방법 논문

격리 된 작업 쥐의 심장에서 포도당과 지방산 산화의 가격의 결정 방법

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DOI:

10.3791/54497

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2016년 9월 28일

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

이 논문에서

요약

다음 프로토콜은 분리된 작동 랫드 심장에서 포도당 및 지방산 산화 속도의 정량적 측정을 위한 완충액의 준비 및 활용을 설명합니다. 샘플 분석 및 데이터 해석에 사용되는 방법도 논의됩니다.

초록

포유류 마음은 ATP의 주요 소비자이며, 수축의 에너지 기판의 지속적인 공급이 필요합니다. 당연히 심근 대사의 변화가 수축 부전 심부전의 개발과 연결되어있다. 따라서, 신진 대사 및 수축 사이의 링크를 푸는 것은 질병 상태에서 심장 적응 또는 부적응을 지배하는 메커니즘의 일부에 빛을 흘렸다한다. 분리 된 래트 심장 작동 준비를 동시에 실시간 심장 수축 기능 및 산화 적 대사 경로에 기판을 제공하는 에너지의 흐름에 따라 사용될 수있다. 본 프로토콜은 포도당 지방산, 심장의 기판을 제공하는 주된 에너지 산화 비율의 정량적 측정을 위해 버퍼의 제조 및 이용에 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공하는 것을 목적으로한다. 시료 분석 및 데이터 해석에 사용되는 방법에 대해서도 설명합니다.간단히 말해서,이 기술은 정상 체온 결정질 관류 통해 생체 심장 박동로 (14)의 공급 C- 방사성 포도당과 3 H- 방사성 장쇄 지방산에 기초한다. 14 CO 2, 3 H 2 O, 최종 부산물 이러한 에너지 제공 기판의 사용에 관여하는 효소 반응은 다음 정량적 관상 동맥 유출 물로부터 회수된다. 사용되는 방사성 표지 된 기질의 특정 활성의 기술로, 개별적으로 산화 경로에 포도당과 지방산의 광속을 정량하는 것이 가능하다. 분리 된 심장의 수축 기능은 해당 기록 장치와 병렬로 결정될 직접 대사 플럭스 값과 상관 될 수있다. 이 기술은 사전에로드 및 국소 빈혈, 약물 또는 circula 후 변경 등 다양한 스트레스 조건에 대한 응답으로 대사 / 수축 관계를 연구하는 것이 매우 유용하다유전자 산물의 발현의 변화 다음 팅 계수 나.

서론

임상 관련성

포유 동물의 심장에서 산화 적 대사 경로, ATP 생성과 심장 작품 (1)을 통해 기판의 플럭스 사이에 강한 긍정적 인 관계가있다. 지난 20 년 동안 심장 대사와 기능 사이의 복잡한 링크의 조사는 심장 대사의 변화는 심장 질환 2-4의 다른 유형의 설정에서 수축 기능 장애 가능성이 병리학 적 구조 리모델링에 대한 원인을 인식하게되었다. 따라서, 스트레인 된 심장의 대사 리모델링을 관리하는 메커니즘에 대한 이해 심부전 5-7의 예방 또는 치료를위한 치료 표적의 확인을 초래할 것으로 예상된다. "심장 대사의 평가"에 미국 심장 협회에서 과학적 진술의 최근 간행물은 t에 대한 과학계의 관심이 점점 강조연구 (8) 자신의 분야. 심장 이미징 기술의 진보는 이제 심장 형태와 기능의 신속하고 정확한 평가를 허용 반면, 심장 대사의 생체 내 연구는 제한적이고 부담이 남아있다 : 핵 자기 공명 (NMR) 분광법과 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상 수 생체 외 날짜 .TO 정상 상태 조건에서 산화 대사에 대한 다양한 기판 기여 9 판별 심장 고 에너지 인산 대사 크렙스 회로 활동을 수행하는데 사용될 수 있지만, 이러한 기술들은 높은 운영 비용으로 자신의 무능력 퍼진 마음의 준비 작업을 동시에 실시간으로, 산화 적 대사 경로 7,9에 수축 기능과 기판의 플럭스에서 공부하는 유일하고 독특한 기술을 사용할 나타냅니다. 다음 프로토콜 래트를 결정하는데 사용될 시약의 제조 및 이용의 지침을 제공하는 것이다격리 된 작업 쥐의 심장에 기판 활용 말이지.

격리 된 작업 쥐 심장 장치

기술은 반세기 이전이지만, 분리 작업 쥐 심장 제제는 심혈관 연구를 선택하는 방법을 남아있다. 랑겐 돌프 심장 제조와 마찬가지로 작용 쥐 심장 신경 호르몬 다른 장기와 다른 순환 계수의 교란 효과는 독립적으로 심장의 다양한 파라미터를 측정 할 수있는 비교적 간단한 신뢰성 있고 저렴한 방법을 제공한다. 그러나 랑겐 돌프 - 관류 마음 대조적으로, 작업 심장에 가까운 생리 심장 연구, 생체 조건에 관련이있는 수준으로 산화 대사 플럭스의 생성을위한 전제 조건을 수행하고 있습니다. 이것은 좌심방 접속 캐뉼라를 통해 좌심실 (LV)로 관류 버퍼를 제공함으로써 달성되고 LV는 채우고 계약으로되어버퍼가 결정된 후 부하 수압에 대한 대동맥 라인을 통해 배출됩니다. 원래 10 이후 Taegtmeyer, HEMS와 크렙스 (11)에 의해 개선 되었으나 닐리와 동료에 의해 기술 된 관류 장치의 디자인은 이후 약간 변경되었습니다. 원래 장치에서 설명한 바와 같이, 수축 기능은 대동맥 측정하기 위해 더 이상 메스 실린더 및 스톱워치를 사용하지 않고, 심 박출량의 측정을 통해 평가 될 수 있고, 관상 동맥은 10, 11을 흐른다. 여러 벤더가 완료 작업 쥐 심장 관류 시스템을 제공합니다. 이들 시판되는 장치 flowprobes, 압력 센서, 압력 볼륨 카테터와 심장 기능의 데이터 수집과 분석에 필요한 모든 장비를 얻을 수있다. 공급 업체는 장비와 새로운 사용자 익숙해 광범위한 문서 및 교육 세션을 제공합니다. 작업 심장기구도에 여러 또한 리뷰 기사 상세 프로토콜[슬라이드 쇼와 카테터의 사용에 설치류 12-15에서 심장 기능을 측정합니다. 이러한 이유로, 우리는 잠시 관류 장치 및 기록 장치의 설정을 언급한다. 본 프로토콜은 다소 동시에 포도당과 장쇄 지방산 산화의 속도는 정상적인 심장의 두 가지 에너지를 제공하는 기판을 측정하도록 구현 될 수있는 방법에 대한 설명과 함께 이미 이용 가능한 정보를 보완하는 것이다. 우리는 데이터 분석 샘플의 회수 및 처리 시약 및 버퍼의 제조에서, 심근 산화 대사 평가 방사성 에너지 기판의 사용에 관련된 현재의 모든 단계를 설명한다.

이 방법의 원리

심근 (glucos를 지방산 (주로 장쇄 지방산)과 탄수화물의 산화 적 인산화의 수축 에너지의 대부분을 생성전자 및 락 테이트). 심장은 매우 정력 보유 제한 및 순환에서 이러한 에너지 제공 기판의 지속적인 공급에 의존하고있다. 당분 경로를 통한 글루코오스의 이화는 미토콘드리아 내막의 피루 베이트 탈수소 효소 복합체에 의해 탈 카복실 화되는 피루브산을 산출한다. 알부민 또는 지단백질 순환하는 트리글리세리드에서 추출한 장쇄 지방산은 제 세포질에서 아실 CoA를 분자로 활성화되고,이어서 베타 산화 경로를 입력 카르니틴 셔틀 통하여 미토콘드리아 기질 내부에 반송된다. 포도당 지방산의 분해 작용에 의해 생성 된 아세틸 -CoA 분자 미토콘드리아 내막을 가로 질러 양성자 원동력을 구축하는 전자 전달계에 사용되는 환원 등가물 (NADH와 FADH 2)를 생성하는 크렙스 회로 연료 및 ATP에 합성 효소의 활동을 통해 ATP를 생성합니다. 물과 이산화탄소의 단부 부산물이다크렙스 사이클 내에서 일어나는 효소 반응. 14 C- 3 H- 방사성 표지 된 기질의 공급은 절연 작업 심장 (예 : C-14 방사성 표지 된 글루코스, 3 H-방사성 올레산) 따라서 14 CO 2, 3 H 2 O의 생산을 유도 할 수있다 정량적 관상 동맥 유출 물로부터 회복 될 수있다. 14 CO 2의 컬렉션은 밀폐 챔버에 격리 관류 심장을 유지하여 그것을 중심을 빠져 나올 때 바로 관상 동맥 유출 물을 회수하여 실시된다. 작은 음이온 교환 컬럼 분리하여 관상 동맥 유출 물로부터 3 H 2 O를 복구하기 위해 사용된다. 처리 된 샘플의 방사능을 액체 섬광 계수기로 측정 한 결과, 사용 된 방사성 표지 된 기질의 특정 활성의 기술로, 개별적으로 포도당과 지방산의 광속을 정량하는 것이 가능하다산화는 16, 17을 경로.

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프로토콜

참고 : 모든 동물의 절차는 인간의 관리 및 동물의 사용에 대한 NIH 보건 서비스 정책에 따라 수행하고 미시시피 의료 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 방사성 동위 원소의 사용을 포함하는 모든 절차는 미시시피 의료원 대학의 방사선 안전 사무실 정한 가이드 라인에 따라 승인 하였다.

주식 버퍼 솔루션 및 시약 1. 준비

  1. 크렙스 - Henseleit (KH) 버퍼 스톡 솔루션
    1. (몰 / L)에 포함 된 20 배 농축 된 소금 원액의 2 L 2.37 염화나트륨, 0.0948의 KCl, 0.0236 KH 2 PO 4, 0.0236 황산 4 * 7H 2 O 준비 가입은 1 개월 동안 실온에서 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터 유닛 저장 필터링.
    2. 의 NaHCO3의 20 배 농축 (0.5 몰 / L) 용액 2 L를 준비합니다. 이 용액이 될 수있다무기한 실온에서 저장된다.
    3. 염화칼슘 (2)의 1 몰 / L 원액 250 ml의를 준비합니다. 가입은 1 개월 동안 실온에서 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터 유닛 저장 필터링.
  2. 염화물 형태의 수산화 양식에 음이온 교환 수지의 전환
    1. 1 L의 초순수 물에 재현 탁하여, 음이온 교환 수지를 세척 하였다. 수지가 정착 여분의 물을 부어 할 수 있습니다. 이 단계를 4 번 이상 반복합니다.
    2. 여과 플라스크에 장착 된 유리 미량 진공 필터 홀더에 수지를 부어.
    3. 천천히 1 N의 NaOH (22) 양을 통과하여 수산화 형태로 수지를 변환합니다. 스테인레스 강 주걱으로 간헐적 슬러리를 섞는다.
    4. pH가 아래 9.0 떨어질 때까지 초순수로 수지를 씻으십시오. 수지 슬러리의 표면 근처의 pH 테스트 스트립을 찍기에 의해 정기적으로 pH를 확인합니다. 커버 및 보에 초순수 수지 저장rosilicate 유리 병 및 빛으로부터 보호합니다. 수지가 사용하기 전에 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
      참고 : 제대로 저장 될 때, 수지가 3 개월 이상 지속됩니다.
  3. 올레산 - 알부민 8 배 농축 원액
    1. 4 L 삼각 플라스크에서, 20 배 농축 염 스톡 용액 200 ㎖와 3.6 L의 초순수로 20 배 농축 된 NaHCO3 용액 200 ㎖를 혼합한다.
    2. 융해 실린더 기체 분산 튜브를 이용하여, 이산화탄소 5 %의 산소 pH를 안정화하기 위해 95 %의 혼합물로 15 분 동안 용액을 기체.
    3. 470 ml를 1 L 유리 비커에 붓고 버퍼. 4 L 삼각 플라스크에 잔존하는 3530 ml의 완충액에 1 몰 / L CaCl2를 원액 8.75 mL 및 추가 세트는 제외.
    4. 용해 될 때까지 교반 막대 1 L의 유리 비커에 지방산 무료 BSA 40 g을 넣고 저어.
    5. (: V V) 초순수의 에탄올 용액 15 mL를 원뿔형 튜브 내에, 50 % 4 mL로 제조. 487 mg을 sodiu 추가분말까지 m 올레산 및 와류가 완전히 용해시킨다.
      참고 : 일부 연구자는 재관류 버퍼에 팔 미트 산 대신 올레산을 사용합니다. 팔 미트 산, 알부민 원액과 동일한 절차에 따라 제조 될 수있다. 그러나, 소듐 팔미 테이트의 완전한 용해를 달성하기 위해 70 ºC의 용액을 가온 권장한다.
    6. 일정하게 교반 지방산 무료 BSA 용액에 올 레이트 솔루션 적가을 추가하고 형성하는 올레산-BSA 단지 10 이상 분을 기다립니다.
      참고 :이 솔루션은 밝은 노란색이 눈에 보이는 입자의 결여해야한다. 침전물 또는 불용성 입자의 존재는 BSA에 지방산의 불완전 결합을 나타낼 수있다. 이 경우, 용액을 폐기하고, 처리는 반복을 시작한다.
      주 : 피펫에 방치되어 적가 될 수 없다면 팔미 침전된다. BSA의 교반 용액 bindin 촉진하기 위해 37 ºC에서 따뜻하게 할 수있다팔 미트 산의 g. BSA의 변성과 응집되는 원인이 과열하지 마십시오.
      주의 :이 프로토콜의 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 방사선 안전 사무실에서 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 따릅니다.
    7. 올레산-BSA의 교반 용액에 160 μL (0.8 MCI) [9,10- 3 H] 올레인산을 첨가하고 추가로 10 분 동안 교반 하였다.
    8. 올레산-BSA의 교반 용액에 1 몰 / L 염화칼슘이 원액의 2.5 ML을 추가합니다.
    9. 약 1.2 m 투석막 튜브를 잘라 내부와 외부 수돗물로 모두 씻어. 10 ~ 15 분 멤브레인의 글리세롤 코팅을 제거하는 수돗물에서 적극적으로 투석 튜브를 닦습니다. 또한, 사용하기 전에 1 시간 동안 따뜻한 물에 투석 튜브를 담가 코팅을 제거합니다. 초순수 물 공급과 투석 튜브를 세척하여 마무리아르 자형.
    10. 안전하게 투석 튜브의 한쪽 끝을 묶어. 올레산-BSA 용액을 채우고 투석 튜브의 다른 쪽 끝을 묶어.
    11. KH 버퍼의 4 L 삼각 플라스크에 가득 투석 튜브를 넣고 교반 막대와 부드러운 교반하면서 4 ºC에서 하룻밤 투석 수 있습니다.
    12. 다음 날, 투석 튜브의 8 배 농축 올레산-BSA 솔루션을 제거합니다. -20 ºC에서 관류 또는 나누어지는 및 저장에 대한 즉시 올레산-BSA 솔루션을 사용합니다. 냉동 된 분취 량을 최소 2 개월 동안 안정하다. 이것은 올레산-BSA 복합체의 용해도를 손상시킬 수 있으므로 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오.
      참고 만 사용 초순수 (25 ºC 18.2 MΩ.cm의 저항률 총 유기 탄소 <10 ppb의 미생물 ≤ 1 CFU / ㎖, 0.22 μm의 ≤1 / ㎖ 이상 크기의 미립자) 시약 및 버퍼를 준비 심장 관류에 사용됩니다. 그 클로라이드 음이온 교환 수지의 전환수산화물 형태 m은 추가 비용 수산화물 형태의 직접 구매함으로써 회피 할 수있다 (재료 표 참조). 올레산 또는 팔미 외에, 천연 지방산의 다른 유형은 또한 지방산의 삼중 버전의 산화를 수행하는 데 사용할 수만큼 사용될 수있다.

관류 버퍼 2. 준비

  1. 4 L 삼각 플라스크에서, 20 배 농축 염 스톡 용액 200 ㎖와 3.6 L의 초순수로 20 배 농축 된 NaHCO3 용액 200 ㎖를 혼합한다. 이산화탄소 5 %, 산소 95 %의 혼합물로 15 분 동안 용액을 가스 후 2.5 밀리몰 / L에서 자유 칼슘의 농도를 설정하기 위해 1 몰 / L CaCl2를 스톡 용액 10 ㎖를 추가한다.
    주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 가시가 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 준수diation 안전 사무실.
  2. 2 L 붕규산 유리 병에 1.750 L KH 버퍼를 전송합니다. 8 배속 250㎖를 올레산-BSA 용액 1.802 g D- 글루코스 0.4 U / ㎖에서 400 ㎕의 인슐린, 200 μL (0.2 MCI) [U- 14 C] 포도당을 추가 농축시켰다. 혼합 병을 반전. 이것은 올레산 (0.4 밀리몰 / L), D- 글루코오스 (5 밀리몰 / L), 및 인슐린 (40 μU / ㎖)를 함유하는 완전한 관류 완충액 2 L를 줄 것이다.
    참고 : 2 L의 볼륨이 적어도 60 분 동안 비 순환 조건에서 작업 성인 쥐의 심장을 관류하기에 충분하다.
  3. 두 절개 요리를 채우기 위해 비 방사성 KH 버퍼의 일부를 사용하여 냉각 얼음 위에 놓는다.

관류 장치 3. 준비

주 : 조사는 Taegtmeyer, HEMS와 크렙스 (11), 또는 상업적으로 사용 가능한 시스템 중 하나에 의해 설명 된 것과 같은 맞춤형 관류 장치를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 관류 시스템은 통상적으로 구성되는아래 그림 1에서 설명하는 요소. 튜브와 유리 외에, 기록 장치의 나머지는 선택적이며 실험 문제를 해결하기 위해 연구자의 필요에 따라 달라진다 그 활용이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 우리는 상기 버퍼에 진입 O 2 농도를 측정하는 산소 미소 전극의 사용을 권장하고 관상 동맥 (도 1)을 종료. 이것은 심장 산소를 적절한 양으로 공급된다 연구자 제어 도울 것이며, 산소 공급 실험 사이에서 변화하지 않음. 또한, "동정맥"산소 차의 결정은, 심근 산소 소비량 (16, 18) 및 심근 효율을 계산하는데 사용될 수있다.

  1. 순환 수조를 켜고 관류 장치를 예열 37 ºC에서 설정합니다.
  2. 컴퓨터와 의지 데이터 수집 시스템을 켭니다심장 기능을 측정 할.
  3. 데이터 수집 시스템의 기록 장치 (압력 카테터 압력 볼륨 카테터, 산소 마이크로 전극, 유량계 등)를 연결하고, 제조자의 지시에 따라 상품의 캘리브레이션을 수행한다.
  4. 초순수와 버퍼 탱크를 채우십시오. 연동 펌프를 켜고 모든 튜브를 통해 물을 세척 시스템을 씻어 유리 제품. 연동 펌프의 전원을 끄고이 같은 튜브 및 / 또는 유리에 물 숙박이 관류 버퍼와 심장 준비의 농도에 영향을 미칠 수 없다 있는지 확인합니다.
  5. 시스템에 새로운 1.0 ㎛의 유리 섬유 필터를 연결한다. 산소화 챔버 이산화탄소 5 %의 산소 및 95 %의 혼합물을 포함하는 연료 탱크를 연결한다.
    주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관에 의해 설정된 안전성과 폐기물 처리 규정을 준수의 방사선 안전 사무실.
  6. 관류 버퍼와 버퍼 탱크를 채우십시오. 펌프를 켜고 관류 버퍼 모든 튜브와 유리의 충전을 보장합니다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 재관류 재순환 모드에서 장치와 네이트 통해 관류 완충액을 실행.
  7. 단단히 관상 유출 물을 복구하기 위해 심장 챔버 아래 20 ML의 주사기의 튜브를 연결합니다. 세 방향 코크의 상부에 주사기의 끝 부분을 연결한다. 3 ML의 주사기에 사이드 암을 연결합니다. 액체 방사성 폐기물 컨테이너에 튜브를 통해 아래 팔을 연결합니다.
    주 : 지방산-BSA 착체를 사용하는 경우에는 용액의 과도한 발포를 일으킬 것 같은 관류 완충액 산소는 기체 분산 튜브를 직접 버블 링을 실시 할 수 없다. 막 형산 (그림 1) 또는 목적으로 시트 흐름 산소화 챔버를 사용합니다. 매우 적절한 수준의 O를 확인하는 것이 좋습니다F 산소를 관류 회로 (도 1)의 산소 미세 전극을 배치하여 도달된다.

4. 쥐의 심장 절연 및 캐 뉼러

  1. 규모에 쥐 무게.
  2. 150 mg을 마취제 투여 주사기를 준비 / thiobutabarbital 나트륨 염 수화물 200 USP 단위 헤파린 투베르쿨린 주사기 kg이다.
  3. thiobutabarbital IP를 주입하고 의식을 잃고 동물 기다립니다. 이 실험의 목적을 방해하지 않을 같은 다른 유도 화제는 (아래의 설명 부분에서 마취제 선택 참조)만큼 사용될 수있다.
  4. 발가락 핀치 반사의 부족을 확인하여 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 동물이 절차를 수행하는 동안 통증을 느끼지 않는 것을 보장하기 위해 마취의 적절한 깊이를 유지해야합니다.
  5. 쥐가 완전히 의식이 운영 테이블 및 초에 그 뒷면에 배치, 발가락 핀치에 응답하지 않습니다되면테이프 나 핀 URE 사지.
  6. 머리의 복부 무료 클립과 복부의 정중선 절개를 수행합니다. 아직이 시점에서 흉강을 열지 마십시오. 위를 이동하고 하대 정맥을 나타 내기 위해 따로 장기의. 하대 정맥에 직접 헤파린을 주입하고 진행하기 전에 5 초 10을 기다립니다.
  7. 사용 가위 흉강의 내용을 노출 조리개와 흉곽의 측면을 자른다.
  8. 섬세 함께 엄지 손가락, 색인과 중간 손가락과 소비세 마음 둘과 폐의 마음을 잡아. 그 과정에서 대동맥 궁과 상행 대동맥 손상되지 않도록주의하면서 하행 대동맥의 수준에서 잘라. 즉시 얼음처럼 차가운 KH 버퍼 가득 해부 요리 중 하나에 심장과 폐를 전송합니다.
  9. 심장 박동이 정지 한 후, 두 번째 해부 접시에 전송하고 얼음처럼 차가운 KH 버퍼에 잠긴 마음을 유지하면서 부착 된 폐 조직의 큰 조각을 잘라. 이 하강 컷바로 대동맥 궁 위의 대동맥을 보내고.
    주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 방사선 안전 사무실에서 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 따릅니다.
  10. 따뜻한 버퍼 대동맥 캐뉼라를 채우기 위해 여전히 튜브에 존재할 수있는 임의의 물 또는 공기를 제거하기 위해 관류 장치의 대동맥 라인 플러시. 관류 완충액 심장 캐뉼라에 부착 될 때 공기 색전증의 가능성을 최소화하기 위해 대동맥 캐뉼라로부터 떨어 뜨리지.
  11. 이 마이크로 해부 집게를 사용하여 조심스럽게 대동맥을 열고 대동맥 정맥에 마음을 밀어 넣습니다. 마이크로 클립 캐 뉼러에 대동맥을 고정하고 심장을 Langendorff 관류를 시작합니다. 심장이 다시 박동을 시작하고 관류의 시작 부분에 다음과 같은 초에서 관상 동맥 혈관에 남아있는 모든 피를 추방 관찰한다.
    참고 :이 단계 4를 수행하는 것이 매우 중요합니다.심장 비가역 허혈성 손상을 막기 위해 가능한 한 빨리 4.10 내지 6. 경험을 바탕으로, 전체 절차는 1 ~ 2 분 정도 소요됩니다. 캐 뉼러에 대동맥을 슬라이딩하면이 대동맥 밸브 심근 혈류 손상 될 수 있으므로, 대동맥 루트를 통과하지 않도록주의.
  12. 3-0 실크 봉합사와 대동맥 캐 뉼러에 대동맥을 묶는와 마이크로 클립을 제거합니다. 폐 정맥을 찾습니다. 그것을 찾을 비 심장 조직을 손질 할 필요가있을 수 있지만,이 캐 뉼러로 좌심방를 연결하는 역할을하므로, 비 심장 조직을 너무 많이 차단하지 않는다.
  13. 따뜻한 버퍼 심방 뉼러를 채우기 위해 여전히 튜브에 존재할 수있는 임의의 물 또는 공기를 제거하기 위해 관류 장치의 좌심방 라인 플러시. 심장 캐뉼라에 부착 될 때 공기 색전증의 가능성을 최소화하기 위해 장치로부터 임의의 기포를 제거하는 것이 특히주의한다.
  14. 이 마이크로 해부 forc 사용EPS는 섬세 폐 혈관의 개통을 잡고 심방 정맥에 마음을 밀어 넣습니다. 부드럽게이 단계를 수행 할 수있는 심방 및 / 또는 대동맥 캐 뉼러를 회전시켜 심장의 위치를 ​​변경해야 할 수도 있습니다. 임의의 경우에, 절차는 심장에 과도한 부담을 부과하고 대동맥의 휨이 발생하지 않는 것을 보장한다. 3-0 실크 봉합사와 심방 정맥에 좌심방을 묶어.
  15. 심방 줄을 열고 동시에 작동 모드로 랑겐 돌프 모드에서 대동맥 라인을 전환합니다. 아웃 좌심방에서 버퍼 누출, 심방 라인을 닫습니다 랑겐 돌프 관류에 대동맥 라인을 전환하고, 정맥에보다 안전하게 좌심방를 연결하는 또 다른 3-0 실크 봉합사를 사용하는 경우.

심장 기능 및 시료 채취 5. 측정

주 : 대사 플럭스의 판정이 관상 흐름 (CF)에 대한 지식을 필요로한다. 후술하는 바와 같이, 혈류 값이 가능스톱워치의 간단한 사용으로 얻을. 또한, 동일한 방법으로 동맥 유량의 측정 (AF)은 그 다음에 적용하여 심장 기능의 일반적인 수단으로 심장 전원 (CP)를 계산하는데 사용될 수 심 박출량 (CO = CF + AF)의 판단을 허용 화학식 CP = CO (3 m / s) * 후 부하 (PA). 심장 기능의 평가 가능한 다른 방법은 압력 변환기와 맥압의 실시간 측정 (도 3 및 4)에 의존한다. 선택적이지만, 좌심실 수축기 및 확장기 함수의 결정을 포함한 심장 수축 기능과 혈역학의 가장 정확하고 상세한 측정은 감압 체적 (PV) 컨덕턴스 카테터의 사용으로 달성 될 것이다. 이 절에서는 고립 된 마음의 카테터를 설명합니다. 할 수 있습니다 통계 소프트웨어와 PV 카테터의 교정 및 데이터 분석에 대한 추가 정보참고 문헌 14, 15에서 발견.
주의 : 다음 단계는 방사성 물질의 조작을 포함한다. 적절한 개인 보호구를 착용하고 기관의 방사선 안전 사무실에서 설정 한 안전과 폐기물 처리 규정을 따릅니다.

  1. 실험이 카테터와 LV 기능의 직접 측정을 포함하는 경우, 26 G 바늘로 LV의 정점에 구멍과 구멍을 통해 카테터를 소개합니다.
  2. 압력 볼륨 카테터를 사용하면 그 샤프트 선단부 오른쪽 대동맥판 아래에 전극과 내막 경계에 인접하고 바로 심실 벽 내부 근위 전극은 LV 종축과 정렬되도록 신중 카테터를 위치.
  3. 물 재킷 심실에 중심을 밀봉 및 상기 데이터 수집 소프트웨어와 심장 기능 파라미터를 모니터링한다. 기준 파라미터 심장 이상을 5 분 동안 안정적인 한 후에 촬영을 시작.
  4. MEA에 의해 관상 동맥의 흐름을 결정심실 아래에 부착 된 20 mL의 주사기 튜브를 채우기 위해 요구되는 시간을 가감하는. 측정 후, 액체 방사성 폐기물 용기에 관상 동맥 유출 물을 비우 삼방 콕을 열어.
    주 : 유량 측정은 유량계와 flowprobes을 사용하여 수행 될 수있다.
  5. 이 중심부를 종료 관상 유출 ~ 2 mL로 복구 삼방 스톱 콕의 사이드 아암에 부착 된 3 ㎖ 주사기를 사용한다. 2 ml의 캡이 microcentrifuge 관에 관상 유출의 0.5 ml에 전송하고 즉시 포도당 산화의 비율 (아래 제 6 조)의 결정을 진행합니다.
  6. 적절하게 레이블이 microcentrifuge 관에 관상 유출 시료 (~ 1.5 ㎖)의 나머지 부분을 전송하고 얼음에 저장합니다.
  7. 반복 5.4 관류 실험이 끝날 때까지 일정한 간격 (예 : 매 5 또는 10 분)에서 5.6 단계를.
  8. 압력 볼륨 카테터를 사용하는 경우, 고장 성 식염수 10 ㎕를 볼 러스 주입 (15 %)심방 라인에 오른쪽 실험을 체결하기 전에 심방 정맥 전에. 심장 볼륨 (15)의 정확한 결정에 중요한 병렬 전도도 (V의 p)를 계산하기 위해이 일시 주사를 사용합니다.
  9. 심실 개봉 한 실험에 사용 된 경우, LV에서 카테터를 제거한다. 다음 방법 중 하나를 사용하여 심장 복구 :
    1. 이 다운 스트림 분석에 대한 마음의 특정 영역을 분리 할 필요가없고 관류 장치는 즉시, 가까운 심방과 대동맥 두 줄을 허용하고있는 경우 Wollenberger 집게 사용하여 캐 뉼러에 마음을 동결 클램프 경우 액체 질소에 미리를 냉각.
    2. 또는, 캐 뉼러 떨어져 심장을 잘라 얼음처럼 차가운 KH 버퍼에 놓습니다. 빠르게 종이 타월에 마음을 건조하고 습 중량을 측정한다. 심장 후 해부 조직 샘플은 특정의 측정으로 수집 될 수있다. Wollenberger 통을 사용하여 나머지 조직을 동결의 액체 질소에 미리가 냉각.
  10. 건조 중량 (섹션을 8 계산 참조)의 결정 때까지 -80 ºC에서 얼어 붙은 심장 조직을 저장합니다.

심근 포도당 산화 요금 6. 결정

참고 :이 방법은 hyamine의 수산화 트래핑 솔루션 관상 유출에서 14 CO 2의 양적 회복으로 구성되어 있습니다. H (14) CO3-이 과염소산와 버퍼의 산성화 다음 회수로 14 CO 2 용해. 샘플은 시간이 지남에 14 CO 2의 손실이 발생할 것입니다 공기와 시료 사이의 가스의 수동 확산 그들의 복구 후 즉시 처리해야한다. 섬광 바이알 단단히 과염소산을 첨가 한 후 14 CO 2의 손실을 방지하기 위해 고무 슬리브 마개로 밀봉한다. 필요한 경우, 파라 필름으로는 고무 슬리브 스토퍼를 고정하는데 사용될 수있다유리 병 (그림 2).

  1. 유리 섬광 유리 병에 hyamine의 10 배 농축 된 수산화 (샘플 당 하나의 유리 병 + 배경 활동의 결정에 대한 두 개의 여분의 튜브)의 1 ML을 추가합니다.
    주의 : hyamine의 수산화 매우 독성이 심한 화상을 일으킴. 적절한 취급 및 보관에 대한 제품의 MSDS를 참조하십시오.
  2. 사용 핀셋 섬세 유리 병 hyamine의 수산화 프리 필드에 0.5 ml의 관상 유출 샘플을 포함하는 2 ml의 캡이 microcentrifuge 관을 전송합니다. 배경 활성의 결정을 위해 0.5 ml의 관류 완충액을 사용한다.
  3. 고무 슬리브 마개 유리 병 캡. 파라 필름은 유리 병의 밀봉을 확보하기 위해 사용될 수있다. (% w 60 % w) 고무 슬리브 스토퍼를 통해 직접 2ml의 캡 튜브에 1 ㎖의 주사기 23 G 긴 바늘을 사용하여, 과염소산 200 μL를 주입.
    참고 : 관상 동맥 유출로 인해 BSA의 침전에 흰색 설정해야합니다.
  4. 유리 병의의를하자그것은 하룻밤.
    주의 : 과염소산가 매우 부식성이 산화제 역할 및 / 또는 폭발의 위험이 있습니다. 적절한 취급 및 보관에 대한 제품의 MSDS를 참조하십시오.
  5. 다음 날, 고무 슬리브 마개를 제거합니다. 조심스럽게 핀셋 각 2 ml의 캡 튜브를 검색하고 hyamine의 수산화물을 모두 검색 1 ML의 섬광 칵테일 오픈 유리 병의 상단에있는 튜브의 바닥을 씻는다. 적절하게 레이블 방사성 폐기물 용기에 캡 튜브를 폐기하십시오.
  6. 유리 병 당 추가 9 ML의 섬광 칵테일을 추가합니다. 특정 활동의 결정에 10 ml의 액체 섬광 칵테일로 채워진 두 개의 유리 병에 직접 0.5 ml의 관류 버퍼를 추가합니다. 격렬하게 손으로 튜브를 흔들어 기포가 적절하게 이중 라벨 실험 설정 액체 섬광 계수기에서 측정하기 전에 방출 할 수 있도록 적어도 6 시간을 기다립니다.
    참고 : 북동를 시각화하기 위해 투명 유리 병을 사용하여edle 고무 슬리브 스토퍼를 관통 할 때. 이 반응을 망칠 것 같은 hyamine의 수산화에 과염소산을 떨어 뜨리지 마십시오. 과염소산 출시 공기에 관상 유출에서 14 CO 2를 추가. 바이알을 밀봉되어야하며 14 CO 2 모두 수산화 hyamine으로 포획해야하지만,이 화학 퓸 후드이 분석을 수행 할 것을 권장한다.

심근 올 레이트 산화 요금 7. 결정

주 : 상기 방법은 강한 음이온 교환 수지를 사용하여 관상 동맥 유출 물로부터 3 H 2 O의 정량적 인 분리 및 회수에 근거한다. 14 CO 2의 복구와는 달리, 어떠한 샘플 안정성 문제가없고, 관상 동맥 유출 물을 분석을 수행하기 전에 얼음에 보관 또는 냉동 장치에 저장 될 수있다.

  1. 음이온 교환 수지 컬럼 (샘플 + t 당 하나의 열을 준비유리솜으로 3 ㎖ 주사기 튜브의 팁을 작성하여 백그라운드 활성의 측정)에 대한 여분의 열 WO. 수지가 주사기 튜브에 2 ml의 마크에 도달 할 때까지 전송 피펫 수지 / 물 슬러리를 추가합니다.
  2. 컬럼을 통해 2 ML의 초순수를 전달하여 수지를 씻으십시오. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
  3. 열에서 열린 섬광 유리 병을 넣고 0.5 ml의를 열 당 관상 동맥 유출 물을 넣습니다. 배경 활동의 결정을위한 0.5 ml의 관류 버퍼를로드합니다.
  4. 0.5, 1 및 2 mL의 초순수로 순차적으로 열을 씻는다. 용출이 완료되면, 적절하게 레이블 방사성 폐기물 용기에 열을 폐기합니다.
  5. 섬광 바이알 당 13 ml의 액체 섬광 칵테일을 추가합니다. 특정 활동의 결정에 13 ml의 액체 섬광 칵테일로 채워진 두 개의 유리 병에 직접 0.5 ml의 관류 버퍼를 추가합니다. 적극적으로 튜브를 흔들 액체 공상 과학에서 측정하기 전에 적어도 6 시간을 기다려야ntillation 카운터는 적절하게 이중 라벨 실험 설정합니다.

8. 계산

  1. 아직 수행하지 않으면 전체를 관류 마음의 습 중량을 결정합니다.
    참고 : 분자 생화학 적 분석 이후에 남아있는 조직에서 수행 될 경우 냉동 조직이 해동하는 것을 허용하지 않습니다.
  2. 전체 관류 심장에서 조직 샘플의 젖은 무게를 결정 (전체 심장의 약 15 ~ 30 % 사용). 밤새 50 ℃에서 오븐 세트에서 조직 샘플을 배치 및 건조 중량을 측정한다. 그램 전체 심장의 건조 중량을 결정하기 위해 조직 샘플의 습윤 중량 / 건조 중량비를 사용하여 (g 건조 중량)..
  3. 각 시점 x에 대하여 ㎖ / 분의 혈류 CF (X)의 값을 표현한다.
  4. 글루코스 산화 속도의 결정
    1. determi하는 14 C의 배경 활동에 대한 측정이 붕괴 / 분 (DPM) 값을 평균보정 계수 (14C)의 DPM 바 북동.
    2. 14 C 특정 활동 (14C)의 DPM의 SA의 값을 평균 결정합니다.
    3. 공식을 적용하여 DPM / μmol (F 글루)에서 포도당의 특정 방사능을 결정
      figure-protocol-1
      참고 : 여기서 n 글루 (μmol) = C 글루 (μmol / L) * 샘플 볼륨 (L) = 2.5 5 밀리몰 / L에서 포도당을 사용하여 0.5 ml의 샘플.
    4. 수식을 적용하여 DPM / 분 (A) 14 CO 2의 생성 속도 X 각 시점에 대한 결정
      figure-protocol-2
      참고 : 어디 권 × (㎖) = 0.5
    5. 건조 중량 심장의 결정된 값 나누기 A는 CO 2 (14)의 제조의 정규 유속 (A 규격을 얻었다 ) DPM에서 / 분.
    6. GO는 규범 / F의 Glu가 g 건조 중량 당 포도당 / 분의 μmol의 포도당 산화 (GO)의 속도를 얻을 수 = 공식을 적용합니다.
  5. 올레산 산화 속도의 결정
    1. 보정 계수 3H의 DPM 바을 결정하는 3 H의 배경 활동에 대한 측정이 붕괴 / 분 (DPM) 값을 평균.
    2. 3 H 특정 활동 3H의 DPM의 SA의 값을 평균 결정합니다.
    3. 공식을 적용하여 DPM / μmol (F 안녕, 전자)의 올레 에이트의 비 방사능을 결정
      figure-protocol-3
      참고 : 여기서 n 올레 (μmol) = C 올레 (μmol / L) * 샘플 볼륨 (L) = 0.2 0.4 밀리몰 / L에서 올 레이트를 사용하여 0.5 ml의 샘플.
    4. 각 팀에 대한 결정E 지점 DPM / 분 (B) 2 O 수식을 적용하여 3 H의 생성 속도를 X
      figure-protocol-4
      참고 : 어디 권 × (㎖) = 0.5
    5. 건조 중량 심장의 결정된 값에 의해 나누기 B은 건조 중량 g 당 DPM / 분에서 3 H 2 O (B 놈)의 제조 정규화 레이트를 얻었다.
    6. = B 규격 / F 올레가 g 건조 중량 당 올레 에이트 / 분의 μmol에 올 레이트 산화 (OO)의 속도를 얻기 위해 공식 OO을 적용합니다.

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결과

두 대표 실험은 아래 그림에 설명되어 있습니다. 두 경우 모두, 16 주령의 수컷 스프 라그 돌리 래트의 심장을 분리하고, 선행하는 프로토콜에 따라 제조 KH 완충액 작업 모드 관류. 각 실험에서, 심장 심장 작업에 영향을 미치는 응력 상태로 하였다. 심장 수축 기능 대동맥 라인의 압력 센서의 삽입을 통해 심장의 전력 측정하여 맥압의 연속 촬영에 의해 평가 하였다. 에너지 제공 기판의 사용의 각 스트레스 조건의 결과를 동시에 포도당과 올레산의 산화 속도를 측정함으로써 결정 하였다.

첫 번째 실험에서, 부하의 급성 증가가 40 %로 후 부하를 증가시킴으로써 거의 생리 부하에서 20 분 재관류 후 모의 하였다 (수동에 의해 달성대동맥 오버 플로우 챔버를 상승) 및 재관류 버퍼 (그림 3A)에 에피네프린 (1 μmol / L)을 추가하...

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토론

위의 프로토콜을 동시에 분리 작업 쥐 심장 글루코스 산화 및 지방산 산화를 통해 기판의 광속을 정량화하는 방법을 자세히. 측정은 (... 등의 부하 변화, 허혈 재관류) 기준선 스트레스 조건 하에서 기판 대사 심장 워크 간의 관계를 결정하기 위해 기록 된 심장 기능 파라미터에 중첩 될 수있다. 이는 대사 / 수축 관계 심부전 및 당뇨병과 같은 기존의 상태에 의해 영향을받는 방법을 평가하는 것도 가능하다. 또한, 유전자 변형 된 쥐의 심장 심장 대사와 기능의 특정 단백질의 효과를 심문하는 데 사용될 수있다. 최근, 이들 매개 변수에 대한 다른 약물과 순환 요인의 영향이 개별적으로 시험 될 수있다. 당분 통한 글루코스의 흐름은 항상 글루코스 산화의 속도와 상관 관계가 없기 때문에, 그것은 수있다 인포하나의 실험 설정에서 두 경로를 통해 포도당 플럭스의 속도를 따라 포지티브,.

3 H 2 O의 방출은 해당 작용 (20...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 National Institutes of Health Grants R00 HL112952(to R. H.), R01 HL108618(to J.P.G.), P01 HL051971 및 P20 GM104357의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화나트륨(NaCl)Fisher ScientificBP358
염화칼륨(KCl)Fisher ScientificBP366
인산칼륨 일염기성(KH2PO4)Fisher ScientificP284
황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4*7H2O)Fisher ScientificM63
중탄산나트륨(NaHCO3)Fisher ScientificS233
염화칼슘(CaCl2)Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8 수지, 염화물 형태, 100 - 200 건조 메쉬 크기, 500gBio-Rad1401441이 제품은 직접 하이드옥사이드 형태로 교체하실 수 있습니다  (아래 참조 참조) 그러나 이것은 거의 8 배 더 많은 비용이 듭니다
AG 1-X8 수지, 수산화물 형태, 100-200 건조 메쉬 크기, 100gBio-Rad1432445이 항목을 구입하면 음이온 교환 수지를 염화물 형태에서 수산화물 형태로 변환하는 것을 건너 뛸 수 있습니다 (프로토콜의 섹션 1.2 참조)
유리 미세 분석 진공 필터 홀더Fisher Scientific09-753-2
수산화 나트륨 (NaOH)Fisher ScientificS318부식성. 적절한 취급 및 보관에 대해서는 제품 MSDS를 참조하십시오.
프릿 실린더피셔 사이언티픽11-138B
Probumin 소 혈청 알부민 지방산 프리, 분말EMD Millipore820027차가운 에탄올 분별과 같은 다른 정제 공정은 심장에 유독한 잔류물을 남길 수 있으므로 숯 탈지 BSA의 사용을 권장합니다.
올레산나트륨시그마-알드리치O7501
올레산, [9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MC방사성 물질. 주문 및 취급에 대한 기관의 방사선 안전 사무소 지침을 따르십시오.
투석 멤브레인 튜브, 직경 29mmFisher Scientific08-667E
D-(+)-포도시그마-알드리치G7021
포도당, D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MC방사성 물질. 주문 및 취급에 대한 기관의 방사선 안전 사무소 지침을 따르십시오.
Humulin R U-100Eli Lilly and CompanyNDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin HydrateSigma-AldrichT133USDEA Schedule III
3-0 Silk Black BraidRoboz SurgicalSUT-15-3
10x Hyamine HydroxidePerkinElmer6003005독성이 강하고 심각한 화상을 유발합니다. 적절한 취급 및 보관을 위해 MSDS 제품을 참조하십시오.
20ml 유리 섬광 바이알Fisher Scientific03-341-25E14CO2
20ml HDPE 섬광 바이알Fisher Scientific03-337-23B3H2O Red의 정량 회수를 위해 HDPE 바이알을 사용하십시오
고무 슬리브 스토퍼Fisher Scientific14-126DDFit 20 mL 섬광 바이알; 재사용 가능한
BD PrecisionGlide 바늘 23G x 40mmBD305194CO2 트랩 과염소산의 고무 슬리브 스토퍼를 통해 과염소산을 주입하는 데 사용
, 60%Fisher ScientificA228부식성이 높으며 산화제 및/또는 폭발 위험을 유발할 수 있습니다. 적절한 취급 및 보관을 위해 제품 MSDS를 참조하십시오
Ultima Gold, Scintillation CocktailPerkinElmer6013327
Glass WoolFisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean Detergent PowderFisher Scientific04-355유리 제품, 플라스틱 부품 및 튜브 청소용
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered DetergentFisher Scientific16-000-115지방산-BSA 잔류물로 오염된 "손이 닿기 어려운" 표면(튜브, 유리 제품) 청소용
가스 분산 튜브 당 의 정량 회수를 위해 유리 바이알을 사용하십시오. .

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