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방법 논문

Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

22.7K 조회수

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DOI:

10.3791/54515

⸱

2017년 1월 1일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Fate Laboratory, Institute of Genetics and Biophysics "A. Buzzati Traverso", CNR, 2School of Medicine and Surgery, University of Milano-Bicocca, 3Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, San Raffaele Scientific Institute

이 논문에서

요약

이 원고는 성체 마우스에서 급성 골격근 재생을 유도하고 해부, 동결, 절단, 일상적인 염색 및 근섬유 단면적 분석과 같은 근육 조작을 유도하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

골격 근육 재생이 부상 또는 질병에 대한 응답으로 성인 골격 근육에서 발생하는 생리적 과정이다. 급성 손상 - ​​유도 골격근 재생 근육 재생뿐만 아니라 메커니즘과 다른 플레이어와 관련된 사건을 연구하기 위해 널리 사용되는 강력한 모델 시스템이다. 사실상,이 프로세스의 상세한 기술은 골격근 변성을 초래할 병적 조건의 이해에 필수적이며, 새로운 표적 치료 전략을 식별 돕는다. 본 연구는 cardiotoxin의 단일 근육 내 주사 (CTX)를 통해 마우스의 급성 골격 근육의 재생을 유도하는 상세하고 재생 가능한 프로토콜을 설명합니다. CTX는 뱀 독 독소의 가족에 속하고 결국 재생 이벤트를 트리거 근섬유의 근종 용해술을 발생합니다. 골격 근육 재생의 역학은 근육 부분의 조직 학적 분석에 의해 평가된다. 또한 프로토콜해부 동결 및 경골근 근육뿐만 아니라 널리 후속 학적 및 형태 계측 학적 분석에 사용되는 루틴을 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 절단 실험 절차를 도시한다.

서론

포유류 성인 골격 근육 수축 전문화 다핵 근육 세포 (근섬유) fascicules의 그룹에 의해 형성된다. 각각의 근섬유는 정기적으로 반복 조직 수축성 단백질 (액틴과 미오신 필라멘트)로 구성되는 sarcolemma (혈장 막)과 포함 근원 섬유에 의해 둘러싸여 긴 syncytium입니다. 성인의 삶과 휴식 조건에서, 골격 근육은 myonuclei 1의 매우 낮은 회전율을 가지고, 실제로 sarcolemma 아래 근섬유의 주변에 위치하는 myonuclei은, 세포주기의 G0 단계에서 검거 및 1,2- 증식 할 수없는된다.

골격 근육 손상을 따라 서로 밀접하게 관련되어 조직 리모델링 여러 이벤트 후에 항상성 도달 재생하는 독특한 능력을 가지고있다. 급성 손상 또는 외상 후 변성이 유발되어 재생 공정 뒤에근육 세포 집단의 거주자 등 다양한 세포 집단을 포함하는, 상기 위성 세포 SCS (). 실제로, 어떠한 환경 적 자극의 부재 하에서, 위성 셀은 정지 상태에 있고 sarcolemma 상기 기저판 사이에 3,4- 전문 틈새에 위치하고있다. 부상 또는 질병, 활성화, 새로 형성 근섬유 5 상승을주고, 손상된 지역으로 이주, 결국 차별화 확산 될 희주 다음과 같습니다. 활성화 SCS는 외상 6-8의 사이트에서 모집하는 서로 다른 세포 집단, 주로 염증 세포와 크로스 토크 (cross-talk)을 설정합니다. 이 크로스 토크는 세포가 결국 9 항상성 선도 분자 신호 구조 변경을 유도하는 규제 패러다임을 수행 할 수 있습니다. 희주, 염증 및 간질 세포, 혈관 신생 과정 및 재 신경 분포 이벤트 외에도이 높은 조직의 복구를 조율 된 방식으로 행동, 참여pecialized들 구조.

근육의 생리를 이해하고, 또한 전체 공정의 깊은 지식을 필요로 치료 전략을 향상시킬뿐만 아니라, 골격근 재생의 다양한 측면을 연구하는데 관심이있다. 여러 가지 실험 방법은 현재 서로 다른 세포 집단의 신호 경로, 및 관련된 분자 메커니즘의 정체성과 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 손상의 마우스 모델은이 과정의 여러 측면을 조사하는 강력한 도구를 나타냅니다. 다른 일반적으로 급성 근육 손상 연구자 프로세스의 말미에 초기 단계에서, 생체 내에서 재생 공정을 수행 할 수 있도록 유도하는 방법을 사용 하였다. 이 프로토콜은 용해술 유도 및 조직 샘플의 분석까지 재생 공정을 트리거 뱀독 - 유래 cardiotoxin의 근육 내 주사 (CTX)의 단계를 설명한다. CTX 주입 후, 마일CE는 실험 조건에 따라 서로 다른 시점에서 희생 될 수 있고, 골격 근육 해부하고 추가 분석을 위해 처리 될 수있다. 마지막으로, 우리는 기본 형태 학적 관찰과 정량적 분석을 수행하도록 조직 절편의 염색 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 높은 재현성으로 10 생체 내에서 급성 골격 근육 재생의 연구 수 있습니다.

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프로토콜

모든 실험 동물 연구를위한 제도적 지침에 엄격한에 따라 실시 및 동물 실험에 관한 법률에 따라 공중 보건, 동물 건강, 영양과 건강의 이탈리아 정부의 식품 안전의 부서에 의해 승인되었다. 경추 탈구 절차 IACUC 또는 이에 상응하는 요구 사항에 따라 기관의 기관에 따라 다를 수 있습니다.

경골 전방 근육 1. Cardiotoxin 주입

  1. 절차를 시작하기 전에 멸균 인산 완충 용액 (PBS) 또는 물에 cardiotoxin 원액을 희석함으로써 cardiotoxin (CTX)의 용액을 10 μM 작업을 준비한다.
    주 : CTX는 1 ㎎ / ㎖의 물에 용해된다. 70 μm의 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 이 프로토콜에 사용 CTX 약 7,000 다 분자량 cardiotoxins의 혼합물이다.
    착용하는 것이 좋습니다 :주의이중 장갑, 위생 마스크, 보호 안경 희석 경우에도, 상기 용액과 접촉을 피하기 위해 매우 조심해야 (또는 안전 안경에, 후드에서 작동하는 것이 좋습니다).
  2. 케타민과 자일 라진 (80 ㎎ / ㎏ 및 / kg 몸 질량의 10 mg)을 또는 승인을 사용할 수 마취제의 복강 내 주사하여 마우스를 마취.
  3. 마우스 얼굴이 위로, 70 % 에탄올로 뒷다리를 스프레이. 메스의 도움으로 전 경골근 (TA) 근육의 정확한 위치를 시각화하기 위해 무릎 아래 낮은 다리의 앞쪽 부분에서 떨어져 머리를 잘라.
    참고 : TA 근육이 뼈에 측면을가는 발목에서 끝나는, 경골의 근위 몸에서 발생한다. 긴 힘줄 (그림 1A 참조) 발목에서 다리로 확장합니다.
  4. 다시 천천히 플런저를 잡아 당겨 주사기로 솔루션의 ~ 100 μL를 그립니다.
  5. (기포 제거 수직 주사기 유지바늘과 위쪽). 조심스럽게 아래로 플런저를 끌어와 튜브의 내부에 부착 된 기포가 위쪽으로 올 수 있도록 주사기의 측면을 누릅니다. 천천히 큰 공기 방울을 해제 플런저를 누릅니다. 액체의 몇 방울 바늘을 올 것이다. 이 시점에서, cardiotoxin의 독성 주어, 그것을 분산 튜브로 다시 액체를 픽업하지해야합니다.
  6. 원하는 투여 량에 도달 할 때까지 주사기로 상기 용액을 철회. 각 TA 근육에 대한 CTX 용액 20 μL를 주입한다.
  7. 무릎을 향해 건에서 지침과 경골 뼈의 위치에 따라 TA의 중심에 바늘을 삽입합니다. 조교가 얇은 조직이기 때문에, (2/3 mm 깊이 바늘, 약 10 ° ~ 20 °의 각도를 삽입) 너무 깊이하지 않고 주사를 수행하고, 근육 자체 (그림 1A)을 넘어 마십시오.
  8. 즉시 주사 후 바늘을 꺼내하지만 2 기다리지 말고 - 누출을 방지하기 위해 3들CTX의 나이는 근육에서 삭제합니다.
  9. 쥐가 마취 때문에, 깨어 사용 된 에탄올 체온을 줄일 때까지 절차 후 (37 ° C에서) 가열 접시에 새장을 배치합니다.

2. 앞정 전방 격리

주 : 근육 실험 조건에 따라 cardiotoxin 주사 후에 여러 시점에서 분리 될 수있다.

  1. 자궁 경부 전위로 마우스를 희생.
  2. 70 % 에탄올로 뒷다리 스프레이. 절차 동안, 동물을 누르고 지지체에 고정 될 수있다.
  3. (다리 위) 근위 힘줄 레벨에서 피부를 잘라 피부 아래 위의 블레이드를 삽입하고, 무릎의 방향을 위쪽으로 피부를 잘라. 집게의 도움으로, 피부를 위로 당겨 완전히 근육을 노출. 조심스럽게 피부와 관심의 영역에서 머리를 모두 제거합니다.
  4. 일에 천천히 끼거나 절단하여 근막을 (제거핀셋 팁 또는 경골 (도 1b)의 대향 측) 근육의 극단적 외주 위 해부와 미세한 마이크로. 한 번 깨진 부드럽게 얇은 팁 핀셋의 도움으로 근막을 제거; 기본 근육의 손상을 방지.
    주의 : 다른 근육 및 기관과 마찬가지로, TA는 밴드 (다리 깊은 근막) 깊은 피부 아래에 놓여 있고 그 쉽게 기본 근육을 분리 제거 할 필요가 결합 조직의 얇은 판으로 덮여있다.
  5. 말단 TA 건과 병치되어 다리 위의 신근 심지 건, 시각화합니다. 신근 심지 Longus (EDL) 근육의 힘줄이 약간 TA 건 아래에 있습니다. 성인 쥐의 힘줄은 육안으로 볼 수 있습니다.
  6. 다음 두 가지 방법 중 하나 다음 TA 근육을 제거합니다 :
    1. 머무르고, 미세 마이크로 가위를 해부와 두 힘줄을 잘라 전방 측을 향해을 당겨g 집게와 힘줄. 두 힘줄 별개 근육을 분리 반대 방향으로 부드럽게 당겨.
    2. 얇은 팁 핀셋의 도움으로, 힘줄 자체 (그림 1C, 위 사진) 아래의 팁을 전달하여 신근 심지 건에서 말단 TA 건을 분리합니다. 부드럽게 기본 근육 (그림 1C, 아래 사진)에서 분리하기 위해 TA 아래 핀셋을 밀어 넣습니다.
    3. 약간 상승을 유지 조교 건 잘라 근육 아래에있는 핀셋을 잡고 조심스럽게 무릎 (그림 1D, 왼쪽 사진)를 부착 이하 만 지역까지 위쪽으로 당깁니다. 가위 (그림 1D, 오른쪽 사진)와 근육의 가장자리 다음, 무릎 아래 TA를 잘라.
      참고 : 근육이 약간 측면에 부착 된 상태를 유지하는 경우를 분리하기 위해 가위를 해부 미세 마이크로를 사용합니다.
      참고 : 집게 쉽게 TA 아래에 맞지 않으면,이는 밴드가 완전히 제거되지 않은 것으로 가능하고, 그것은 여전히 근육 위에 표시 될 수있다. 이 경우, 완전히 진행하기 전에 밴드를 제거합니다.

3. 신선한 냉동 근육 기술

  1. 트라가 칸트 검 또는 코르크의 조각에 비슷한 접착제 동결 화합물 (예를 들어, 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물)의 작은 금액을 놓습니다. 동결하기 전에 뒷면에 코르크의 조각 레이블, 필요한 (그림 2A)의 경우.
  2. 근육의 횡단면을 얻기 위해, 코르크에 대하여 수직 위치에서 근육을 확실하게 선단 힘줄 넣고 외부 3/4 근육을 떠나는 트라가 칸트 검으로 TA 싱크 (도 2A).
  3. 알루미늄 캔을 작성 (또는, 금속 컵이나 유리 비이커) 이소 펜탄과. 듀어 포함하여 Liqui에 이소 펜탄의 캔을 일시 중단D 질소는 액체 질소는 캔에 입력 할 수 없습니다.
    참고 : 이소 펜탄은 조직의 최적의 동결에 대해 (-150에서 -160 ° C에) 적절한 온도에 도달해야합니다. 일부 흰색 고체 입자가 상기 캔의 바닥에 형성되고 펜탄 약간 점성이되면 정확한 온도에 도달한다.
    참고 : 냉동 유물로 이어질 수 있으므로, 고체 입자의 형성 전에 샘플을 동결하지 마십시오. 펜탄 완전히 단단한지면이 해동 될 때까지 한편, 약간 백색 입자가 여전히 존재하는지 확인하고, 실온에서두고.
  4. Mixter 집게를 사용하여 빠르게 근육 위치 아래를 유지하면서 이소 펜탄에 근육과 코르크를 찍어, 그리고 완전히 액체에 침지 때 코르크를 해제해야합니다. 시료가 떠있는 동안 이러한 방법으로, 코르크의 뒷면은 액체에 표시해야한다.
  5. 는 sa를 남겨1 분 동안 이소 펜탄에 mple.
  6. Mixter 집게 (또는 유사한 집게)을 사용하여 근육을 적어도 2 분 동안 액체 질소에 담궈.
  7. A의 보관 -80 C의 냉동고 ° 직접 표시 알루미늄 호일에 개별적으로 표본을 감싸 즉시 드라이 아이스 (-70 °에 C)에 배치하거나.
    주 : 절차를 통하여, 단계 3.4에서 3.7로, 그것은 정확한 온도를 유지하고 (. C 냉동기로 -80 ° 이송 중에 예) 해동로부터 시험편을 방지하는 것이 매우 중요하다. 제어되지 해동 조직 내에 존재하며, 결국 인공물의 형성 또는 근육 섬유의 파괴를 야기하는 물 미결정의 재 냉각의 온도 상승 결과 (섬유의 중심에 큰 화이트 홀로 조직 절편을 가시화).

냉동 근육의 (4)의 저온 단면

  1. 그라 이오 스탯 챔버 온도 t 설정오 -20 -22 ° C까지.
  2. 이를 최소 30 분간 평형을 허용 시험편 스터브 블레이드 및 저온 유지 챔버 내의 시료를 넣어.
  3. 시편 스텁에 냉동 화합물 (예를 들어, 10월 화합물)의 작은 금액을 놓고 냉동 화합물 응고 전에 시편으로 코르크를 체험. 한편, 블레이드 홀더 블레이드를 배치합니다.
  4. 블레이드 홀더 (도 2B)로 시험편 홀더 방향을 제공된 나사를 사용하여 시험편 및 블레이드 정렬.
  5. 10 μm의 섹션 두께를 설정합니다. 조직을 잘라 진행합니다. 구동 휠의 각각의 차례를 시편 홀더 블레이드를 향해 제어 거리를 진행한다.
  6. 편광 슬라이드 (슬라이드 당 8 ~ 10 절) (그림 2C)에 섹션을 놓습니다.
  7. 절편 한 후, -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
    주 : 시료는 -80 ° C에 냉동 저장 furthe 위해 재사용 될 수있다제대로 처리하고 저장하는 경우 R, 절편.

5. 일상적인 조직 학적 염색 (헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩)

주 : 여러 학적 얼룩 분석에 의한 근육의 부분에서 수행 될 수있다. 형태 학적 및 형태 계측 학적 분석을위한 일상적인 조직 학적 염색은 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 중크롬산 얼룩입니다. 헤 마톡 실린은 핵에게 깊은 보라색 얼룩. 핵 염색 에오신으로 대조되는 이러한 세포질의 근섬유 같은 산성 구조, 얼룩 (핑크 / 레드).

  1. 완전히 자연 건조 10 절 냉동 슬라이드 - 실온에서 15 분, 염색 트레이에 슬라이드를 제출하고, 염색 통에 트레이를 넣어.
  2. 헤 마톡 실린 1 분 동안 얼룩.
  3. 10 분은 헤 마톡 실린를 세척하는 상당히 약한 수돗물 제트에서 염색 통을 놓습니다.
  4. 에오신의 알콜 용액을 사용할 경우 t을 이동 (5 분 95 % 에탄올에 대한 슬라이드를 빠져수성 에오신 솔루션의 경우 자신의 단계).
  5. 에오신 용액으로 1 분간 Counterstain과.
  6. 과도한 에오신 용액을 제거하기 위해 물로 씻어.
    참고 : 헤 마톡 실린이나 에오신 중 하나와 염색의 최적의 타이밍은 각각의 새 배치에 대해 정의해야합니다.
  7. 채점 에탄올 시리즈 샘플 탈수 50 % 및 70 % (몇 초간 각각). 신속하게 100 %의 에탄올이 변화를 5 분마다 한 후, 95 % 에탄올에 담가.
  8. 자일 렌의 2 변경, 각 5 분 이상에 걸린. 이 단계는 화학 후드 하에서 수행되어야한다.
  9. 슬라이드에 미디어를 장착하고 커버 슬립으로 다루는 몇 방울을 적용, 크실렌 기반 장착 매체 슬라이드를 탑재합니다. 장착 매체는 커버 슬립 슬라이드에 넣어 커버 슬립에 적용될 수있다.
    1. 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공기 방울을 형성하지 마십시오. 기포를 제거 (설치 후) 수직 슬라이드를 유지하고 과잉 개월을 짜려면부드럽게 무딘 집게 (또는 유사한 무딘 도구)와 커버 슬립 눌러서 unting 매체 기포.
  10. 크실렌이 분석을 진행하기 전에 완전히 증발 할 수 있도록 밤새 몇 시간 동안 후드 슬라이드를 유지하거나.
  11. 마우스 당 적어도 하나의 전체 근육 부의 겹치지 일련의 이미지를 이용하여 H & E 염색 된 근육의 재생 구간의 형태 학적 및 형태 계측 학적 분석을 수행한다. 20X 배율 밝은 필드 현미경 이미지를 캡처.
    주 : 5 마우스의 최소 개수는 측정의 통계적 유의성을 구하는 것을 권장한다.
    참고 : 이미지 분석 소프트웨어는 (http://imagej.nih.gov/ij/)를 무료로 다운로드 소프트웨어 ImageJ에,이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.

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결과

H&E 염색을 통해 골격근 재생 과정의 특정 시점에서의 형태학적 평가가 가능합니다. 그림 3은 야생형 마우스의 손상된 TA 근육을 대상으로 수행한 시계열 분석 결과를 보여줍니다. 그림 3A의 모식도와 같이, CTX 주입 후 3, 7, 15, 30일에 근육을 분리하였습니다. H&E 염색된 횡단면의 대표 사진들은 시간에 따른 골격근 회복의 역동성을 보여줍니다 (그림 3B-E). 손상 후 3일째에는 근육의 구조적 체계가 완전히 파괴되며, 퇴행된 근섬유(괴사 부위)와 단핵 세포들이 뚜렷하게 관찰됩니다 (그림 3B). 이러한 이질적인 세포 집단은 주로 일시적으로 증식하는 위성 세포(근아세포), 혈액에서 보충된 염증 세포11, 그리고 손상 부위에서 유발되는 재생 과정에 참여하는 간질 세포 및 내피 세포로 구성됩니다. 이러한 맥락...

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토론

여기에서는 골격근의 급성 손상을 유도하는 프로토콜(즉, CTX의 근육 주사)을 설명합니다. 이는 생체 내 골격근 재생의 역학을 연구하는 강력한 도구로 널리 사용됩니다. CTX 주사는 근막의 탈분극과 섬유의 수축으로 인해 발생하는 근육 섬유의 변성을 유도하고 근육 재생으로 이어지는 일련의 사건을 유발합니다.12. 골격근은 실험적 요구 사항에 따라 주사 및 손상 후 원하는 시점에서 해부되고 후속 조직학적 분석에 사용됩니다. 해부된 근육은 냉동 보호 배지에 포함시킨 후 동결되거나 파라핀에 포함될 수 있습니다. 그러나 이러한 절차에는 파라포름알데히드로 사전 고정하는 단계가 필요하며, 이는 아티팩트를 생성하고 결국 후속 분석에 영향을 미칠 수 있습니다. 조직을 직접 얼리면 이 문제를 예방할 수 있습니다. 주목할 점은 많은 1차 항체가 신선한 냉동 근육 절편13에서만 독점적으로 또는 더 효과적으로 작용하여 이 절차를 보다 신뢰할 수 있게 만든다는 것입니다. 형태 측정 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

IGB-CNR의 Animal House와 통합 현미경 시설에 감사드립니다. 이 작업은 ENDOSTEM(근육 조직의 복구 및 유지를 위한 혈관 구조 관련 줄기 세포 및 근육 줄기 세포의 활성화, 보조금 계약 번호 241440) 프로젝트의 유럽 공동체 제7차 프레임워크 프로그램, 이탈리아 교육-대학-연구부(MIUR-PRIN2 010-2011)에서 G.M. 및 S.B.로, PON 클러스터 IRMI에서 G.M.으로, 그리고 CARIPLO 재단을 G.M.과 S.B.에 기부했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
심장 독소에서  Naja mossambica mossambicaSIGMA ALDRICHC9759
인슐린 BD Micro-Fine+ 바늘용 주사기 30 G x 8 mm - Da 0.3 mLBD324826
Tragacanth GumMP BIOMEDICALS,LLC
2-메틸부탄(이소펜탄)SIGMA ALDRICH78-78-4.
OCT Killik 솔루션 포함 저온 유지 장치바이오 옵티카  05-9801
페더 마이크로톰 블레이드 S35바이오 옵티카  01-S35
유리 슬라이드 Superfrost 플러스Menzel-GLÄ ser09-OPLUS
Dumon #5 미러 마감 펜치 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS11251-23
가위 스트레이트 샤프/샤프2BIOLOGICAL INSTRUMENTS15024-10
가위 Noyes 스트레이트2BIOLOGICAL INSTRUMENTS15012-12
파인 아이리스 가위 스트레이트 샤프/샤프 10.5 cm2BIOLOGICAL INSTRUMENTS14094-11
EukittBio-optica09-00100
슬라이드 커버슬립BIOSIGMAVBS651
자일렌SIGMA ALDRICH214736
에탄올 100%sigma-Aldrich02860-2.5L
헤마톡실라인J.T. BAKER3873
EosinSIGMA ALDRICHHT110116
저온 유지LEICACM3050 S
104792

참고문헌

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