여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
대부분의 포유류에서 vomeronasal organ (VNO)은 이종(hetero) 및 conspecific social signals를 모두 감지하는 화학 감각 구조입니다. Vomeronasal sensory neurons (VSNs)는 적어도 3개의 서로 다른 화학수용체 유전자군으로부터 특정 유형의 G protein-coupled receptor (GPCR)를 발현하여 화학감각 단서를 민감하고 특이적으로 검출할 수 있습니다. 이러한 계열은 V1r 및 V2r 유전자 계열뿐만 아니라 추정되는 화학수용체 유전자의 포르밀 펩타이드 수용체(FPR) 관련 서열(Fpr-rs) 계열로 구성됩니다. vomeronasal receptor-ligand 상호 작용 및 downstream signaling의 생리학을 이해하려면 각 특정 VSN 클래스에 내재된 생물물리학적 특성을 식별하는 것이 필수적입니다.
여기에 설명된 생리학적 접근 방식은 형질전환 마우스 라인(Fpr-rs3-i-Venus)을 사용하여 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있습니다. 그러나, 이 프로토콜의 사용은 이 특정 계통에 국한되지 않으며, 따라서 다른 유전자 변형 계통 또는 야생형 동물로 쉽게 확장될 수 있다.
서론
대부분의 동물들은 주변 환경과 상호 작용하는 화학적 감각에 크게 의존하고있다. 냄새의 감각은 적합한 상대 파트너를 찾아 음식을 평가, 포식자를 피하고 위치에 필수적인 역할을한다. 주 후각 상피 1,2의 Grueneberg 신경절 3, 4, 5, 6 Masera의 중격 기관 및 골코 (vomeronasal) 기관 : 대부분의 포유 동물에서, 후각 시스템은 적어도 네 개의 해부학 적 및 기능적으로 서로 다른 주변 장치 서브 시스템으로 구성된다. VNO 신원, 성별, 사회적 순위 성적 7-10 상태에 대한 정보를 전달하는 화학적 신호를 검출하기에 중요한 역할을 액세서리 후각 시스템 (AOS)의 주연 감각 구조를 포함한다. VNO는 바로 구개 위의 비중격의 기지에 위치해 있습니다. 마우스에서, 그것은 연골 캡슐 11 ~ 13 안에 양자 블라인드 끝 튜브입니다. 기관은 초승달 모양의 중간 감각 epithe 모두 구성VSN을을 항구와 측면에 비 감각 부분의 lium. 모두 상피 사이 좁은 골코 (vomeronasal) 덕트 (14)를 통해 비강에 연결되어있는 점액 가득한 루멘있다. 비 감각 조직에 큰 횡 혈관 음압 15,16 통해 예 VNO 루멘으로 작은 펩티드....
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프로토콜
모든 동물의 절차는 실험 목적으로 사용되는 동물의 보호 (지침 6백9분의 86 / EEC)와 함께 추천 유럽 실험 동물 과학 연맹 (FELASA)에 의해 제시에 지역 및 유럽 연합 (EU) 법률을 준수했다. C57BL / 6 마우스와 FPR-RS3 - 난 - 금성 마우스 모두 음식과 물을 가능한 광고 무제한와 12 시간 조명 / 어두운주기에 실온에서 남녀의 그룹에 보관 하였다. 실험을 위해 섹스 중 젊은 성인 (6~20주)를 사용 하였다. 명백한 성별에 따라 차이가 관찰되지 않았다.
1. 솔루션 준비
- 세포 외 용액 S 1 준비 : 4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (145)의 NaCl, 5 KCl을 1 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 10 HEPES (mm 단위)를 함유하는 세포 외 완충 용액 (HEPES)을; pH가 7.3 (NaOH로 조정) (혈당 조절) 삼투압 = 300 mOsm.
- extracellu 준비LAR 용액 S 2 : Carbogen - 산소 (95 % O 2, 5 % CO 2) CaCl2를 1 ....
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결과
정의 된 세포 집단의 생물 물리학 적 및 생리 학적 특성에 대한 통찰력을 얻으려면, 우리는 마우스 VNO (- 2 그림 1)의 급성 관상 조직 조각을 수행합니다. 절개 후, 슬라이스는 몇 시간 동안 빙냉 산소 세포 외 용액 (S 2)에 유지 될 수있다. 녹화 설정에서 신선한 산소 솔루션 일정한 교환 (그림 2D)은 실험을 통해 조직의 생존을 보장합니다. 우리는 여기에 형질 전환 마우스 모델 (FPR-RS3 - 난 - 금성)를 사용한다. 이 변형 같이 발현 FPR-RS3와 형광 마커 단백질, 감각 뉴런의 정의 된 인구의 광학 식별을 가능하게하는 FPR-RS 유전자 가족 (그림 3)의 원형 부재 VSN을. 전기 생리 학적 기록은 단일 세포 수준에서 심층 분석을위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 게이트 전압 전류 분석 .......
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토론
VNO는 semiochemicals을 감지하는 화학 감각 구조입니다. 현재까지, 서 골코 (vomeronasal) 수용체의 대부분은 단지 몇 수용체 - 리간드 쌍은 식별 된대로 deorphanized 일이다. 그 중 V1rb2가 남성 비뇨기 페로몬 2- 헵 타논 (30)에 의해 구체적으로 활성화되도록 설명했다 V2rp5이 남성 특정 페로몬 ESP1 57뿐만 아니라 SYFPEITHI V2r1b과 V2rf2가 MHC 펩타이드에 의해 활성화 될뿐만에 의해 활성화되는 48 SEIDLILGY (58) 각기. 수용체 - 리간드 관계와 신호 전달을 이해하는 전제 조건은 네이티브 환경에서 정의 된 VSN 인구의 생물 물리학 적 특성에 대한 지식이다. 수동 및 능동 막 특성, 전압 - 게이트 이온 전도도 및 활동 전위 방전 패턴 수용체 신경 세포가 자극을 화학 감각에 반응되는 수단과 범위를 정의합니다. 전기 생리 급성 조직 조각에서 녹음하고, 특히, 사람르 셀 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
FPR-rs3-i-venus 마우스 라인을 생성해 준 Ivan Rodriguez와 Benoit von der Weid에게 건설적인 비판과 유익한 토론에 감사드립니다. 이 연구는 폭스바겐 재단(Volkswagen Foundation, I/83533), 독일 재단(Deutsche Forschungsgemeinschaft, SP724/6-1), 독일 연방 및 주 정부의 엑설런스 이니셔티브(Excellence Initiative)의 보조금으로 지원되었다. MS는 폭스바겐 재단의 리히텐베르크 교수입니다.
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재료
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| 염화칼슘 | 시그마-알드리치 | C1016 | |
| 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA) | 시그마 - 알드리치 | E3889 | |
| 포도 | 시그마 - 알드리치 | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | 시그마 - 알드리치 | 51120 | |
| (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) | 시그마 - 알드리치 | H3375 | |
| 염화 마그네슘 | 시그마 알드리치 | M8266 | |
| 염화칼 | 시그마-알드리치 | P9333 | |
| 수산화칼 | 시그마-알드리치 | 03564 | |
| 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S7653 | |
| 탄산수소 | 시그마-알드리치 | S5761 | |
| 수산화나트륨 | 시그마-알드리치 | S8045 | |
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참고문헌
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P.
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