우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.
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이 논문에서
요약
초록
동맥 혈전증(혈전)은 죽상동맥경화증, 당뇨병, 비만, 암, 만성 자가면역 류마티스 질환 등 만성 염증과 관련된 많은 전신 질환의 흔한 합병증입니다. 혈전은 대부분의 심장 마비, 뇌졸중 및 사지 상실의 원인이며, 혈전증은 매우 중요한 공중 보건 문제입니다. 이러한 혈전은 부적절한 혈소판 활성화와 그에 따른 응고로 인해 발생하기 때문에 이러한 시스템을 치료적으로 표적으로 삼는 것은 보다 안전한 치료법을 개발하는 데 중요한 임상적 의의가 있습니다. 지혈계의 복잡성으로 인해 시험관 내 실험은 혈액과 혈관 벽의 상호 작용을 복제할 수 없습니다. 따라서 생체 내 연구는 혈전 형성의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이를 위해 마우스에서 다양한 혈전증 모델이 개발되었습니다. 그 중 염화제이철(FeCl3) 유도 혈관 손상은 널리 사용되는 폐색성 혈전증 모델로, 무균 폐쇄 혈관 시스템의 맥락에서 혈소판 활성화 및 응집을 보고합니다. 이 모델은 산화환원 유도 내피 세포 손상을 기반으로 하며, 이는 항응고제 및 항혈소판 약물 모두에 간단하고 민감합니다. 혈류를 막는 혈전이 발생하는 데 필요한 시간은 혈전성 질환과 관련된 혈관 손상, 혈소판 활성화 및 응집을 정량적으로 측정합니다. 우리는 이 FeCl3 유도 혈관 혈전증 모델을 크게 개선하여 최소한의 변동으로 데이터의 재현성을 높였습니다. 여기에서는 모델을 설명하고 혈전증 연구에서 이 모델의 유용성을 입증하는 여러 실험 설정의 대표 데이터를 제시합니다.
서론
동맥 혈전증 (혈전)는 죽상 동맥 경화증, 당뇨병, 비만, 암,자가 면역 만성 류마티스 질환을 포함한 만성 염증과 관련된 다양한 전신 질환의 일반적인 합병증이다. 부적절한 혈소판 활성화, 집계 이후 coagulatory 메커니즘에서 동맥 순환 줄기에 발생하며 혈전은 심장 마비, 뇌졸중 및 사지 손실에 연루되어있다. 혈관벽은 혈관벽에 혈액 세포, 호르몬 및 사이토킨뿐만 아니라 항산화 단백질의 발현을 순환하는 다수의 세포 유형을 포함하고, 전단 응력을 포함 외적 요인의 다수에 의해 영향 복잡한 시스템이다. 시험 관내 실험에서 복제 할 수없는 이 복잡한 환경 때문에 동물 모델을 이용한 생체 내 연구는 혈전 성 질환에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록하는 것이 중요하다.
마우스는 SIM이 밝혀졌다혈전증, 동맥 경화, 염증과 당뇨병 1,2의 관점에서 인간 ILAR 메커니즘. 또한, 유전자 녹아웃 마우스는 복잡한 생리 학적 또는 병리학 적 환경에서 특정 유전자 산물의 기능을 테스트하기 위해 생성 될 수있다. 이러한 연구는 인간의 병리를 모방하고 새로운 경로 및 치료법의 발견에 관한 중요한 기계론의 정보를 제공 할뿐만 아니라 혈전증에 약물 효과를 특징 짓는 중요한 정보를 제공 할 수있다....
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프로토콜
모든 절차와 동물의 조작은 미국 공중 보건 서비스 동물 애호 관리에 대한 정책 및 동물의 사용 및 관리에 대한 NIH 가이드 및에 따라 클리블랜드 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 실험 동물의 사용.
1. 준비 :
- 라벨 혈소판에 대한 형광 염료
- 식염수에, 로다 민 6G 솔루션, 0.5 ㎎ / ㎖를 준비하고 0.22 μm의 필터 솔루션을 소독.
- 50ml을 해결
- 30 % 50ml을의 신선한 원액 확인 순수한 물 (무수을, 1.85 M와 동일), 0.45 μm의 필터로 필터링 할 수 있습니다. 5 ml의 신선한 50ml을 원하는 농도로 3 솔루션 [예를 들어, 2.5 % (0.154 M), 5 % (0.308 M), 7.5 % (0.463 M), 10 % (0.617 M)와 12.5 % (0.771 M)]에 의해 준비 물 난으로 30 % 50ml을 솔루션을 희석NA 6cm 조직 배양 접시 뚜껑을 유지 폐쇄.
참고....
- 30 % 50ml을의 신선한 원액 확인 순수한 물 (무수을, 1.85 M와 동일), 0.45 μm의 필터로 필터링 할 수 있습니다. 5 ml의 신선한 50ml을 원하는 농도로 3 솔루션 [예를 들어, 2.5 % (0.154 M), 5 % (0.308 M), 7.5 % (0.463 M), 10 % (0.617 M)와 12.5 % (0.771 M)]에 의해 준비 물 난으로 30 % 50ml을 솔루션을 희석NA 6cm 조직 배양 접시 뚜껑을 유지 폐쇄.
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결과
경동맥의 동맥 혈전증 모델
C57BL6 배경으로 마우스에서 우리는 출발점으로 1 분 동안 혈관을 치료하기 위해 7.5 % 50ml을 사용하는 것이 좋습니다. 7.5 %의 치료 50ml을에서 부상 영역과 정상 혈관 벽의 경계는 쉽게 (참조 온라인 비디오 1) 현미경으로 식별, 내피 층이 크게 손상되었음을 시사한다. 혈전은 50ml을 처리 즉시 형성하고, 손상 후 모든 WT C57BL6 마우스 1 분에서 관찰된다. 초기 형성된 혈전이 불안정하며, 그 부분은 일반적으로 얻어 혈류 세정되므로, 형성된 혈전을 2 작아짐 - 손상 후 3 분. 필터 용지를 제거한 후 4 분,이 이후 형성된 혈전은 안정적이며 일반적으로 씻어되지 않습니다 - 혈전 3에서 확대하기 시작합니다. 평균 폐색 시간 (N = 14)을 C57BL6 마우스에서 11.3 ± 3.16 .......
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토론
50ml을 유도 된 모델은 혈소판 기능 및 혈전증 7,8,16,19,31-33의 유전자 변형에 대한 유용한 정보를 제공 할뿐만 아니라, 가장 널리 사용되는 혈전 모델의 하나이며, 또한 유용한 도구가 될 수있다 죽상 혈전증 질환 11,17,34-37의 치료 및 예방을위한 치료 화합물과 전략의 평가. 여기에서 우리는 우리의 수정이 모델의 개선을 표시하고 항응고제 (TPA) 및 항 혈소판 약물 (PAR4 항체)의 효과를 결정하기에 충분히 민감이 기술의 유틸리티의 추가 증거를 보여왔다. 혈전증의 기전 연구에 더하여,이 모델은 나노 기반 타겟팅 혈전 약물 전달을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 또한 형광 ROS 표시기 (21)의 주사에 의해 혈관벽 활성 산소 종 (ROS) 형성의 검출에 사용될 수있다.
꼼꼼기술이 모델을 수행하는 데 필요한. 운영자는 충분한 수술 기술뿐만 아니라 혈관과 혈액 세포 생물학에 대.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립심장폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute, NHLBI)의 지원을 받았으며 수상 번호는 R01 HL121212(PI: Sen Gupta, Co-I: Li) 및 R01 HL129179 HL098217(PI: Nieman)입니다. 이 출판물의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 수술용 가위 - 텅스텐 카바이드 | 파인 사이언스 도구 | 14502-14 | 컷 앤 홀드 |
| 스킨 마이크로-애드슨 펜치 - 톱니형/스트레이트/12cm | 파인 사이언스 도구 | 11018-12 | 컷 앤 홀드 스킨 |
| Metzenbaum Fino 가위 - 텅스텐 카바이드/곡선/블런트-블런트/14.5 cm | 파인 사이언스 도구 | 14519-14년 | 연조직을 절개하고 분리하기 위해 |
| 울트라 파인 지혈제 - 매끄럽게/곡선형/12.5cm | 파인 사이언스 도구 | 13021-12 | 연조직을 해부하고 분리하는 |
| Graefe 집게 - 톱니모양/직선형/10cm | 세밀한 과학 도구 | 11050-10 | 연조직을 해부하고 분리하기 위해 |
| Dumont #5 Fine Forceps - 생물학 팁/스트레이트/이녹스/11 cm | 파인 사이언스 도구 | 11254-20년 | 주변 조직으로부터 혈관 분리 |
| Dumont #5XL 펜치 - 표준 팁/스트레이트/이녹스/15cm | 파인 사이언스 도구 | 11253-10 | 주변 조직에서 혈관 분리 |
| 블런트 훅- 12 cm/0.3 mm 팁 직경 | 미세 과학 도구 | 10062-12 | 주변 조직에서 용기를 격리 |
| Castroviejo 마이크로 바늘 홀더 | Fine Science Tools | 12061-02 | 바늘 홀더 |
| 봉합사 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | 앞니를 플레이트에 고정하기 위해 |
| 봉합사 실 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | 모든 수술 및 결찰을 위한 |
| Kalt 봉합 바늘 | 파인 사이언스 도구 | 12050-03 | |
| 로다 민 6G | Sigma | 83697-1G | Lebel 혈소판 |
| FeCl3 (무수) | Sigma | 12321 | 혈관 손상 유도 |
| 파파베린 염산염 | Sigma | P3510 | 장 연동 운동을 억제합니다. |
| Medline 수술 기구 살균 증기 오토클레이브 테이프 | Medline | 111625 | 플레이트에 마우스를 고정하기 위해 |
| Fisherbrand™ 주사기 필터 - 멸균 0.22 &마이크로; m | Fisher | 09-720-004 | 마우스에 주입된 용액의 살균을 위해 |
| Fisherbrand™ 주사기 필터 - 멸균 0.45 &마이크로; m | Fisher | 09-719D | FeCl3 용액을 필터링하려면 |
| 멸균 알코올 준비 패드 | Fisher | 06-669-62 | 수술 부위를 살균하기 위해 |
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참고문헌
- Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
- Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
- Rugger....
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