방법 논문

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

DOI:

10.3791/54517

⸱

2016년 9월 10일

 ,  , 
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

이 논문에서

요약

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여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

초록

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대부분의 포유류에서 vomeronasal organ (VNO)은 이종(hetero) 및 conspecific social signals를 모두 감지하는 화학 감각 구조입니다. Vomeronasal sensory neurons (VSNs)는 적어도 3개의 서로 다른 화학수용체 유전자군으로부터 특정 유형의 G protein-coupled receptor (GPCR)를 발현하여 화학감각 단서를 민감하고 특이적으로 검출할 수 있습니다. 이러한 계열은 V1r 및 V2r 유전자 계열뿐만 아니라 추정되는 화학수용체 유전자의 포르밀 펩타이드 수용체(FPR) 관련 서열(Fpr-rs) 계열로 구성됩니다. vomeronasal receptor-ligand 상호 작용 및 downstream signaling의 생리학을 이해하려면 각 특정 VSN 클래스에 내재된 생물물리학적 특성을 식별하는 것이 필수적입니다.

여기에 설명된 생리학적 접근 방식은 형질전환 마우스 라인(Fpr-rs3-i-Venus)을 사용하여 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있습니다. 그러나, 이 프로토콜의 사용은 이 특정 계통에 국한되지 않으며, 따라서 다른 유전자 변형 계통 또는 야생형 동물로 쉽게 확장될 수 있다.

서론

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대부분의 동물들은 주변 환경과 상호 작용하는 화학적 감각에 크게 의존하고있다. 냄새의 감각은 적합한 상대 파트너를 찾아 음식을 평가, 포식자를 피하고 위치에 필수적인 역할을한다. 주 후각 상피 1,2의 Grueneberg 신경절 3, 4, 5, 6 Masera의 중격 기관 및 골코 (vomeronasal) 기관 : 대부분의 포유 동물에서, 후각 시스템은 적어도 네 개의 해부학 적 및 기능적으로 서로 다른 주변 장치 서브 시스템으로 구성된다. VNO 신원, 성별, 사회적 순위 성적 7-10 상태에 대한 정보를 전달하는 화학적 신호를 검출하기에 중요한 역할을 액세서리 후각 시스템 (AOS)의 주연 감각 구조를 포함한다. VNO는 바로 구개 위의 비중격의 기지에 위치해 있습니다. 마우스에서, 그것은 연골 캡슐 11 ~ 13 안에 양자 블라인드 끝 튜브입니다. 기관은 초승달 모양의 중간 감각 epithe 모두 구성VSN을을 항구와 측면에 비 감각 부분의 lium. 모두 상피 사이 좁은 골코 (vomeronasal) 덕트 (14)를 통해 비강에 연결되어있는 점액 가득한 루멘있다. 비 감각 ​​조직에 큰 횡 혈관 음압 15,16 통해 예 VNO 루멘으로 작은 펩티드 또는 단백질과 같은 비교적 대형, 주로 비 휘발성 분자의 진입을 용이하게하기 혈관 펌핑 메커니즘을 제공한다. VNO의 구성 요소는 출생시 존재하고 장기 곧 사춘기 17 전에 성인 크기에 도달합니다. 그러나, 설치류 AOS 이미 청소년의 작동 여부를 18 ~ 20 토론을 계속 될 수 있습니다.

VSN을들은 상피 위치와 그들이 표현 수용체의 종류 모두에 의해 구별된다. VSN을은 수초 축삭과 내강쪽으로 돌출하고 microvillous 돌기 손잡이로 끝나는 하나의 정점 덴 드라이트와 바이폴라 형태를 보여줍니다. VSN 도끼기능 총생의 배측 - 꼬리 끝 부분에있는 연골 캡슐 잎 격막을 따라 상승, 액세서리 후각 망울 (AOB) 21, 22에 소공 질의 판과 프로젝트를 통과 골코 (vomeronasal) 신경을 형성한다. 골코 (vomeronasal) 감각 상피는 두 개의 층으로 이루어져있다 : 꼭대기 층이 내강 측과 항구 V1R- 및 신경 세포를 FPR-RS는 발현의 한 종류지만 모두 모두 가까이에 있습니다. 이 신경 세포는 AOB 23-25의 앞쪽 부분에 G 단백질 α-서브 유닛 G의 αi2와 프로젝트를 같이 발현. G의 αo 함께 더 기저층 명시 V2Rs 또는 FPR-RS1에있는 감각 신경 세포와는 AOB 26 ~ 28의 후방 영역에 자신의 축삭을 보냅니다.

골코 (vomeronasal) 뉴런은 가능성이 소변, 타액 등 다양한 체액으로 분비 및 유체 눈물되어 오히려 작은 semiochemicals 29-33 (V1Rs) 또는 단백질 화합물 34-38 (V2Rs)에 의해 활성화된다 37,39-41 . 현장 실험에서이 VSN을도 포르 밀화 펩티드 및 각종 항균 / 염증 결합 된 화합물 25,42에 의해 활성화되는 것으로 나타났습니다. 또한, 이종 FPR-RS 단백질 (참조 43 참조) 동종 또는 버릇 음식 소스 (25)의 질병에 대한 검출기 등의 잠재적 인 역할을 나타내는 면역 체계로 표현 FPRs과 효능 스펙트럼을 공유 표명했다.

특정 VSN 집단에서 수용체 - 리간드 관계 및 다운 스트림 신호 계곡을 이해하는 기본은 네이티브 환경에서 기본적인 생물 물리학 적 특성에 대한 자세한 평가입니다. 과거에는, 셀룰러 신호의 분석은 크게 형광 마커 단백질을 30,44-49 coexpressing함으로써 뉴런 정의 집단 표시 유전자 변형 동물로부터 혜택있다. 이 프로토콜에서, 형광 마커와 함께 FPR-RS3를 발현하는 형질 전환 마우스 선 (FPR-RS3는-I-금성)가 사용된다.이 접근법은 급성 관상 VNO 조직 슬라이스 단일 뉴런 패치 클램프 기록을 이용하여 광학적으로 식별 가능한 세포 집단의 전기 생리 학적 분석을 수행하기 위해 이러한 유전자 변형 마우스 균주를 사용하는 방법을 예시한다. 공기 압력 중심의 멀티 배럴 관류 시스템 감각 자극 및 약리 에이전트는 녹음 중, 빠른 가역과 초점 신경 자극하거나 억제 할 수 있습니다. 슬라이스 제제의 전체 세포 레코딩은 셀의 기본 환경에서 고유 특성, 전압 - 활성화 컨덕턴스의 상세한 분석뿐만 아니라, 활동 전위 방전 패턴을 허용한다.

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프로토콜

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모든 동물의 절차는 실험 목적으로 사용되는 동물의 보호 (지침 6백9분의 86 / EEC)와 함께 추천 유럽 실험 동물 과학 연맹 (FELASA)에 의해 제시에 지역 및 유럽 연합 (EU) 법률을 준수했다. C57BL / 6 마우스와 FPR-RS3 - 난 - 금성 마우스 모두 음식과 물을 가능한 광고 무제한와 12 시간 조명 / 어두운주기에 실온에서 남녀의 그룹에 보관 하였다. 실험을 위해 섹스 중 젊은 성인 (6~20주)를 사용 하였다. 명백한 성별에 따라 차이가 관찰되지 않았다.

1. 솔루션 준비

  1. 세포 외 용액 S 1 준비 : 4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (145)의 NaCl, 5 KCl을 1 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 10 HEPES (mm 단위)를 함유하는 세포 외 완충 용액 (HEPES)을; pH가 7.3 (NaOH로 조정) (혈당 조절) 삼투압 = 300 mOsm.
  2. extracellu 준비LAR 용액 S 2 : Carbogen - 산소 (95 % O 2, 5 % CO 2) CaCl2를 1 황산 125 염화나트륨 25 (단위 : mm)의 NaHCO3 5의 KCl, 1을 포함하는 세포 외 용액 5 BES; pH는 7.3; (혈당 조절) 삼투압 = 300 mOsm.
  3. 조직 삽입을 위해 4 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스 용액 (S 3) 준비 : 4 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스를. 2g는 자기 교반기와 함께 100 ㎖ 유리 실험실 병 S (1)의 50 ml의 아가 로스 겔 둘러 녹인다. 아가로 오스를 용융, 약 20 분 동안 또는 솔루션을 교반하면서 투명하게 될 때까지 70 ° C에서 (뚜껑을 밀폐하지으로) 수조에 병을 넣어. 냉각 추가로 사용할 때까지 42 ° C에서 두 번째 물을 욕조에 녹은 아가로 오스를 유지합니다.
  4. 세포 내 솔루션 S 사를 준비합니다 피펫 솔루션 2 (무료 칼슘 2 + = 110 ㎚) 1 EGTA (143)의 KCl, 2 KOH, 0.3 염화칼슘, 10 HEPES, 2 MgATP (mm 단위)을 포함, 1 NaGTP;pH가 7.1 (KOH로 조정) 삼투압 =이 290mOsm.
  5. 수정 / S (1)의 조성물을 조정 개별 실험 설계 (예를 들어, 약리학 적 차단제 전압 작동 전류의 특정 유형을 분리하기 위해)에 따라 S 2 및 S (4).

2. 작업 준비

  1. 온도와 pH를 조정하고 지속적 네이트 솔루션 얼음에 S 2 적어도 30 분 전에 해부에, 장소 슬라이스 저장 챔버를 산소로 입력합니다.
  2. S 2와 설정을 기록에 슬라이스 superfusion에 대한 저장소를 작성하고 지속적으로 산소를.
  3. 해부하기 전에, S 2 vibratome 챔버를 채우고 실 주위에 얼음 조각을 정렬합니다. 또한, vibratome 챔버에 챔버를 산소로부터 예비 얼음 차가운 산소 솔루션을 전송하고 지속적으로 산소로 유지합니다.
  4. 수술 도구와 소모품을 정렬합니다.
  5. 해부 아래에 얼음 젤 팩을 배치현미경, 접시의 바닥에 얼어에서 VNO 조직을 방지하기 위해 종이 타월로 다룹니다.
  6. 간략 70 % 에탄올과 증류수로 세척하고 vibratome 마운트하여 면도 면도날. 모든 슬라이스 세션에 장착합니다.

3. VNO 해부 및 포함

  1. 2 CO 날카로운 외과 가위를 사용하여 목을 벨에 짧은 노출에 의해 동물을 희생. 참고 : 중요 얼음에 VNO 캡슐 퍼팅에 동물을 희생에서 시간으로,보다 2 분으로 시간을 최소화 할 수 있습니다. 조직의 생존을 유지하기 위해 30 분 이내에서 아가 모두 완전히 해부 VNOs를 포함.
  2. 큰 수술 가위로 아래턱을 제거합니다. 입 캐비티를 통해 입력하고 개별적으로 각면의 하악 뼈와 근육을 잘라.
  3. 거꾸로 큰 페트리 접시에 머리의 나머지 부분을 놓습니다.
  4. 위턱과의 더 나은 액세스하는 매체 집게로 코의 선단 주변의 피부를 끌어낼앞니.
  5. 주동이의 방향 (그림 1A)에서 ~ 45 ° 각도로 앞니의 가장 큰 부분을 절단하는 뼈 가위를 사용합니다. 이 비강에서 VNO 캡슐의 제거를 용이하게한다.
    주 : VNO 캡슐의 선단부의 손상을 방지하기 위해 치아의 뿌리를 절단하지 않는다.
  6. 중간 집게와의 주동이의 부분에 강성 상부 미각을 잡고 조심스럽게 평평한 각도 (그림 1B)에서 다시 한 조각의 껍질.
    참고 : 반복적으로 얼음처럼 차가운 S 2와 린스.
  7. 보습 뼈의 뼈와 턱의 끝 사이의 뼈 융합을 잘라 마이크로 스프링 가위를 사용합니다. VNO 캡슐에 왼쪽과 오른쪽 측면 모두에서 작은 단계에 뼈를 잘라 바깥쪽으로 멀리 VNO에서 조심스럽게 가리키는 끝의 곡선 부분에 가위 팁을 삽입합니다.
  8. VNO 캡슐을 제거하려면, 꼬리 부분에 보습 뼈 뼈를 잘라 마이크로 스프링 가위를 사용하여 조심스럽게 N 밖으로 보습 뼈 뼈를 들어 올려매체 집게를 사용하여 ASAL 공동. 즉시 절개의 나머지 단계를 수행 할 것입니다 얼음 젤 팩에 스테레오 현미경으로 작은 페트리 접시에 VNO을 전송합니다.
  9. 마르지 조직 않도록 빙냉 S (2)의 소량의 VNO 린스.
  10. 매체 집게와 보습 뼈 뼈의 뒤쪽을 잡아하여 VNO 연부 조직을 포함하는 연골 캡슐을 분리합니다. 모두 VNOs 사이의 분할 (그림 1D ⅰ) 표시가되도록 지느러미보기를 캡슐을 배치합니다.
  11. 뒷부분에 아래로 고정 보습 뼈 뼈를 유지하면서 중앙 뼈에서 모두 연골을 VNO 캡슐을 분리하는 미세 집게의 끝 부분을 사용합니다.
    참고 : 연골 캡슐의 가장자리에 집게를 사용하여 섬세한 감각 상피가 쉽게 손상 될 때 연골 관통하지 않도록 매우주의해야합니다.
  12. 두 VNOs이 분리되면, 전나무을 캡슐화 연골을 제거 시작t VNO.
  13. 하나의 미세 집게로 캡슐의 상단 가장자리를 잡고 이전에 보습 뼈 뼈 (내측)에 부착 된 연골 벽을 멀리 분할합니다.
  14. 연골은 접시의 바닥에 그 곡선 측면과 함께 VNO를 설정하고 안전하게 집게를 사용하여 한 쪽의 연골을 아래로 고정 나머지 제거합니다. 조심스럽게 조직과 연골 사이의 연결을 느슨하게 연골과 VNO 사이에 매우 평평한 각도로 뒤쪽에서 두 번째 미세 집게를 이동합니다.
  15. 천천히 감각 상피 손상을 방지하기 위해, 자사의 꼬리 끝에서 그것을 잡고 멀리 연골에서 VNO 껍질.
  16. VNO는 캡슐에서 움직여되면, 슬라이스 과정에서 아가로 오스 주변에서 조직을 분리합니다 연골의 나머지 조각으로 남아있는 모든 작은 연골 부분을 제거해야합니다.
  17. 조직 손상을 방지하기 위해 제 해부 VNO에 빙냉 S (2)의 작은 방울을 놓는다. 측면 줘야에 큰 혈관난 장기가 그대로이고 심하게 해부 (그림 2A ⅱ) 중에 손상되지 않았 음을 나타내는 표시됩니다. 혈관이 손상있어 경우, 여전히 한 전체 형태가 명확하게 손상되지되었을 때 VNO 슬라이스로에 수행 할 가치가있을 것입니다.
  18. 즉시 두 번째 VNO를 해부하다.
  19. VNOs을 포함하려면, 녹은 S 3 림에 모두 작은 배양 접시를 작성 (42 ° C에서 물을 욕조에 저장된 1.3 참조).
  20. 감각 상피의 손상을 방지하기 위해 미세 집게로 넓은 꼬리 끝에있는 VNO를 잡습니다.
  21. 아가로 오스에 VNO을 담그고 세포 용액의 필름뿐만 아니라, 그 표면에서 기포를 제거하기 전후 수평으로 여러 번 이동.
  22. 접시의 바닥을 향하게 꼬리 끝이 수직으로 VNO를 놓습니다. 대신 직접 집게로 VNO 곤란의, 가까운 proximi의 집게 팁을 이동하여 방향을 조정VNO에 타이.
    참고 :이 실험 기간 동안 감각 뉴런에 조각 평면과 접근성을 결정으로 삽입시 방향이 중요합니다.
  23. 겔 얼음 팩에 요리를 놓고 아가로 오스가 응고 될 때까지 기다립니다.
    참고 : 아가로 오스는이 주변 아가로 오스에서 조직을 분리하는 바와 같이 응고 시작되면 VNO 방향을 변경하지 마십시오.

4. 코로나 VNO 조직 슬라이스

  1. 큰 페트리 접시의 뚜껑에 작은 접시에서 아가로 오스 블록을 제거하는 작은 주걱을 사용하여, 거꾸로 위쪽으로 향하도록 VNO의 꼬리 끝을 떠나 아가로 오스를 뒤집습니다.
  2. 외과 용 메스 (선단 3-4 mm의 바닥 8-10 mm)를 사용하여 피라미드 형상으로 블록을 잘라. 포함 된 조직이 손상되지 않도록주의하십시오.
  3. vibratome 표본 판의 중앙에 피라미드 모양의 블록을 수정하고 접착제가 완전히 마를 때까지 ~ 1 분을 기다려야 슈퍼 접착제를 사용합니다.
  4. 슬라이싱 C에 시료 판을 이동hamber 따라, 두 번째 VNO을 준비합니다. 사용까지 4 ° C에서 두 번째 시료 접시를 유지합니다.
  5. 두께 : 다음 설정을 사용하여 진동 블레이드 마이크로톰 사용하여 150 ~ 200 μm의; 속도 : 3.5 AU = 0.15 mm / 초; 주파수 = 75 Hz에서 7.5 AU. 간단히 해부 현미경 슬라이스 형태를 검사 한 후 사용할 때까지 산소로 챔버에 조각을 전송합니다. 조각은 몇 시간 동안 유지 될 수있다.

5. 단일 세포 전기 생리 레코딩

  1. 녹화 내용 수침 목표 Dodt 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 및 에피 - 형광뿐만 아니라 냉각 CCD 카메라를 구비 한 직립 고정 스테이지 현미경을 사용한다. 데이터 수집, 패치 클램프 증폭기 헤드 단, AD / DA 인터페이스 보드 (기록 소프트웨어 등)를 PC를 사용한다.
  2. 10 ~ 20 패치 피펫 (4-7 MΩ)의 재고를 준비합니다. 붕규산 유리 모세관에서 풀 피펫 (1.50 mm 외경 / 0.86 mm의 ID) 날기microforge와 조지아 마이크로 피펫 풀러와 화재 - 폴란드어.
    참고 : 오히려 작은 VSN을 패치 할 때 화재 피펫 팁을 연마하는 것이 중요하다. 이것은 고 저항의 밀봉을 얻기 위해 부압을인가하는 경우에 세포막을 파열을 방지하는 것을 도울 것이다. 피펫 구멍을 연마 한 후 약 1 ㎛해야합니다.
  3. 사용할 때까지 손상 및 먼지 축적을 방지하기 위해 피펫 저장 항아리에 피펫을 유지합니다.
  4. 솔루션 저수지를 채우고 실험 설계에 따라 튜브에 의해 관류 시스템을 준비합니다.
    참고 :이 강하게 전기 생리 녹음에 방해가되므로 완전히 튜브에서 공기 방울을 제거합니다.
  5. ~ 3 ml / 분의 흐름을 달성하기 위해 압력을 조정합니다.
    참고 : 높은 압력이 전기 생리 레코딩의 조직 절편의 이동뿐만 아니라 종료의 원인이됩니다.
  6. 영상 실에 VNO 슬라이스를 전송하고 0.1 mm 두께 SYNT와 유선 스테인레스 스틸 앵커를 사용하여 조각의 위치를​​ 고정hetic 섬유 (그림 2B - C).
    참고 : 합성 섬유 스레드 중 하나가 아니라 슬라이스를 둘러싼 아가로 오스와 조직 절편을 포함하지 마십시오.
  7. 목욕 응용 프로그램을 통해 실온에서 산소 S 2로 설정하고 지속적으로 superfuse 슬라이스를 기록에 전송 영상 실.
  8. 욕 용액을 일정한 교류 느린 시키되, 용액의 표면에 흡착 모세관을 조정한다. 8에서 1 멀티 배럴 "관류 연필"위 혈관 (그림 2C, 3A) (50)를 포함하는 VNO 슬라이스의 비 감각 부분에 가까운를 조정합니다. 반대 방향에서 슬라이스를 직면 할 재관류 연필 기록 피펫을 주선 도움이 될 것입니다.
  9. 기준 전극 (150 mM의 KCl을 가득) L 자형 한천 다리를 사용하여 목욕 솔루션을 연결합니다.
  10. 피펫 솔루션 S 4 패치 피펫을 입력합니다.
  11. 코팅을 긁어없이 머리 스테이지에 연결된 염화은 코팅 패치 전극 위에 피펫을 탑재 단단히 연결합니다.
  12. 약간의 긍정적 인 압력을 적용 (약 10 ml의 플라스틱 주사기 1 ml)을 욕조에 들어가기 전에 패치 피펫합니다.
  13. (그림 2D)을 타격하지 않고 목표를 잠수함 할 수 있도록 충분히 미세 조작기를 이용하여 욕조에 피펫을 낮 춥니 다.
  14. 머리 단계에 연결된 전기 생리학 소프트웨어를 사용하여 (4-7 MΩ 사이의 R 핍) 피펫 저항을 모니터링합니다.
    참고 : R 핍 인 경우 <4 MΩ 유리 팁이 끊어집니다. R의 PIP가> 10 MΩ 인 경우, 팁은 대부분 막혀 상기 피펫은 교체되어야한다.
  15. 적외선에 최적화 된 미분 간섭 대비 (DIC)을 사용하여 CCD 카메라와 VNO 슬라이스를 시각화하고 형광 조명을 사용하여 FPR-RS3 - 난 - 금성 (유사 표시 뉴런 또는) 발현 세포를 식별적절한 필터 큐브.
  16. 초점과 목표 형광 또는 비 형광 세포는 실험 설계에 따라 달라집니다.
  17. 세포체 접근 최대 감도 핸드 휠을 사용한다. 피펫 팁이 가까이에 일단 긍정적 인 압력으로 인해, 셀 소마 막에 작은 함몰이 표시됩니다.
  18. 정압 놓고 고 저항 시일 (1-20 GΩ)를 얻기 위하여 세포막 빨아 약간 부압을 적용한다. 세포막을 파괴하고, 전체 셀 구성을 설정하는 짧은 부드러운 흡입을 적용한다.
  19. 실험 기간 동안 지속적으로 액세스 저항을 모니터링합니다.
    참고 : 작고 안정적인 접속 저항을 나타내는 신경 세포 포함 (R 입력 ≤3 %를, 변화 <실험의 과정을 통해 20 %) 분석에 있습니다.

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결과

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정의 된 세포 집단의 생물 물리학 적 및 생리 학적 특성에 대한 통찰력을 얻으려면, 우리는 마우스 VNO (- 2 그림 1)의 급성 관상 조직 조각을 수행합니다. 절개 후, 슬라이스는 몇 시간 동안 빙냉 산소 세포 외 용액 (S 2)에 유지 될 수있다. 녹화 설정에서 신선한 산소 솔루션 일정한 교환 (그림 2D)은 실험을 통해 조직의 생존을 보장합니다. 우리는 여기에 형질 전환 마우스 모델 (FPR-RS3 - 난 - 금성)를 사용한다. 이 변형 같이 발현 FPR-RS3와 형광 마커 단백질, 감각 뉴런의 정의 된 인구의 광학 식별을 가능하게하는 FPR-RS 유전자 가족 (그림 3)의 원형 부재 VSN을. 전기 생리 학적 기록은 단일 세포 수준에서 심층 분석을위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 게이트 전압 전류 분석 ...

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토론

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VNO는 semiochemicals을 감지하는 화학 감각 구조입니다. 현재까지, 서 골코 (vomeronasal) 수용체의 대부분은 단지 몇 수용체 - 리간드 쌍은 식별 된대로 deorphanized 일이다. 그 중 V1rb2가 남성 비뇨기 페로몬 2- 헵 타논 (30)에 의해 구체적으로 활성화되도록 설명했다 V2rp5이 남성 특정 페로몬 ESP1 57뿐만 아니라 SYFPEITHI V2r1b과 V2rf2가 MHC 펩타이드에 의해 활성화 될뿐만에 의해 활성화되는 48 SEIDLILGY (58) 각기. 수용체 - 리간드 관계와 신호​​ 전달을 이해하는 전제 조건은 네이티브 환경에서 정의 된 VSN 인구의 생물 물리학 적 특성에 대한 지식이다. 수동 및 능동 막 특성, 전압 - 게이트 이온 전도도 및 활동 전위 방전 패턴 수용체 신경 세포가 자극을 화학 감각에 반응되는 수단과 범위를 정의합니다. 전기 생리 급성 조직 조각에서 녹음하고, 특히, 사람르 셀 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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FPR-rs3-i-venus 마우스 라인을 생성해 준 Ivan Rodriguez와 Benoit von der Weid에게 건설적인 비판과 유익한 토론에 감사드립니다. 이 연구는 폭스바겐 재단(Volkswagen Foundation, I/83533), 독일 재단(Deutsche Forschungsgemeinschaft, SP724/6-1), 독일 연방 및 주 정부의 엑설런스 이니셔티브(Excellence Initiative)의 보조금으로 지원되었다. MS는 폭스바겐 재단의 리히텐베르크 교수입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>화학
아가로스(저겔화 온도)PeqLab35-2030
ATP(Mg-ATP)시그마-알드리치A9187
비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES)시그마-알드리치B9879
염화칼슘시그마-알드리치C1016
에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA)시그마 - 알드리치E3889
포도시그마 - 알드리치G8270
GTP (Na-GTP)시그마 - 알드리치51120
(2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)시그마 - 알드리치H3375
염화 마그네슘시그마 알드리치M8266
염화칼시그마-알드리치P9333
수산화칼시그마-알드리치03564
염화나트륨시그마-알드리치S7653
탄산수소시그마-알드리치S5761
수산화나트륨시그마-알드리치S8045
<강>이름Company카탈로그 번호코멘트
수술 도구 및 소모품
대형 페트리 접시, 90mmVWR참수, VNO 캡슐 해부
소형 페트리 접시,VWR뚜껑, 아가로스에 삽입하기 위한 접시
날카로운 대형 수술용 가위Fine Science Tools참수, 아래턱 제거
강한 뼈 가위Fine Science Tools절단 앞니
중간 집게, Dumont 핀셋 #2Fine Science Tools피부와 입천장 제거
마이크로 스프링 가위, 8.5 cm, 곡선형, 7 mm 칼날 VNO를 잘라내는Fine Science Tools
두 쌍의 미세한 집게, Dumont 핀셋 #5연골 캡슐에서 VNO를 해부하는Fine Science Tools
작은 스테인리스 스틸 주걱아가로스 블록과 조직 조각을 다루는Fine Science Tools
아가로스 블록을 피라미드 모양으로 자르수술용 메스
NameCompany카탈로그 번호코멘트
Equipment
AmplifierHEKA ElektronikEPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)Science Products
CCD-cameraLeica MicrosystemsDFC360FX
필터 큐브, 여기: BP 450-490, 억제: LP 515Leica MicrosystemsI3
형광 램프Leica MicrosystemsEL6000
핫 플레이트 자기 교반기Snijders34532
Microforge NarishigeMF-830
마이크로 매니퓰레이터 장치 루이그 & 노이만SM-5
마이크로피펫 풀러, 수직 투스텝NarishigePC-10 
현미경Leica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
소음 제거기 50/60 Hz (HumBug)Quest Scientific
Objective Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
오실로스코프TektronikTDS 1001B
오스모미터 GonotecOsmomat 030
관류 시스템 8-in-1AutoMate Scientific
pH 미터 5개의 쉬운메틀러 톨레도
피펫 저장 항아리세계 정밀 기기e212
기록 챔버 루이그 & NeumannSlice 미니 챔버
면도날Wilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
Oxygenating slice 보관 챔버; 대체 상업용 챔버는 다음과 같습니다: 예: , BSK1 Brain Slice Keeper(Digitimer) 또는 Pre-chamber(BSC-PC; Warner Instruments)맞춤형
실체 현미경Leica MicrosystemsS4E
트리거 인터페이스 HEKA ElektronikTIB-14 S
비브라톰 라이카 마이크로시스템즈VT 1000 S
수조 멤머트WNB 45
당 륨 륨 나트륨 VNO 해부용 35mm  는

참고문헌

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