다음 프로토콜은 분리된 작동 랫드 심장에서 포도당 및 지방산 산화 속도의 정량적 측정을 위한 완충액의 준비 및 활용을 설명합니다. 샘플 분석 및 데이터 해석에 사용되는 방법도 논의됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 마음은 ATP의 주요 소비자이며, 수축의 에너지 기판의 지속적인 공급이 필요합니다. 당연히 심근 대사의 변화가 수축 부전 심부전의 개발과 연결되어있다. 따라서, 신진 대사 및 수축 사이의 링크를 푸는 것은 질병 상태에서 심장 적응 또는 부적응을 지배하는 메커니즘의 일부에 빛을 흘렸다한다. 분리 된 래트 심장 작동 준비를 동시에 실시간 심장 수축 기능 및 산화 적 대사 경로에 기판을 제공하는 에너지의 흐름에 따라 사용될 수있다. 본 프로토콜은 포도당 지방산, 심장의 기판을 제공하는 주된 에너지 산화 비율의 정량적 측정을 위해 버퍼의 제조 및 이용에 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공하는 것을 목적으로한다. 시료 분석 및 데이터 해석에 사용되는 방법에 대해서도 설명합니다.간단히 말해서,이 기술은 정상 체온 결정질 관류 통해 생체 심장 박동로 (14)의 공급 C- 방사성 포도당과 3 H- 방사성 장쇄 지방산에 기초한다. 14 CO 2, 3 H 2 O, 최종 부산물 이러한 에너지 제공 기판의 사용에 관여하는 효소 반응은 다음 정량적 관상 동맥 유출 물로부터 회수된다. 사용되는 방사성 표지 된 기질의 특정 활성의 기술로, 개별적으로 산화 경로에 포도당과 지방산의 광속을 정량하는 것이 가능하다. 분리 된 심장의 수축 기능은 해당 기록 장치와 병렬로 결정될 직접 대사 플럭스 값과 상관 될 수있다. 이 기술은 사전에로드 및 국소 빈혈, 약물 또는 circula 후 변경 등 다양한 스트레스 조건에 대한 응답으로 대사 / 수축 관계를 연구하는 것이 매우 유용하다유전자 산물의 발현의 변화 다음 팅 계수 나.
서론
임상 관련성
포유 동물의 심장에서 산화 적 대사 경로, ATP 생성과 심장 작품 (1)을 통해 기판의 플럭스 사이에 강한 긍정적 인 관계가있다. 지난 20 년 동안 심장 대사와 기능 사이의 복잡한 링크의 조사는 심장 대사의 변화는 심장 질환 2-4의 다른 유형의 설정에서 수축 기능 장애 가능성이 병리학 적 구조 리모델링에 대한 원인을 인식하게되었다. 따라서, 스트레인 된 심장의 대사 리모델링을 관리하는 메커니즘에 대한 이해 심부전 5-7의 예방 또는 치료를위한 치료 표적의 확인을 초래할 것으로 예상된다. "심장 대사의 평가"에 미국 심장 협회에서 과학적 진술의 최근 간행물은 t에 대한 과학계의 관심이 점점 강조연구 (8) 자신의 분야. 심장 이미징 기술의 진보는 이제 심장 형태와 기능의 신속하고 정확한 평가를 허용 반면, 심장 대사의 생체 내 연구는 제한적이고 부담이 남아있다 : 핵 자기 공명 (NMR) 분광법과 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상 수 생체 외 날짜 .TO 정상 상태 조건에서 산화 대사에 대한 다양한 기판 기여 9 판별 심장 고 에너지 인산 대사 크렙스 회로 활동을 수행하는데 사용될 수 있지....
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프로토콜
참고 : 모든 동물의 절차는 인간의 관리 및 동물의 사용에 대한 NIH 보건 서비스 정책에 따라 수행하고 미시시피 의료 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 방사성 동위 원소의 사용을 포함하는 모든 절차는 미시시피 의료원 대학의 방사선 안전 사무실 정한 가이드 라인에 따라 승인 하였다.
주식 버퍼 솔루션 및 시약 1. 준비
- 크렙스 - Henseleit (KH) 버퍼 스톡 솔루션
- (몰 / L)에 포함 된 20 배 농축 된 소금 원액의 2 L 2.37 염화나트륨, 0.0948의 KCl, 0.0236 KH 2 PO 4, 0.0236 황산 4 * 7H 2 O 준비 가입은 1 개월 동안 실온에서 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터 유닛 저장 필터링.
- 의 NaHCO3의 20 배 농축 (0.5 몰 / L) 용액 2 L를 준비합니다. 이 용액이 될 수있다무기한 실온에서 저장된다.
- 염화칼슘 (2)의 1 몰 / L 원액 250 ml의를 준비합니다. 가입은 1 개월 동안 실온에서 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터 유닛 저장 필터링.
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결과
두 대표 실험은 아래 그림에 설명되어 있습니다. 두 경우 모두, 16 주령의 수컷 스프 라그 돌리 래트의 심장을 분리하고, 선행하는 프로토콜에 따라 제조 KH 완충액 작업 모드 관류. 각 실험에서, 심장 심장 작업에 영향을 미치는 응력 상태로 하였다. 심장 수축 기능 대동맥 라인의 압력 센서의 삽입을 통해 심장의 전력 측정하여 맥압의 연속 촬영에 의해 평가 하였다. 에너지 제공 기판의 사용의 각 스트레스 조건의 결과를 동시에 포도당과 올레산의 산화 속도를 측정함으로써 결정 하였다.
첫 번째 실험에서, 부하의 급성 증가가 40 %로 후 부하를 증가시킴으로써 거의 생리 부하에서 20 분 재관류 후 모의 하였다 (수동에 의해 달성대동맥 오버 플로우 챔버를 상승) 및 재관류 버퍼 (그림 3A)에 에피네프린 (1 μmol / L)을 추가하.......
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토론
위의 프로토콜을 동시에 분리 작업 쥐 심장 글루코스 산화 및 지방산 산화를 통해 기판의 광속을 정량화하는 방법을 자세히. 측정은 (... 등의 부하 변화, 허혈 재관류) 기준선 스트레스 조건 하에서 기판 대사 심장 워크 간의 관계를 결정하기 위해 기록 된 심장 기능 파라미터에 중첩 될 수있다. 이는 대사 / 수축 관계 심부전 및 당뇨병과 같은 기존의 상태에 의해 영향을받는 방법을 평가하는 것도 가능하다. 또한, 유전자 변형 된 쥐의 심장 심장 대사와 기능의 특정 단백질의 효과를 심문하는 데 사용될 수있다. 최근, 이들 매개 변수에 대한 다른 약물과 순환 요인의 영향이 개별적으로 시험 될 수있다. 당분 통한 글루코스의 흐름은 항상 글루코스 산화의 속도와 상관 관계가 없기 때문에, 그것은 수있다 인포하나의 실험 설정에서 두 경로를 통해 포도당 플럭스의 속도를 따라 포지티브,.
3 H 2 O의 방출은 해당 작용 (20.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 National Institutes of Health Grants R00 HL112952(to R. H.), R01 HL108618(to J.P.G.), P01 HL051971 및 P20 GM104357의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 염화나트륨(NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| 염화칼륨(KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| 인산칼륨 일염기성(KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| 황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| 중탄산나트륨(NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| 염화칼슘(CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 수지, 염화물 형태, 100 - 200 건조 메쉬 크기, 500g | Bio-Rad | 1401441 | 이 제품은 직접 하이드옥사이드 형태로 교체하실 수 있습니다 (아래 참조 참조) 그러나 이것은 거의 8 배 더 많은 비용이 듭니다 |
| AG 1-X8 수지, 수산화물 형태, 100-200 건조 메쉬 크기, 100g | Bio-Rad | 1432445 | 이 항목을 구입하면 음이온 교환 수지를 염화물 형태에서 수산화물 형태로 변환하는 것을 건너 뛸 수 있습니다 (프로토콜의 섹션 1.2 참조) |
| 유리 미세 분석 진공 필터 홀더 | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| 수산화 나트륨 (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | 부식성. 적절한 취급 및 보관에 대해서는 제품 MSDS를 참조하십시오. |
| 프릿 실린더 | 피셔 사이언티픽 | 11-138B | |
| Probumin 소 혈청 알부민 지방산 프리, 분말 | EMD Millipore | 820027 | 차가운 에탄올 분별과 같은 다른 정제 공정은 심장에 유독한 잔류물을 남길 수 있으므로 숯 탈지 BSA의 사용을 권장합니다. |
| 올레산나트륨 | 시그마-알드리치 | O7501 | |
| 올레산, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | 방사성 물질. 주문 및 취급에 대한 기관의 방사선 안전 사무소 지침을 따르십시오. |
| 투석 멤브레인 튜브, 직경 29mm | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-포도 | 시그마-알드리치 | G7021 | |
| 포도당, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | 방사성 물질. 주문 및 취급에 대한 기관의 방사선 안전 사무소 지침을 따르십시오. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | 독성이 강하고 심각한 화상을 유발합니다. 적절한 취급 및 보관을 위해 MSDS 제품을 참조하십시오. |
| 20ml 유리 섬광 바이알 | Fisher Scientific | 03-341-25E | 14CO2 |
| 20ml HDPE 섬광 바이알 | Fisher Scientific | 03-337-23B | 3H2O Red의 정량 회수를 위해 HDPE 바이알을 사용하십시오 |
| 고무 슬리브 스토퍼 | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL 섬광 바이알; 재사용 가능한 |
| BD PrecisionGlide 바늘 23G x 40mm | BD | 305194 | CO2 트랩 과염소산의 고무 슬리브 스토퍼를 통해 과염소산을 주입하는 데 사용 |
| , 60% | Fisher Scientific | A228 | 부식성이 높으며 산화제 및/또는 폭발 위험을 유발할 수 있습니다. 적절한 취급 및 보관을 위해 제품 MSDS를 참조하십시오 |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | 유리 제품, 플라스틱 부품 및 튜브 청소용 |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | 지방산-BSA 잔류물로 오염된 "손이 닿기 어려운" 표면(튜브, 유리 제품) 청소용 |
참고문헌
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signalin....
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