방법 논문

백혈구가 풍부한 혈액 샘플의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 신속하고 구체적인 평가

DOI:

10.3791/54484

⸱

2016년 7월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 세포 내 할로겐화 과산화효소 활성의 후속 특이적 측정을 위해 작은 혈액 샘플에서 백혈구를 빠르게 농축하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 인간 및 비인간 물질에 적용할 수 있으며 새로운 염증 마커의 평가에 기여할 수 있습니다.

초록

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이 논문에서는 작은 전체 혈액 샘플에서 백혈구의 신속하고 표준화 된 농축을위한 프로토콜을 설명한다. 이 절차는 적혈구의 저 삼투압의 용해를 기반으로 비 - 인간 기원의 혈액뿐만 아니라 인간의 샘플에 적용될 수있다. 약 50 ~ 100 μL의 작은 초기 샘플 볼륨이 작은 실험 동물에서 반복 채혈에이 방법을 적용 할 수 있습니다. 또한, 백혈구 농축 여러 실험실 환경에서이 방법을 적용하고, 분 이내에 화학 물질 및 계측에 대한 낮은 재료 노력으로 얻을 수있다.

백혈구의 표준화 정제는 매우 선택적 헴 퍼 옥시다아제의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성을 평가하기 염색법, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO), 즉, 차아 및 하이포 아 브롬 산 (의 HOCl 및 HOBr)의 형성과 결합된다. MPO 강하게 neut 표현되지만rophils 인간 혈액과 단핵 세포에 가장 풍부한 면역 세포 유형은 관련 효소 EPO 독점적 호산구 표현된다. 이러한 효소의 활성은 할로겐화 거의 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF) 및 차 퍼 옥시 다제 기질, 과산화수소를 사용하여 해결된다. 이후의 유세포 분석되면 모든 퍼 옥시 다제 양성 세포 (호중구, 단핵구, 호산구)를 구별하고 그들의 할로겐화 퍼 옥시다아제 활성을 정량화 할 수있다. APF 염색은 세포 표면 마커의 적용과 결합 될 수 있기 때문에,이 프로토콜은 특히 백​​혈구 하위 분획을 해결하기 위해 확장 될 수있다. 상기 방법은 인간 및 쥐 백혈구에 양의 HOCl 및 HOBr 생산 검출에 적용 할 수있다.

만성 염증성 질환에서 이러한 효소 제품의 광범위하고 다양하게 설명 면역 역할을 감안할 때, 이러한 프로토콜의 이해에 기여백혈구 파생 된 헴의 퍼 옥시다아제의 면역 학적 관련성.

서론

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다형 핵 백혈구 (백혈구라고도 과립구) 및 단핵구는 혈액 -1,2-의 선천 면역 세포의 중요한 구성 요소를 나타낸다. 이들은 병원균뿐만 아니라, 획득 면역 시스템의 활성화 및 전신성 염증 반응 2-4 개시까지 기본 방위에 기여한다. 그러나, 특히 호중구 과립구의 가장 풍부한 형태 및 단핵구는 크게 급성 염증성 사건 (5)의 규제와 종단에 기여한다. 따라서,이 세포는 류마티스 관절염 -6,7- 같은 만성 염증성 질환에서 중요한 역할을 할 수있다. 사실, 천식, 만성 염증성기도 질환, 호산구의 세포 사멸을 손상 혈액 여덟 번째 대부분 과립구 형 특징이다. 그러나 과립구의 세포 사멸 및 대 식세포에 의해 자신의 빠른 제거는 휴대​​ 종료하는 동안 두 가지 중요한 단계는염증 9-11의.

명명 된 면역 세포 두 밀접하게 관련 효소, 즉 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO, 호중구와 단핵구)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO, 호산구)에서 12, 13에서 찾을 수 있습니다. 이 헴 퍼 옥시다아제는 고전 그들이 두 전자적으로 해당 저자 (의사) 내지 (의사 -) 할로겐 자신의 살균 특성 14-16 알려져있다 halous 산을 산화로 체액 성 면역 반응 관련이 있습니다. 생리 학적 조건 MPO 주로 양식 차아 염소산 (의 HOCl)과 hypothiocyanite (- OSCN) 후자와 하이포 아 브롬 산 (HOBr)이 EPO 17-19로 형성되어있다. 새로운 결과는이 (의사 -) 할로겐 효소 활성은 또한 염증 반응의 조절과 면역 반응 (20, 21)의 종료에 기여할 수 있음을 시사한다. 사실, MPO 및 가공 제품의 HOCl 의해 생산 T 세포 기반 적응 면역 반응을 억제 22-2 나타났다4.

이 생리적 기능 MPO와 EPO의 기여를 만성 염증성 질환의 선천 면역에서 백혈구의 면역 학적 역할에 대한 추가 통찰력을 얻을 수를 결정하기 위해 우리는 빨리 후속 특정 소형 혈액으로부터 백혈구를 농축하는 방법을 개발 이들 세포의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성의 결정. 적혈구 고갈 위해 우리는 낮은 재료 비용으로 빠른 백혈구 농축에 이르게 증류수, 두-이후 저장성 용해 단계를 포함하는 표준화 된 방법을 선택했습니다. 후속 할로겐 MPO의 결정 및 EPO의 활동에 대한 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF)는 25 ~ 27을 사용 하였다. 퍼 옥시다아제 비특이적 염색 방법 28,29 적용 달리,이 방법은 종종 심각한 손상 infl에 할로겐 옥시다아제 활성의 선택적 검출을 허용ammation 30, 31.

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프로토콜

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모든 인간의 혈액 샘플을 건강한 지원자로부터 획득하고,인가 된 백혈구 농축 프로토콜은 라이프 치히 대학의 의학 교수의 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 쥐의 혈액과 실험 동물 관리 및 사용에 독일의 지침에 따라, 책임 지역 윤리위원회 (Landesdirektion 작센, Referat 24)에 의해 승인되었다.

1. 실험 설정

주 : 혈액 샘플에서 적혈구의 고갈에 대한 저장성 용해 절차는 시간이 중요한 과정이기 때문에, 사전에 프로토콜의이 부분에 필요한 모든 장치 (예를 들면, 완충액)을 제조 하였다.

  1. 저장성 용해 하나 15 ml의 원심 분리기 튜브와 혈액 샘플 당 후속 아미노 페닐 플루 오레 (APF) 염색 한 1.5 ml의 샘플 튜브 라벨.
    1. 백혈구 보충은 멸균 조건 하에서 수행 할 경우, 흐름 하에서 라벨링을 수행상자.
  2. 샘플 당 약 12​​ ml의 인산염 완충 식염수 (PBS, 10 mm)를 준비합니다. 백혈구는 멸균 조건 하에서 격리 여부되어야하는지 여부에 따라 공급의 준비 멸균 용액을 사용하거나 증류수 PBS 정제를 용해하거나 PBS를 준비한다. pH 값을 확인하고, 필요한 경우, 0.1 M 염산 및 수산화 나트륨 용액의 소량을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
    1. 약 16 샘플에 대한 충분한 비 멸균 완충 용액을 얻었다 증류수 200 ㎖ 중의 (자재 표 참조) PBS 정제 녹인다. 원하는 경우, 멸균 여과하여 용액을 소독.
  3. 칼슘 보충 약 1 ml의 행크스 균형 염 용액 (HBSS) 2 + 샘플 당을 준비합니다.
    1. 100 ㎖의 HBSS 소금 (최종 부피)를 두 번 증류수 970 mg을 녹이고. 최종 부피까지 충전하기 전에, pH 값을 확인하여 pH 7.4로 조정한다. 낮은 버퍼 용량으로 인해, 매일 갓이 버퍼를 준비0.1 M 염산 및 수산화 나트륨 용액을 소량 사용하여 특별한주의와 pH 조정을 수행 할 거라고.
      참고 멸균 용액은 실험에 따라 사용될 수있다. 용액을 멸균 여과에 의해 멸균 될 수있다.
  4. 두 버퍼 라벨 게다가와 튜브를 준비 (예를 들어, 50 ㎖ 원심 분리 관) 또는 플라스크 (예를 들어, 측정 컵 250 ㎖)에 미리 용해 저장성 절차 이중 증류수. 샘플 당 약 10 ㎖의 물을 준비합니다.
  5. 얼음에 수행되는 APF 염색 (섹션 3), 분쇄 얼음 용기를 준비합니다.
  6. 염색시 사용 작업 솔루션을 신속하게 준비 할 수 있도록 사전에 APF의 분취 량을 준비 (3.2 단계) 및 냉동와 APF 솔루션의 해동을 반복하지 않도록.
    주 : APF는 일반적으로 5 ㎎ / ㎖의 메틸 아세테이트 (11.81 mM)을 원액으로 얻어진다.
    1. 0.5 ml의 튜브에 10 ~ 100 μL의 분취 량을 동결. APF는 최종 염색을 위해10 μM의 염료 농도 (단계 3.8)를 사용한다.

적혈구 2. 저압 성 용해

주 : 오염을 피하기 위해 층류 벤치에서 (원심 단계 제외) 저장성 용해 공정을 수행한다. 실온에서 전체 절차를 수행한다. 근력 저하 용해 시간이 중요한 공정이기 때문에, 사전에 물 (2 mL) 및 PBS (5 ㎖)에 첨가 피펫을 조정 절차를 시작하기 전에 물과 PBS 플라스크 연다. 사용하기 전에 실온에서 PBS 용액과 증류수 저장한다.

  1. 각각의 혈액 샘플 전송에서 해당 15 ML의 원심 분리 관에 100 μL.
    참고 : 본 실험에서 혈액 시료는 일반적으로 응집을 방지하기 위하여 헤파린 10 U / ㎖를 함유한다. 그러나 의한 샘플 물질의 다른 소스에 항응고제의 특성 및 농도는 다를 수있다. APF 염색에 미치는 영향은 비교 예에 의해 테스트해야다른 유형 또는 항 응집제의 농도로 보충 된 혈액 샘플로부터 얻은 결과와 그 결과를 보내고.
  2. 2 ml의 증류수를 추가하고, 중간 레벨로 설정 볼텍스 혼합기를 사용하여 샘​​플을 혼합한다. 다음 샘플 당 5 ml의 PBS를 추가하고 와류 믹서를 사용하여 혼합, 60 초 동안 샘플을 품어.
    주의 : 샘플을 약 5까지 병렬로 제조 될 수있다. 샘플 순서 비교 배양 시간을 달성하기 위해 물 및 PBS를 첨가 동일하게 유지.
  3. PBS를 첨가한다 (단계 2.2)을 실온에서 6 분, 450 × g으로 원심 분리하여 모든 샘플에서 남은 그대로 펠렛 세포에 의한 등장 성 상태의 재생 후.
  4. 테이블 폐기물 빈으로 쏟아져하여 상층 액을 제거합니다. 원심 분리 튜브를 반전하고 종이 타월 위에 개방을 눌러 많은 액체를 가능한 한 제거합니다. 세포 펠렛은 가능한 한 건조되었는지 확인합니다.
  5. (단계 2.2) 이전에 설명 된대로 저장성 용해 절차를 반복합니다.
    엔OTE는 원칙적으로 본 저장성 용해 절차 얻어지는 혼합 백혈구 분획의 순도에 따라 두 번 이상 반복 될 수있다 (2.5-2.3이 단계). 두 용해가 혼합 얻어진 세포 분획에서 적혈구 잔존 주 단계 후에 약 25 %이다.
  6. 실온에서 6 분, 450 × g으로 원심 분리에 의해 나머지 본래 세포 펠렛. 뜨는 (단계 2.4 참조)를 제거합니다. 펠릿에 500 ㎕의 HBSS를 추가하고 균일 한 용액이 얻어 질 때까지 부드럽게 녹인다. 따라 표시 1.5 ml의 샘플 튜브에 각 샘플을 전송합니다.
  7. 실험에 따라서 직접 (유동 세포 계측법을 통해 예) 얻어진 샘플 25 (32) (단일 세포 유형의 식별을위한) 형광 표지 된 항체로 염색 분석 (세포 활성화 실험) 세포 자극으로 33 부화 또는 얼음 사용에 저장된 후에. 연구의 목적에 따라 즉시 후속 실험을 수행과립구 보낸 혼합 백혈구 분획은 약 20 시간의 매우 짧은 반감기를 갖는다.
    참고 :이 또한 아래에 설명 된 퍼 옥시 다제 활성 염색을 위해 보유하고있다.

3. 할로겐 퍼 옥시 다제 활동 염색

참고 : 혈액 유래 헴 퍼 옥시다아제 MPO 및 EPO에 의해 HOCl- 및 HOBr 생산 명명 된 hypohalous 산에 의해 형광에 산화 APF를 사용하여 정량한다. 형광 표지 된 항체와 세포 라벨링 APF 염색과 조합하여 수행되는 경우에 따라서, 형광의 발광 신호에 간섭을 피하기 형광체.

  1. 얼음에 4 ° C에서 APF 염색을 수행합니다.
  2. APF의 작동 용액을 제조하는 염료의 적절한 분액을 해동 (예, 10 μL, 11.81 mM)을하고 정확하게 일 밀리미터 (예를 들면, 10 μL에 108.1 μl의 완충액을 추가)하는 HBSS로 희석.
    1. 각 샘플 (500 ㎕의 세포 용액) 5 μ 준비설명 APF 작업 용액의 리​​터. 따라서, 118.1 μL APF 작업 용액 (1 ㎜)이 약 20 샘플을 준비하는 산출 APF (11.81 mM)을 하나 10 μL 나누어지는을 사용합니다. 때문에 피펫 동안 손실을 계산보다 약 10 % 더 APF 작업 솔루션을 준비합니다.
  3. 상기 APF 염색의 과산화 효소 특이성을 확인 헴 퍼 옥시 다제 억제제 4- 아미노 벤조산 히드라 지드 (4- ABAH) 35 제어 샘플을 준비하기 위해.
    1. 용매 500 μL에 756 mg의 4- ABAH 희석하여 디메틸 술폭 시드 4- ABAH (151.17 g / 몰) (DMSO)에 1 M 스톡 용액을 제조 하였다. 또한 HBSS에서 4 ABAH 1/10 희석.
  4. 각각 "70 mM의 H 2 O (2)"과 "7 mM의 H 2 O (2)"을 가진 H 2 O이 작동 용액 라벨 개의 1.5 mL의 원심 분리 튜브의 제조.
    1. "70 mM의 H 2 O 2"로 표시된 튜브에서 갓 10 μl를 희석약 88 mM의 농도를 얻기 위해 증류수 990 μL를 사용하여 H 2 O (2)의 30 % 스톡 용액 (8.8 mM)을 중. 얼음에 보관하고 4 시간 이내에 사용한다.
      참고 : H 2 O 2는 일반적으로 공급 업체에 의해 30 % 원액으로 전달된다. 4 ℃에서 저장 될 때, 그것은 약 3 년 동안 안정하다. 분해를 방지하기 위해 증류수에 H 2 O 2의 희석을 수행합니다. (2) H 2 O 희석은 0.1 M NaOH 용액에서 제조 될 수있다.
    2. 정확한 H를 결정하기위한 2 O 2 농도로 레이블 된 1.5 ㎖의 튜브에 증류수 900 ㎕를이 용액 100 μl를 첨가함으로써 처음으로 H 2 O 2 스톡 용액 (약 88 mm)를 추가로 1 ~ 10의 희석을 준비 "7mm의 H 2 O 2".
    3. (AN-UV 비스 photospectrometer를 사용하여 근거리 UV 범위 (예를 들면, 200 ~ 300 ㎚)에서의 스펙트럼을 기록하고 240 nm에서 흡광도를 사용49 240 = 34 M -1 cm-1)가 제 2 H 2 O 2 원액 (34)에 실제 H 2 O 2 농도를 결정한다. 기준 큐벳은 증류수가 들어 있는지 확인합니다. 측정에 사용하는 석영 큐벳을 위해 UV 영역에서 스펙트럼을 기록되어있다.
    4. 이 결과로부터 모두 H 2 O 2 스톡 용액의 정확한 농도를 계산한다. 증류수 적당량 첨가함으로써 "70mm의 H 2 O 2"샘플 튜브 정확히 70mm의 상기 제 원액의 농도를 조정한다. 얼음에 얻어진 작업 솔루션을 저장하고 1 시간 이내에 사용한다.
  5. 1 mm의 최종 농도에 해당하는 샘플 4 ABAH 작업 용액 (100 mM)을 5 μl를 추가합니다. APF 추가하기 전에 배양기에서 37 ° C에서 15 분 동안 샘플을 품어.
  6. 각 5 μL APF 작업 용액 (1 ㎜)를 추가500 ㎕의 샘플을 10 μM의 최종 염료 농도가 얻었다. (중간 설정에서 볼텍스 믹서를 사용하여, 예) 샘플을 부드럽게 혼합하고 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
  7. 700 μM의 최종 농도 각 500 μL 시료에 5 μL의 H 2 O 2 작동 용액 (70 mm)를 추가합니다. 부드럽게 샘플을 혼합하고 37 ℃에서 60 분 동안 그들을 품어. 병렬로 적절한 제어 측정을 수행한다.
    주 : 제어 측정은 700 μM H 2 O (2) 세포에 대한 독성이없는 것으로 나타났다. 도 현저한 세포 반응이 관찰되었다.
    주 : APF 염색 또한, H 2 O 2의 첨가를 생략 과학적 문제에 의존하여 수행 될 수있다. H (2) O (2)의 첨가는 세포에 의한 최대의 HOCl 및 HOBr 생산의 검출을 허용하면서 과산화수소가없는 경우에만 기저 염소 EPO 및 MPO 활성이 결정된다. 티그는 후자 상당히 높은 형광 신호를 의미한다.
  8. 세포 펠렛 들어 10 실온에서 분, 400 X g 위해 원심 분리. 철저하게 펠렛을 파괴하지 않고 뜨는을 제거하고 세포를 재현 탁 250 ㎕를 HBSS를 추가합니다.
    참고 : 샘플은 현재 25 유동 세포 계측법을 통해 분석을위한 준비가되어 있습니다.
  9. 표백을 피하기 위해 분석 될 때까지 어둠 속에서 샘플을 저장합니다. 480-490 nm에서 여기 후 약 525 nm의 37에서 형광의 방출을 감지합니다.

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결과

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이전에보고 된 바와 같이, 상술 한 방법은 인간 및 인간 이외의 물질 (32)에 모두 적용 가능한 것으로 밝혀졌다. 천식 증상이있는 쥐에 대해 표시 또한 같이 APF 염색은 전신 염증성 상태의 차이를 감지 할 수있는 적절한 도구가 될 수 있습니다. 따라서 우리는이 프로토콜을 사용하는 후속 연구에서 반복적으로 프리 스탄 유도 관절염 (PIA) 여성 다크 아구 티 쥐에서 MPO (및 EPO)의 할로겐 활동을 평가한다. 백혈구 보충 및 실험 동안 수행 염색의 대표적인 예는도 1에 도시되어있다. 약 200 μL 전혈 마취하에 동물의 구후 정맥총으로부터 얻은 헤파린 화 하였다. 적혈구 고갈 이후 APF 염색 100 μL 샘플 량을 사용하여 수행 하였다. 이후 시료를 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다.

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토론

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호중구를 인간 혈액에서 가장 풍부한 백혈구과 마찬가지로 퍼 옥시 다제 양성 세포의 분리는 종종 이러한 셀에 초점을 밀도 구배 원심 분리 (38)에 의해 다른 백혈구에서 호중구의 분리를 포함한다. 호중구는 훨씬 덜 풍부 뮤린 혈액 샘플에 대해서는 아직 후자보다 복잡한 방법 39 40을 사용한다. 또한 두 방법 모두는 또한 더 큰 혈액 볼륨의 필요성, 샘플에서 퍼 옥시 다제 양성 단핵 세포의 제거로 이어질하고 (예를 들어, 400 μL 41), 작은 실험 동물에서 재발 혈액 샘플링 동안 획득 마이크로 샘플에 적용되지 않습니다 (38, 40). 복막 삼출물에서 쥐의 호중구의 정제는 또한, 혈액 유래 과립구 (38, 40)을 생성하지 않고, 동물의 희생이 필요합니다. 최근 뮤린 BL로부터 고순도 과립구 획분을 얻기 위해 방법을 개발OOD (예를 들어, 항체의 응용)이다 종종 고가의 복잡...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 독일 연방 교육 연구부(BMBF, 1315883)의 자금 지원과 유럽 지역 개발 기금(ERDF)의 자금 지원을 100116526 Sächsische Aufbaubank(SAB) 프로젝트의 도움으로 가능했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
재료/장비
15 ml 원심분리 튜브VWR/Corning734-0451-1.5
ml 시료 튜브VWR/Eppendorf211-2130DE-
최대 5 ml 용량용Eppendorf예: , 3120000070당사는 1-10 µ 범위에서 부피를 조절할 수 있는 Eppendorf Resarch plus 피펫을 사용하고 있습니다. l, 10-100 &마이크로; l, 100-1,000 &마이크로; L 500-5,000 &마이크로; l
층류 벤치Thermo Electron CorperationHeraSafe
와류 믹서벤더 & Hobein AGVortex Genie 2-
탁상용 원심분리기Kendro Laboratory ProductsLaborfuge 400R원심분리기는 450 x g에서 사용할 수 있어야 합니다
소형 원심분리기Eppendorf5415D원심분리기는 400 x g에서 사용할 수 있어야 합니다
인큐베이터Heraeuscytoperm 2설정: 37 ° C, 95% 습도, 5% CO2 함량
UV-Vis 분광 광도계VarianCary 50 bio200 및 300nm 사이의 스펙트럼을 기록해야 합니다. 따라서 석영 큐벳을 적용해야
유세포 분석기Becton, Dickinson,BD, Facs, Calibur플루오레세인(예: , 488nm 아르곤 레이저)의 여기(excitation)에 적합한 레이저가 장착된 모든 유세포 분석기를 사용할 수 있습니다
NameCompany카탈로그 번호Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS)amrescoK812멸균 용액, 바로 사용 가능한
Phosphate buffered saline (PBS)200 ml 밀리포어 물에 용해하기 위한Sigma-AldrichP4417
Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)과 Ca2+Sigma-AldrichH1387970 mg/100 ml, 주의 깊게 확인하고 pH 값을 7.4
염산Merck Millipore1.09057.10001 M 용액
수산화나트륨Riedel-deHaë로 조정하십시오. n30620고체 펠릿. 1M 용액의 경우 4g/100ml Millipore 물
Aminophenyl fluoresceinCayman101575mg/ml 용액(11.81m)을 메틸 아세테이트, 부분 표본(<예: 100 µ)에서 해결합니다> 100 µ l) -20 °에서 준비하고 보관해야 합니다. C
과산화수소Sigma-AldrichH1009이 30% 원액은 약 8.8M의 농도에 해당합니다. 추가 희석액은 사용 직전에 증류수에서 신선하게 준비해야 하며 흡광도 측정으로 정량화해야 합니다
4-아미노벤조산 히드라지드(4-ABAH)시그마-알드리치A419091M의 첫 번째 원액은 DMSO에서 준비해야 하며, 두 번째 원액은 HBSS DMSO VWR 화학 물질에서 1:10 희석으로 100mM을 준비해야 합니다
23500.26-
. . 합니다: , , . 정제..

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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