은 연구자의 전문성에 따라 다를 수있는 세포 또는 관심의 조직 염색 할 필요합니다. 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)는 광로 길이 지연의 검출에 기초하여 허용얼룩없는 양적 위상차 영상. 이 결과는 직접적으로 절대 생 물리적 파라미터와 상관 될 수있다. 우리는 굴절률 측정을 기반으로 DHM와 조직 밀도의 변화 측정, 대장염 쥐와 인간의 대장 조직 표본의 다른 레이어에, 염색하지 않고, 염증성 변화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 건조 중량 및 마이그레이션 세포의 층 두께로 부상 면적과 형태 학적 매개 변수의 동시 결정 간단한 자동 결정을 통해 DHM을 사용하여 체외 가능 상피 상처 치유의 연속 복합 라벨없는 모니터링을 보여줍니다. 결론적으로, DHM은 가치, 소설, 양적 도구 가능한 매개 변수에 대한 절대 값과 장 염증의 평가, 시험관 내에서 상피 상처 치유의 단순화 정량을 나타내고, 따라서 번역 진단 유 높은 잠재력을 가지고있다그 자체.

서론

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염증성 장 즉 질환 (IBD), 궤양 성 대장염 (UC) 및 크론 병 (CD)은 위장관 (1)의 특발성 염증성 질환이다. IBD의 기본 병태 생리 및 잠재적 신약 또는 새로운 진단 방법의 평가에 대한 연구는 특히 중요하다. 모두 기초 연구 및 IBD 환자의 임상 관리에서, 장 점막 관심 2,3의 초점이되었다. 점막은 공생 박테리아, 상피 세포 및 장 면역계의 다양한 세포 구성 요소 간의 상호 작용을 직감 4,5 항상성 조율하는 해부학 적 경계를 나타낸다. 그러나, IBD 환자, 조절되지 않는 영구 장 염증은 결국 자체가 지역의 염증 (6)을 악화 상피 장벽 기능의 고장 절정에 달하다 수 있습니다 궤양이나 협착 등의 검출 손상, 점막 연결됩니다.

상피 치유 염증 다음 상피 재생을위한 따라서 중요하다뿐만 아니라 위장 수술 7 일 후 위장관 궤양 또는 문 합부 누출의 치유의 핵심 요구 사항입니다 상처. 상피는 치유 검정 치료 시험 관내 상처 시뮬레이션 장내 염증 8,9의 뮤린 모델 수 권취. 두 시험 관내 및 생체 내 접근법 실험 평가의 정확성을 제한하는 문제점을 가지고있다. 시험관 분석법을 고전 스크래치 분석처럼 형광 발색단와 장기화 염색 절차 또는 형질 전환이 필요합니다. 이들은 종종 10을 자동화 할 수없는 세포 증식 및 이동의 그 불연속 모니터링에 의해 제한된다. 이러한 덱스 트란 황산나트륨 (DSS)에 의해 유도 성 대장염과 같은 생체 내 모델을 자주 인해 나타나는 심각한 변화에 부분적으로 강력한 리드 아웃 부족 실험실 마커에, 엄마부적절한 왕 같은 마커는 대장염 심각도 11, 12을 평가한다. 염증 점막의 조직 학적 분석은 여전히 현재 대장염의 심각도를 결정하는 가장 유효한 방법이지만이, 시험 관내 상피 창상 치유의 분석처럼, 염색을 필요로하고 연구자의 ​​전문성 (13)에 따라 달라집니다.

최근 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 정량적 인 위상 현미경 (14)의 변형이 시험 관내 및 생체 내 15 상피 상처 치료의 평가에 유용한 도구로 확인되었다. DHM은 (OPD)의 광로 길이의 지연을 측정함으로써 조직 농도의 평가를 허용 어느 전망 소설 암 진단 16 ~ 18과 염증 관련 조직 변화 (19)의 정량화. 또한, DHM은 셀 두께, 셀 커​​버 표면적 세포 (단백질) 함량의 양을 측정함으로써 세포 형태 역학의 모니터링을 허용 15, 20. 생체 외 분석에서, DHM은 생리 학적 과정, 예를 들면, 세포 부피 및 두께 (21, 22)의 변화를 평가함으로써 셀룰러 투수의 분석을 가능하게한다. 또한, DHM 측정 조사원 관련된 샘플 바이어스를 방지하는 자동화 될 수있다.

여기서는 장내 염증의 뮤린 모델 DHM의 사용을 설명하고, 또한, 라벨없는 시험 관내 분석과 같은 상처 치유 정량적 모니터링 인체 조직 시료의 분석을 적용 DHM. 첫째, 우리는 IBD와 인간의 대장염 마우스 및 조직 섹션에서 다른 대장 벽 층의 염증 변화를 평가한다. DHM 정량적 위상 촬상 절차를 기술 한 결과 취득한 정량적 위상 이미지에 대한 평가를 설명도 현미경 성분, 조직 절편의 제조 및 사용에 대한 자세한 설명을 제공한다.

다음으로, DHM은 요로 감염 될 수 있다는 것을 보여시험관 내에서 상피 상처 치유 복합 지속적인 모니터링하게 안정적 및 세포 막 두께, 건조 질량 및 부피 등 셀룰러 세포의 특성 분석을 서술 약물 유도 세포 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공한다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 독일어 동물 보호법에 따라 지역 윤리위원회합니다 (Landesamt 대 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, LANUV, 독일)에 의해 승인되었다. 뮌스터 대학의 지역 윤리위원회는 조직 학적 및 현미경 분석을위한 인체 조직의 사용을 승인했다.

1. 동물 및 재료

  1. 지역 동물 보호 법률에 따라 여성 또는 20g (25)에 무게 필요한 DSS 감수성 균주의 수컷 마우스, 집을 사용합니다. 설치류 특별한 차우을 제공하고, 임의 량의 물을 마시는 멸균.
  2. 멸균 된 수돗물 5 일 : 덱스 트란 황산 나트륨 (36,000-50,000 다 DSS, 분자량) V / 승 3 %를 투여하여 급성 DSS 대장염을 유도한다.
    참고 : DSS의 힘 제조 업체 및 배치에 따라 매우 다양하다. 질병 활성의 유도를 위해 먼저 공급 업체에서 제공하는 DSS를 테스트하는 다에 대한ILY 체중은 신뢰할 수있는 객관적 지표입니다.
  3. 결장 조직 샘플의 조직 학적 평가를 위해 실험 끝에 CO 2 통기 (또는 국가 기관 가이드 라인을 지정)에 의해 마우스를 안락사.

2. 실험 설정 DSS-대장염과에서 시험관 상처 치유 분석 실험

  1. 세포 배양 및 상처 치유 분석의 설립.
    1. 37 ° C에서 95 % 습도 및 5 % CO 2 환경의 카코 -2 세포를 성장한다. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 RPMI 배지를 사용한다.
    2. 높은 문화 인서트 35mm 배양 접시에 4 × 10 5 세포 / cm 2의 밀도 씨 카코 2 세포 (그림 4A 참조).
      참고 : 삽입은 상처 영역을 나타내는 정의 된 셀 여유 공간을 분석하기로 분리 된 두 개의 셀 적용 영역을 생성합니다.
    3. 이일 seedin 후 매체 변경지. 먼저 자동 피펫을 사용하여 세포 파편과 잔류 매체를 흡입에 의해 수행, 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎕ (PBS)로 세척하고 신선한 RPMI 매체 또는 혈청 박탈 매체를 추가합니다.
    4. 상처 치유 행동의 변화를 감지하는 20 ng를 EGF / ㎖의 혈청 또는 2 μg의 마이 토마 이신 C / ㎖의 혈청 혈청 박탈 매체 (0.1 % FBS)에서 24 시간 동안 배양 세포. 24 시간 동안 세포를 제어하는​​ 정상 RPMI 매체를 추가합니다.
    5. 문화의 24 시간 후, 제거하고 단계 3.4에 설명 된대로 문화 삽입을 취소하고 DHM을 수행합니다.
  2. 급성 DSS 대장염의 유도
    1. (w / v)의 DSS 솔루션을 3 %를 얻기 위해 물을 멸균 100 ㎖에 DSS의 3g을 녹인다. 7 일간 쥐 광고 무제한에 물을 마시는 대신에이 솔루션을 제공합니다. 마우스 / 하루 DSS-용액 5 ㎖를 계산합니다. 제어 마우스 광고 임의로위한 DSS없이 멸균 된 물을 제공합니다.
  3. 쥐와 인간의 결장의 저온 유지 섹션의 준비
    1. 실험의 끝에 CO 2 취입 마우스 안락사.
    2. 개복술 (23)에 의해 동물의 복부를 해부하다. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 전체 대장을 제거하고 수술 가위를 사용하여 회장 및 직장 끝을 잘라. 직장 끝까지 맹장에서 길이 방향 가위로 결장을 잘라 콜론을 엽니 다. PBS (24)로 세척 한 다음 핀셋을 사용하여 표본에서 모든 배설물을 제거합니다.
    3. 안쪽으로 곡선 점막과 직장 끝으로 맹장에서 길이 방향으로 새싹 목화와 전체 대장을 감아 스위스 롤을 준비합니다. 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물에 결장 샘플을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오.
    4. 최적의 절삭 온도 10월 화합물 수술 표본에서 인간의 대장 조직을 포함하고 더 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관하십시오.
    5. cryoto의 도움으로 OCT의 화합물 내장 표본의 7 μm의 두께의 컷 섹션시험에 날 직전.
      주 : 최적 샘플 두께는 조사중인 지속성 및 조직 유형의 분산 특성에 따라 달라진다. 인한 양적 DHM 위상 콘트라스트 영상에서 빛의 산란에 결장 조직 노이즈> 10 ㎛의 원인이 크게 증가 슬라이스 두께를 사​​용하여 설명 된 실험에 대한 두께의 샘플을 <5 ㎛의은 크라이 절단 공정 손상 유도 된 인공물에 대한 높은 위험을 표시하는 동안.
    6. 유리 개체 캐리어의 슬라이드에 섹션을 전송합니다.

3. 기술 장비, 디지털 홀로그램의 수집 및 평가 용 소프트웨어 및 절차

  1. 양적 세포 및 조직의 영상을위한 디지털 홀로그램 현미경
    1. 도 1에 나타낸 바와 같이, 생균 촬상 25 축외 마하 젠더 디지털 홀로그램 현미경 시스템을 사용한다. 현미경이 장착되어 있는지 확인10X 현미경 렌즈 35 mm의 직경을 갖는 유리 물체 운반기 슬라이드와 배양 접시의 홀더와 현미경 단계는 가열 챔버 정량적 위상 촬상 25 생리 37 ° C의 온도 및 소프트웨어를 보존한다.
      참고 : 예를 들어, 켐퍼 등 26 Langehanenberg 등 27에 설명 된대로...
      주 : 또는 시야 현미경 살아있는 세포의 양적 위상 이미징 해부 조직 슬라이드를 수행 할 수있는 유사한 시스템을 사용한다.
    2. 면도 현미경 렌즈와 렌즈 클리닝 용지 먼지 또는 기타 오염물을 제거하기 위해 현미경의 제조자가 권장하는 세정제 (예, 에탄올)와 콘덴서.
    3. 백색광 조명 "의" "시야"영상 모드 스위치를 선택 DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. 쾰러 - illumin 확인(다르게는, 표준 화상 취득 소프트웨어가이 단계에서 사용될 수있다), 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창에서 샘플을 관찰하면서 현미경 제조사 권장 샘플 ATION.
      주 : 이미지 세기가 시야에 균일하게 분산되어야하며 샘플 위치는 현미경의 초점 거리를 가진 광학 재 집속 중 조작해야한다.
    4. 레이저 빛 "의"백색광 조명 및 스위치 "OFF"설정 "DHM"영상 모드를 선택합니다. 레이저 광 조명을 균질인지 확인 (즉, 광 강도가 균일 DHM 현미경 영상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창에 분포된다) 및 오프 액시스 캐리어 간섭 줄무늬 패턴이있는 충분한 콘트라스트 나타나는지 관찰 촬영 한 이미지 (디지털 홀로그램).
  2. 이미징을위한 저온 유지 부의 제조DHM와
    1. (두께, 유리 개체 캐리어에 그라 이오 스탯 섹션 : 7 μm의, 2.3에 설명 된대로) 샘플을 냉장고에서. RT 정상 대기에서 약 5 분 동안 샘플을 해동.
    2. 그 버퍼가 완전히 피복 될 때까지 피펫을 이용하여 조직 절편 상에 매체를 삽입 100 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS) - (50)를 추가한다. 깨끗한 유리 커버 슬립 (유리 두께 170 μm의)와 샘플을 커버.
      주 : 동안 건조 굴절률의 상당한 변화와 샘플의 산란 특성을 유도 할 수있다.
    3. 유리 캐리어와 커버 슬립의 바닥은 빛의 산란을 유도 할 수 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플은 밝은 필드 현미경 및 DHM와 조사에 대한 준비가되어 있습니다.
  3. DHM와 조직 절편의 정량적 인 위상 이미지
    1. 디지털 홀로그램 현미경에 스위치 이미징의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. 제 i 시작마법사 수집 상기 DHM 현미경의 소프트웨어와 밝은 파일 영상 모드를 선택합니다.
    2. 현미경 대물 렌즈에 대향하는 커버 슬립, 현미경 슬라이드 홀더) (2)에 기술 된 바와 같이, 조직 슬라이드를 놓는다.
    3. DHM 현미경의 시야 조명 "의"전환합니다. 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 관심의 조직 영역은 실시간 감시 창에 표시되는지 확인합니다. 현미경의 초점 거리를 사용하여 이미지의 선명도 향상.
      주 :뿐만 아니라 관심 영역이없는 조직 슬라이드의 영역도 시야에 존재한다.
    4. 화상 획득 소프트웨어를 사용하여 크게 집중 샘플의 명 시야 이미지를 캡처.
    5. 선택 "DHM"영상 모드, 레이저 광 조명 "의"백색광 조명 "OFF"로 설정하고 전원을 켭니다. 3 밀리 초 이하 홀로그램 기록에 대해 "노출 시간"을 선택하여 그 hologr을 관찰aphic 축외 간섭 줄무늬는 촬상 수집 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 디지털 홀로그램을 포착.
    6. 명 시야 이미지와 다른 샘플 영역 디지털 홀로그램 충분한 수를 기록 할 때까지 3.3.5 - 반복 단계 3.3.3. 홀로그램 인수가 완료되었습니다.
  4. DHM 영상에 대한 상처 치유 분석의 준비
    1. DHM 측정시 안정적인 온도 조건을 보장하기 위해 3 시간 전에 실험의 시작 - 약 1 DHM 현미경의 페트리 접시 가열 챔버에 전환합니다.
    2. 필요한 장비 (2.3에서 설명하는 상처 치유 분석을위한 배양 접시)와 작업대 준비 : 피펫, 핀셋, 페트리 접시 용 유리 뚜껑, 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)은 생리 학적으로 세포 배양 배지를 버퍼링 무균 환경에서 샘플 준비를위한 온도 (37 °의 C).
      참고 : ℓ의 NaHCO3로 구성된다.
    3. 페트리 접시에서 플라스틱 뚜껑을 제거하고 피펫으로 세포 배양 배지를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 배양 접시 바닥에서 삽입물을 제거합니다.
    4. 사균 상처 영역에 남아있는 세포 성분 (예, 혈청)을 제거하기 위해 버퍼링 한 ML HEPES 세포 배양 배지로 2 회 - 샘플 1을 씻는다. 2 ml의 HEPES를 버퍼링 세포 배양 배지를 추가하고 유리 뚜껑 페트리 접시를 캡.
    5. 유리 뚜껑과 배양 접시 바닥 먼지 및 기타 오염 청소되어 있는지 확인합니다. 샘플 DHM와 시간 경과 관찰을위한 준비가되어 있습니다.
  5. DHM와 체외에서 상처 치유의 연속 멀티 모드 모니터링
    1. 이전에 3 시간 - DHM 현미경 약 1의 페트리 접시 가열 챔버에 전환실험의 시작에 DHM 측정 중에 안정된 온도 조건을 보장한다.
    2. 디지털 홀로그램 현미경 "의"스위치, 영상의 10 배 현미경 렌즈를 선택합니다. DHM 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 시작하고 "시야"영상 모드를 선택합니다. 페트리 접시의 가열 챔버는 생리적 온도 (37 ° C)를 작동하는지 확인합니다.
    3. DHM 현미경의 가열 실 (4)에 기재된 바와 같이 제조 된 상처 치유와 분석 페트리 접시), 놓는다.
    4. 명 시야 촬상 모드를 선택하고 DHM 현미경 화상 취득 소프트웨어를 실시간 감시 창을 보면서 현미경 스테이지 샘플 위치. 샘플의 원하는 영역이 크게 백색광 조명 아래에 초점을 맞춘 나타납니다 것을 관찰한다.
    5. 흰색에서 샘플의 서로 다른 영역의 명 시야 이미지 (상처 영역과 합류 세포와 주변 지역을) 캡처화상 획득 소프트웨어 및 문서 모양 세포 밀도와 균일 광 조명과.
    6. DHM 현미경의 "시야"영상 모드를 선택합니다. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어를 실시간 감시 창 백색광 조명 하에서 적절한 상처 영역을 선택한다. 상처 영역은 죽은 세포없이 혈청 유적에서 무료로 확인하고 양측이 바람직 직선 테두리가 하나의 균일 한 세포 층을 포함 있는지 확인합니다.
    7. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 시야 촬상 모드의 초기 창상 면적 백색광 이미지를 캡처.
    8. 레이저 조명 "의" "DHM"모드 스위치를 선택, 백색광 조명 "OFF"로 설정합니다. 홀로그램 기록 다음 3 밀리의 노광 시간 (간섭 줄무늬가 t의 화상 취득 소프트웨어의 라이브 영상 창의 적절한 콘트라스트 나타나는 홀로그램 축외 관찰 선택그는 현미경을 DHM)와 디지털 홀로그램을 캡처합니다.
    9. 화상 획득 소프트웨어 DHM 모드 샘플 홀로그램을 포착하여 화상 품질을 확인하기 위해 DHM 현미경 재구성 소프트웨어 정량적 위상 이미지를 재구성.
    10. DHM 현미경 화상 획득 소프트웨어 경과 홀로그램 취득 - (5 분 예 3) 적절한 시간 지연을 선택한다.
    11. 샘플 만 홀로그램 취득 중에 레이저 광이 조사되는 화상 취득 소프트웨어의 시간 경과 획득 모드를 선택한다.
    12. 상처 치유 분석의 시간 경과 DHM 관찰을 시작합니다.
    13. , 의도 한 시간 후 시간 경과 수집을 중지 시야의 영상 모드를 선택하고 백색광 영상에서 샘플의 마지막 모습을 문서화합니다.
  6. 해부 조직 디지털 홀로그램을 재구성하고 정량화 파라미터로서 평균 굴절률을 결정조직 밀도
    1. 켐퍼 외. 26 Langehanenberg 외. (27)에 기술 된 바와 같이, 예 DHM 현미경의 소프트웨어 해부 조직의 디지털 홀로그램 양적 위상 이미지를 재구성.
    2. 관심 (로아) (19)의 적절하게 선택 지역에서 다른 조직 층 (상피 세포, 점막하, 기질)의 평균 위상차 Δφ를 결정합니다.
    3. 굴절계를 사용하여 또는 대안 문헌 적절한 값을 이용하여 상기 매립 매체의 굴절률을 결정한다. (일반 매립 매체 굴절률 값 : 물 = 1.334 N 28 N 인산염 식염수 (PBS) = 1.337 29 없음 세포 배양 배지 = 1.337-1.339 29,30 버퍼링).
    4. 평균 위상차 19 값과 다른 조직의 층의 굴절률을 계산
      figure-protocol-1 참고 : 식으로. 상기 해부 조직의 두께 D (여기서는이 7㎛) 한 λ는 (λ = 532 nm의 여기) 레이저 광의 파장이고, n은 매질 여기 매립 매체 (굴절률이다 매체 = N PBS N 아베 - 굴절계에 의해 결정 = 1.337).
  7. 재구성과 일련의 관찰 상처 치유 시간 경과에서 디지털 홀로그램을 평가
    1. DHM 현미경 소프트웨어 (26, 27)와 상처 치유 관찰하는 동안 얻은 시간 경과 홀로그램 시리즈에서 양적 위상 이미지를 재구성.
    2. 최대 위상 콘트라스트 이미지에 양적 위상 이미지의 각 시리즈를 정상화.
    3. 당 될 수 영상 분할하여 정량적 DHM 위상 이미지의 셀에 의해 커버되는 영역 S의 C를 결정자유 소프트웨어 셀 프로파일을 사용하여 형성 (www.cellprofiler.org 31).
    4. 면적 S C가 세포 Δφ 셀의 평균 위상차를 계산한다.
    5. 면적 S의 15 ℃에서의 평균 위상차 Δφ 셀로부터 셀룰러 건조 질량 DM 검색
      figure-protocol-2 (2)
      주 :이 DM 셀룰러 건조 질량을 나타내고, 수학 식에서, S C는 세포 및 α = 0.002 ㎡ / kg에 의해 점유되는 영역을 제공한다.
    6. 적분 셀룰러 굴절률 n 개의 셀 및 세포 배양 배지 N 매질의 굴절률을 결정한다. (30)에 기술 된 바와 같이 부유 세포는 별도로 실험적으로 n 개의 셀을 결정하고 굴절계와 n 개의 매체를 측정한다. 알터상대적으로 n 개의 셀 (30)과 중간 29, 30 N에 대한 문헌 값을 사용합니다.
    7. λ, Δφ 셀, 셀 N 및 N 매체 26,32으로부터 평균 셀 두께 d 셀 계산
      figure-protocol-3 (삼)
      참고 : 식으로. 세 파라미터 D 셀 λ는 레이저 광의 파장 평균 셀 두께를 나타내고있다, Δφ 전지는 평균 위상차를 나타내고, 셀 및 N 중, N은 정수 셀룰러 굴절률과 주위 매체의 굴절율이다.

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결과

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디지털 홀로그램 현미경에 대한 DHM 이미지에 대한 일반적인 설정 (DHM)

도 1b에 도시 된 바와 같이 명 시야 촬상 정량적 DHM 위상차 촬상을 수행하기 위해 거꾸로 현미경을 적용 하였다. (25) 상술 한 바와 같이 시스템이하는 DHM 모듈을 부착시킴으로써 변성시켰다. 마하 젠더 구성 (도 1 A)에 YAG 레이저 λ = 532 ㎚) : 디지털 홀로그램을 조명함으로써 주파수의 Nd 배의 빛으로 샘플을 생성 하였다. 해부 조직 유리 캐리어 슬라이드 생체 분석 하였다. .도

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토론

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우리는 DHM은 쥐 대장염 모델에서 조직 학적 손상과 인간의 대장 조직 샘플 생체의 정확한 평가를 제공한다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 DHM 지속적 동시에 세포 변화에 대한 복합 정보를 제공하는 동안 상피 상처 치유를 모니터링 할 수 있습니다 표시. DHM에서 디지털로 촬영 된 홀로그램의 재건 수치 (32)이 수행된다. 따라서, 명 시야 현미경 제르 니케 위상차 미분 간섭 현미경 대조에 비하여, DHM은 선택적 후속 숫자 포커스 보정 (다 초점 화상)와 양적 위상차 (27)를 제공한다. 정량적 인 위상 이미지는 광로 길이의 변화의 판정에 기초하여 이에 이용되는 측정 장치의 매우 독립적이다. 이는 다른 수단에 취득 된 측정 데이터의 비교를 단순화시킨다. 또한, DHM은 OBJE 만 낮은 조명 강도를 필요코네티컷 조명. 이 흠 해부 조직의 침습적 분석을 가능하게하고 살아있는 세포의 장기간 경과 관찰 중 필요한 샘플의 상호 작용의 양을 최소화한다.

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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원고를 교정해 주신 Faekah Gohar에게 감사드립니다. Sonja Dufentester와 Elke Weber의 전문적인 기술 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Cell Culture FlaskGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, 웁살라, 스웨덴DB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanySPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Isopentane (2-Methylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
메틸렌 블루머크, 다름슈타트, 독일1159430025
미토마이신 C시그마 - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM4287
Microscope SlidesG. Menzel, Braunschweig, GermanyJ1800AMNZ
O.C.T. 티슈 텍 컴파운드                                                                 Sakura, Zoeterwonde, 네덜란드4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgium1558
Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgium3626
Sodium Chloride 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
표준 다이어트Altromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgium7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, 테닝겐, 독일04-0002 
  &마이크로;-접시 35mm, 배양 인서트 포함, highibidi GmbH, 뮌헨, 독일81176
DIC 뚜껑 &마이크로;-접시용 뚜껑, 유리 인서트 포함ibidi GmbH, 뮌헨, 독일80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
디지털 홀로그램 현미경
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Germany
현미경 렌즈Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, 괴팅겐, 독일
CCD 카메라DMK 41BF02The Imaging Source, 브레멘, 독일

참고문헌

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