HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 소형 RNA 치료제는 유전자 치료의 주요 후보 중 하나이며 HIV-1 감염에 대한 약물 치료제로 사용될 가능성이 있습니다. 통합 후 억제제에는 리보자임(ribozymes), 짧은 헤어핀(sh) RNA, 작은 간섭(si) RNA, U1 간섭(U1i) RNA 및 RNA 압타머가 포함됩니다. 이들 중 다수는 HIV-1 발현 플라스미드와 함께 일시적인 co-transfection assay를 사용하여 확인되었으며 일부는 임상 시험으로 진행되었습니다. 효능 측정 외에도 small RNA는 인간 RNA의 발현에 영향을 미치고, 세포 성장 및/또는 분화를 변경하고, 선천성 면역 반응을 유도할 수 있는 잠재력에 대해 평가되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜에서는 HIV-1 복제 주기에서 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하기 위해 고안된 일련의 일시적인 transfection assay가 설명됩니다. 당사는 이러한 분석을 사용하여 새로운 리보자임을 식별하고 HIV-1 RNA를 표적으로 하는 shRNA 및 siRNA의 형식을 최적화했습니다. 이 방법은 새로운 항 HIV-1 RNA를 스크리닝하는 데 유용하고 HIV-1 복제의 다른 통합 후 억제제를 스크리닝하는 데 적용할 수 있는 빠른 분석 세트를 제공합니다.
서론
현재 HIV-1 치료의 한계는 만성적 질환의 진행을 방지하기 위해 투여되어야한다는 것이다. HIV-1에 강한 T 림프구 또는 조혈 줄기 세포 이식, 약물 치료 -1,2-의 부재 HIV-1 복제의 장기간 제어를 제공하는 가능성을 가지며 또한 HIV-1 치료를 달성하기위한 효과적인 방법이 될 수있다 3. HIV-1 복제에 대해 내성 세포를 렌더링하기위한 한 가지 방법은자가 이식 동안 4 감염된 개인의 세포에 항 HIV-1 RNA를 또는 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 삽입하는 것이다. 여러 후보 항 HIV-1 유전자는 단일 유전자에 HIV-1의 저항 현상을 방지하기 위해, 두 개 또는 세 개의 5 (6)의 조합에 일부 진입하여 임상 시험을 고안 하였다.
항 HIV-1 RNA를 인해 면역 반응을 유도하는 그들의 낮은 전위로하고 있기 때문에 결합 유전자 치료에 대한 상위 후보자들이다매우 짧은 유전자 서열로부터 전사된다. 일부 항 HIV-1 RNA를이 바이러스 항목 및 통합을 목표로 설계되었습니다. 그러나, 대부분의 항 HIV-1 RNA를는 바이러스 라이프 사이클 후 통합 단계 (도 1)을 대상. 후 통합 억제제....
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프로토콜
1. 세포와 형질
- 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 HEK 293T 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 세포 배양 배지에서 2 × 105 세포 / ㎖ 현탁액을 준비한다. 의 각 웰에 세포 현탁액의 500, 100 및 1,000 μl를 추가, 24도, 96도, 12 웰 플레이트, 바이러스 생산, 세포 생존 및 면역 활성 분석, 각각 (그림 2A)합니다.
- 부드럽게 플레이트 소용돌이와 5 % CO 2와 37 ° C에서 / O N 그들을 품어. 50~70%의 포화 상태로 세포를 성장.
- 형질 전환 계획에 따르면, 1.5 ml의 마이크로 튜브 (예, 그림 2B)에 테스트 RNA를 자신의 컨트롤의 희석을 준비합니다.
- 바이러스 생산 분석를 들어, HIV-1 발현 플라스미드의 10 NG / μL 희석을 준비하고 각 튜브에 10 μl를 추가합니다. 다음 5 μM 시험의 RNA 희석하여 음성 대조군 RN 준비A. 25 또는 100 nM의 최종 농도에 해당하는 튜브에 각 시험 RNA 및 음성 대조군 희석 2.5 또는 10 μl를 추가합니다.
- C : 세포 생....
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결과
절차의 일반적인 개략도 세 시험 RNA를도 2b에 제공되는 제어 RNA위한 예시 형질 계획도 2에 도시되어있다. 바이러스 생산 및 세포 생존 분석을 위해 각 테스트 구조에 대한 판독은 음성 대조군으로 정규화된다. 각 시험 RNA가 인접 대조군에 정상화되도록 복제가 세트로 형질 감염된다. 이것은 예를 들어, 음성 대조군 모두 제 형질, 경우 발생할 수 착화 및 형질 전환 사이의 시간과 관련된 부정확 한 데이터를 피하기 위해 수행된다. HIV-1 면역 반응 27,28 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 생존 및 면역 활성화 검정법은 HIV-1 발현 플라스미드의 첨가없이 수행된다.
HIV-1 RNA의 보존 위치 (위치 1498년에서 1415년까지 타겟팅 간섭 RNA 분자의 최적의 길.......
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토론
기재된 HIV-1 생산 분석법 HEK293T 셀들 (도 2)를 이용하여 수행하고, 효과적인 리보 자임 (13) shRNA를 10,29, siRNA를 30 및 U1i RNA 11,31 표적 부위를 HIV-1 RNA를 선별하는 데 사용되는 분석 비슷 하였다. HIV-1 생성을 정량화하기 위해 다양한 방법을 사용하여, 대부분의 연구는 후보의 RNA와 HIV-1 발현 플라스미드의 공동 형질 감염 후 바이러스 생산을 48 시간으로 측정했다. HIV-1의 제조 이후, 미성숙 비리 새로운 세포를 감염시킬 성숙한 비리,되기 위해 HIV-1 프로테아제하여 polyproteins의 단백질 분해 절단을 겪는다. 단계 2.2에 기재된 HIV-1 RT 효소 활성 분석 용. 역전사 효소 성숙 비리 만 활성화되어 있기 때문에 2.5., 생산과 성숙의 단계를 모두 평가된다. 반대로, 캡시드 단백질 및 바이러스 RNA 모두 성숙 및 미성숙 비리에 존.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
여기에 제시된 작품은 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다 (DCB-120266, PPP-133377와 AG에 HBF-348967을 부여).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM HyClone | GE 헬스케어 | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE 헬스케어 | SH30396.03 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| 세포 배양 플레이트, 96 웰, 24 웰, 6 웰. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| 저분자량 Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | 합성 RNA용 transfection 시약 |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | RNA 발현 플라스미드용 transfection 시약 |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA 프라이머 | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat 종이 | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate 섬광 계수기 | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate 분광 광도계 | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford 시약 | Bio-rad | 500-0006 | |
| 겔 러닝 챔버 | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| 항체 스트리핑 솔루션 | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | ||
| PI32106 Dr. B.L. Bass | ADAR1 항체 | ||
| phospho-T446-PKR 항체 | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 항체 | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR 항체 | Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 항체 | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin 항체 | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled 염소 anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | 시그마-알드리치 | 6226-79-5 |
참고문헌
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
- Allers, K., et al....
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재인쇄 및 허가
