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방법 논문

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

9.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54525

⸱

2016년 10월 13일

 , 
1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes

이 논문에서

요약

우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다.

초록

척수 조각에서 전기 생리 녹음은 네트워크 속성에 휴대 질문의 넓은 범위를 조사 할 가치있는 기술을 입증했다. 우리는 젊은 쥐 (- P11 P2)의 척수의 가능한 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비에서의 motoneurons은 축삭은 척수의 복부 뿌리에서 나오는 유지한다. 이 축색 돌기의 자극은 척수 내에서 motoneuron의 somas과 흥미로운 motoneuron의 담보 침입 다시 전파 활동 전위를 이끌어. antidromic 활동 전위의 기록은 다른 식별 방법을 능가 motoneuron 정체성을 특성화하기 위해, 즉시 확정하고 우아한 방법입니다. 또한, motoneuron의 담보를 자극하는 기타 운동 신경원 또는 R와 척수 내에서 운동 신경원의 담보 타겟을 자극하는 간단하고 신뢰성있는 방법은세포를 enshaw. 이 프로토콜에서는, 우리는 복부 루트 자극의 결과는 motoneuron somas뿐만 아니라 렌쇼 세포 여기에서 antidromic 녹음을 제시한다.

서론

역사적으로, 날카로운 전극을 사용 motoneuron 녹음은 고양이 나 쥐 1이나 마우스 2에서 격리 된 전체 척수에 큰 동물 생체 내에서 실시 하였다. somas 필요한 밀봉과 motoneuron에 직접 액세스를 요구 1980 년대 패치 클램프 녹음 기술의 출현은, 시각적 인지도하에 달성 될 수있다. 따라서, 척수 슬라이스 제조 용이 1990 세 이후 달성되었다. 그러나, 초기 슬라이스 준비는 종종 복부 뿌리의 자극을 허용하지 않았다. 우리가 아는 한, 두 연구는 가로 조각의 복부 뿌리를 성공적으로 자극을보고, 아무도는 마우스 4,5에서 얻은되지 않았다.

motoneuron 풀은 복부 루트를 벗어나지 축삭을 유지하는 - (P11 P2)이 문서에서 우리는 신생아 쥐의 생존 척수 조각을 달성하기 위해 기술을 제시한다. 벤트RAL 루트 자극은 같은 복부 루트에서 배출되는 motoneuron 풀의 somas에 다시 antidromic 활동 전위를 트리거합니다. 또한 motoneuron 담보 타겟 다른 운동 신경원 6-10 및 11-13 렌쇼 세포를 여기. 단지의 motoneurons은 복부 뿌리를 자신의 축삭을 보낼 수 있기 때문에, 우리의 motoneurons (10)를 식별 physiologicaly하는 간단하고 확실한 방법으로 antidromic 활동 전위의 기록을 사용합니다.

motoneuron 신원을 확인하기 위해 잠재적으로 비 포함되거나 잘못된 전기 생리 학적 및 criterions에를 사용하는 것 외에도, 척수 운동 신경원에 대한 최근의 연구는 또한 사후 지루하고 시간 소모적 16 염색에 의존. 이러한 식별은 보통 기록 세포 샘플에 대해 수행된다. 다른 식별 전략은 내인성 운동 신경원 형광을 발현하는 마우스 선에 의존 17 ~ 19. 이 연구는 이미 유전자 변형 마우스 줄을 사용하여 필요한 경우 마커의 발현은 여전히 ​​변수 또는 그러나 유전자 인코딩 된 마커를 사용하여 젊은 나이에 어려울 수 있습니다. 대안 적으로, antidromic 활동 전위 기록은 셀 기록의 시작에서 모든 마우스에서 일상적으로 수행 될 수있다. 고양이, 쥐와 마우스에서 손상 척수 준비 작업 실험자은 확실하게 1950 년대 1,2,20,21 이후 같은 식별 기술을 사용했다. 최적의 조건에서 우리는 기록의 motoneurons의 거의 모든에서 antidromic 활동 전위를 유도 할 수 있었다.

또한, 복부 루트 자극을 확실하게 다른 운동 신경원 22, 23 또는 이들의 타겟을 자극하기 위해 사용될 수있다. 렌쇼 세포 10,24,25. 우리는 여기에 motoneuron somas antidromic에서 활동 전위 기록 형태 복부 루트 자극의 응용뿐만 아니라 렌쇼 세포의 자극을 제시한다.

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프로토콜

실험은 유럽 지침 (609분의 86 / CEE 및 2010-63-UE)과 프랑스 법률에 따라 수행하고, 파리 데카르트 대학 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 척수 조각 준비

  1. 다음 매일 용액 또는 사전에 일일를 준비합니다. 밤새 보관하는 경우, 95 % O 2 5 % CO 2와 거품과는 밀폐 병에 냉장 보관하십시오.
    1. 저 나트륨 인공 뇌척수액 (ACSF) + 준비 : 3 밀리미터의 KCl을 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 230 mM의 수크로오스, 26 mM의 NaHCO3을 0.8 mM의 CaCl2를 8mm로의 MgCl 2, 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 아스코르브 산, 1 ㎜ 나 - kynurenate, 2 mM의 나트륨 - 피루브산. 95 % O 2, 5 % CO 2 (PH 7.4)와 거품. 나-kynurenate 자주 용해하기 어려운 때문에, 재료 표에 나열된 하나를 구입해야합니다.
    2. K-글루코 네이트 SOLU 준비기 : KOH으로 pH 7.4으로 조정 된 130 mM의 K 글루코 네이트, 15 mM의 KCl을 0.05 mM의 EGTA, 20 mM의 HEPES, 25 mM의 글루코스, 1 mM의 나트륨 - kynurenate, 2 mM의 피루브산 나트륨 -.
    3. ACSF 준비 : 130 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을, 2 mM의 CaCl2를, 1 ㎜의 MgCl 2, 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 26 mM의 NaHCO3을 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 아스코르브 산, 2 mM의 나트륨 피루 베이트. 95 % O 2, 5 % CO 2 (PH 7.4)와 거품.
    4. 절개의 시작에 앞서, K 글루코 네이트 용액 80 ㎖에 2 % 한천을 용해하고, 60 ° C로 보온.
  2. 심장 내 관류
    1. 시대에 P2에서 P11에 이르기까지, 여성과 남성 쥐에이 준비를 수행합니다.
    2. 25 mM의 나트륨 펜토 바르 비탈 (50 ㎎ / ㎏) 0.1 ㎖를 복강 내 주사하여 마우스를 마취.
    3. 바늘 또는 테이프를 사용하여, 실리콘 가득 큰 페트리 접시의 뒷면에 마우스를 고정. 해부 현미경을 사용하여해부의 나머지 부분에 대한 전자.
    4. 흉골의 끝을 잡고 가슴을 들어 올려 미세 가위를 사용하여 조리개를 잘라. 그런 마음을 노출 갈비뼈를 절단하여 양쪽 가슴을 엽니 다.
    5. 27G 바늘과 좌심실을 천공하기 전에 우심방을 잘라.
    6. 얼음처럼 차가운 낮은 나 +의 ACSF와 관류. 30 초 후, 낮은 나 + ACSF는 아트리움에서 흐르는 볼 수 있습니다. 나트륨의 낮은 양의 급상승로부터 세포를 방지하고 해부하는 동안 세포 죽음을 줄일 수 있습니다.
    7. 혈액이 배출 될 때 간은 노란색으로 변할 때까지 해부 현미경으로 심장에 바늘을 들고 보관하십시오.
  3. 척수의 해부
    1. 동물의 목을 벨과 그 뱃속에 넣어.
    2. 빨리 다시 (그림 1A1)의 피부를 제거합니다. 두 컷 어깨 통해 가슴 케이지 (그림 1A2)을 추락합니다. 그런 리터로 코드를 잘라동물의 아래쪽에서 리브의 시작하여 척추를 분리하기 위해 꼬리 섹션 가능한 흐름. 다시 동물 플립 여전히 갈비뼈에 붙어있는 내장을 제거합니다.
    3. , 다른 척추 열을 이동시켜 작은 실리콘 가득한 페트리 접시과 지느러미 사이드 (그림 1A)를 누르고 4 곤충 핀을 사용합니다.
    4. 지느러미 측의 추궁 절제술을 수행하고 주동이의 끝 (그림 1B)에서 척수를 노출하는 동안 지속적으로 (약 4 ° C에서) carbogen - 버블 ACSF와 동물을 관류. 이렇게하려면 뼈와 척수 사이의 미세 가위의 끝을 삽입하고 백질 멀리해야하고, 주동이의 끝에서 조금씩 뼈를 잘라. 각면에 다른 뼈의 대역 이미 절단 (그림 1B1)를 멀리 유지하기 위해 핀셋을 사용하는 동안.
    5. 가장 작은 가능한 스프링 가위와 핀셋을 사용하여, 경질을 들어 올려 컷가위로 척수 손상을 방지하기 위해 양쪽에 경질의 느슨한 부분을 잡고있다. rostro - 꼬리 축을 따라 잘라.
      참고 : 두라는 반 투명 연속 막이다 이 나이에 피아 교인이 너무 허약하고 해부와 슬라이스 (그림 1B2) 동안 떨어져 올 것이다.
    6. 경질 제거 사용되면 무딘 유리 또는 플라스틱 팁 부드럽게 하프 컷 척주에 의해 형성된 홈의 왼쪽에있는 코드를 밀어 입쪽 측부터 우측 복부와 등쪽 뿌리 잘라 그들은 (적어도 몇 mm, 그림 1B2) 코드를 입력 곳에서 멀리.
    7. 항상 입쪽에서 꼬리로 이동, 왼쪽의 동작을 반복한다. 왼손잡이 경우, 왼쪽에서 시작하여 오른쪽으로 이동합니다.
  4. 한천에 포함
    1. 척주에서 코드를 슬립. 아래 핀 작은 곤충 핀을 사용하여지느러미와 코드가 최대 표면과 섬세 멤브레인의 조각 여전히 부착 (그림 1C1)을 제거합니다.
    2. 정리하면, 양쪽 끝 (그림 1C2)을 트림. 코드를 조작하고 방향을주의해야 할 코드의 앞쪽 부분에 굽 곤충 핀을 삽입합니다 (그림 1C2에 화살표). 이어서 빙냉 K 글루코 네이트 용액에 척수 옮긴다.
      참고 :이 솔루션은 CSF의 세포 내 성분을 모방와의 motoneurons (26)을 절단됩니다되면 삼투압 충격의 죽어가는 세포를 방지 할 수 있습니다.
    3. 척수는 세포 내 솔루션 내에서되면, 건조 화장실에서 한천로 비커를 타고 얼음과 물의 혼합물에 식혀.
    4. 온도를 측정하는 동안 교반하십시오. 온도가 38 °에 도달하면 곤충 핀을 잡고, 척수 젖어 아래로 주동이의 측면을 배치 C. 척수가 성으로되어 있는지 확인raight 가능한 한 멀리 꼬리 부분, 벽에서 약간 위쪽 (그림 1D1).
    5. 한천은 가능한 한 빨리 응고 할 수 있도록 얼음과 물의 혼합물에서 비커를 남겨주세요. 확인이 코드가 가능합니다 (그림 1D1)만큼 직선으로되어 장소에 유지하고 확인합니다.
  5. 슬라이스
    1. 응고 후, (도 1D2의 화살표) 블록의베이스 코드의 요부와 35 °의 각도로되는 방식으로 척수를 포함하는 한천 블록을 잘라. 등쪽면은베이스 (그림 1D2)에서 멀리 직면해야한다.
      참고 :이에서 나오는 복부 뿌리에 motoneuron 풀의 연속성을 유지하기위한 절차의 중요한 단계이다.
    2. 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 vibratome의 챔버로 블록을 붙인다. K-글루코 네이트 용액에 담가 및 유지 관리 slushed 냉동 K-글루코 네이트 솔루션을 추가목욕 (2 ℃ 이하) 냉장.
    3. (곡률과 큰 직경에 의해 식별) 요추 영역의 400 μm의 두께 슬라이스 - 350 컷. 적절한 방향 (1.4.1를 참조하십시오.)에서 복부 표면에 지느러미로부터 절단 및 조각 지속적으로 더 주동이를 만들기 위해 블레이드를 사용합니다. 일반적으로 2 mm 이상 연장 복부 뿌리를 가진 4-5 적합한 조각이있다. 10 ° 각도, 70 Hz의 진동 주파수와 슬라이스의 10mm / 분 속도 : 다음 매개 변수를 사용합니다.
  6. 잠복
    1. 34 ° C에서 ACSF에 조각을 전송합니다. 약 30 분 후, RT까지 냉각 슬라이스와 기록 세션을 시작한다.

figure-protocol-1
그림 1. 해부
A1 :. 지느러미 열을 노출 뒤의 피부를 제거 A2 :. 어깨와 갈비뼈 절단는 등의 열 B1을 확보하기 : 실리콘 채워진 페트리 접시에 고정 된 척추 열 (최대 지느러미 쪽, 왼쪽 꼬리 쪽) B2 :. 노출 해부 척수와 같은 C1을 :. 척수 고립 . (주동이의 측면 왼쪽) C2 : 삽입 할 준비가 척수 (최대 복부 측면, 왼쪽 주동이의 측면). 주동이의 측면에 작은 곤충 핀을 참고 D1 :.. 한천 비커에서 척수 (주동이의 측면 다우, 바닥을 향하도록 복부 측면) D2 : 내장 척수와 컷 한천 블록. 35 ° 각도를 블록의베이스와 요추 확대 (화살표)와 척수 양식을합니다. 스케일 바 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 상공 회의소에 슬라이스를 배치

참고 : 쉬게ntral 뿌리는 가변 크기입니다.

  1. (40)에서 사전에 170 μm의에 이르기까지 다양한 팁 직경 다양한 피펫의 상자를 준비합니다. 흡입 피펫을 준비 긴 테이퍼 많은 피펫을 준비합니다. 다이아몬드 나이프를 사용하여, 서로 다른 위치에 상처를 만든다. 그 다음 해부 현미경, 핀셋 팁을 타격하여 휴식.
  2. 기록 현미경에서 실을 제거하고 해부 현미경으로 배치합니다.
  3. 흡입 자극 전극에 장착 될 수있는 충분한 길이 (2 mm 이상)의 복부 루트를 포함하는 슬라이스를 선택한다. 복부 뿌리 슬라이스 상향 (그림 2A)의 올바른 방향을 선택하고 조각 (그림 2B) 주변의 한천의 나머지 부분을 남기면서 섬세 복부 뿌리 주변의 한천을 잘라.
    참고 : 한천이 조각보다 더 확고하기 때문에,이 조각의 앵커의 스레드가 한천보다는 이렇게 슬라이스하고 A에 휴식을 할 수 있습니다nchor는 조직을 손상하지 않습니다. 슬라이스의 앵커의 스레드 (그림 2c에 빨간색으로 표시) motoneuron 풀 위에 있는지 확인합니다.
  4. 현미경에 백 챔버를 탑재하고 연속적 일의 속도로 ACSF 기록 챔버를 관류 - RT에서 2 ㎖ / 분. 유리 피펫 ACSF 채우고 주사기에 연결을 사용하여, 복부 루트 (도 2c에서 화살표) 중 하나를 흡인. 복부 루트 좋은 자극을 달성하기 위해, 피펫 팁을 복부 주위 루트 빡빡 할 필요가있다. 하나의 기둥은 자극 전극 (패치 클램핑 전극에 연결된 레퍼런스 또는) 욕 중에서 다른 하나이어야한다.
  5. 목적하는 세포 유형의 패치 클램프 기록을 달성하고 10 previsouly 바와 같이 복부 루트 자극의 효과를 기록한다.
    1. 여기서, 데이터 수집을위한 증폭기를 사용한다. 3 kHz에서 전체 셀 녹음을 필터링합니다. 10 kHz에서 디지털화. curre 다리 저항을 보정NT-클램프 모드.

figure-protocol-2
그림 2. 복부 루트 준비
A : 복부 루트가 위를 향 한천에 포함 된 요추 척수 조각 B :.. 한천 C에서 해방 복부 뿌리와 요추 척수 조각 : 단단히 (화살표) 복부 뿌리 주위에 배치 자극 전극과 요추 척수 조각 . 마우스 기자 R26 톰 (17). 스케일 바 1mm로 교차 chrna2-Cre 호텔 마우스 (28)의 적색 형광을 발현하는 렌쇼 세포의 위치를 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

Antidromic 활동 전위를 사용하여 Motoneuron 정체성의 확인

셀 타겟팅

의 motoneurons은 복부 혼 (그림 2C에 빨간색으로 표시)에서 발견된다. 복부 루트를 형성하는 축삭의 번들에서 시작하고 번들이 완전히 분산과 하나가 (20 μm의 위, 긴 소마 축) 큰 세포를보고 시작 때까지 이동합니다. 4 MΩ로 (3)의 초기 저항의 전극을 사용하여 라운드 건강보고 셀의 전 세포 기록을 달성한다. 사용되는 내부 용액은 140 mM의 K-글루코 6 mM의 KCl을 10 mM의 HEPES, 1 mM의 EGTA, 0.1 mM의 CaCl2를...

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토론

그것은, 신뢰할 수있는 포괄적이고 구체적인 방법으로 하나의 척추 세그먼트에서 motoneuron 풀과 렌쇼 세포의 일방적 인 자극을 허용하기 때문에 척수의 경사 슬라이스가 중요합니다. 또한, 기록의 motoneurons의 빠른 우아하고 비 모호한 식별 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 다른 슬라이스 준비 방법에 비해이 기술의 장점을 강조하며, 우리는이 절차를 수행하는 동안 피할 수있는 가장 일반적인 함정을 강조합니다.

가로 슬라이스를 사용하여 대부분의 연구는 고유의 전기적 특성 3,14,15,29에 자신의 ID를 기반으로. 그러나 이러한 주어진 풀 (알파, 베타 및 감마의 motoneurons 30) 내에서 motoneuron 풀 사이뿐만 아니라 motoneuron 서브 타입 사이에 크게 다릅니다. 따라서, 사이즈의 파라미터를 이용하여 연구가 작은 감마 운동 신경원을 배제 할 가능성이있다. 한편, 쿠퍼 셰링 D축색 돌기 (31...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 사진을 찍는 그들의 도움 마린 마누엘과 올리비아 골드만-Szwajkajzer 감사합니다. 저자는 또한 원고를 교정하기위한 아르 준 Masukar과 토비아스 복을 주셔서 감사합니다. 금융 지원은 라 공들인 (HYPER-국방부, ANR-2010 BLAN-1429-01)을 부어 직원은 국립 제공 한은 NIH - NINDS (R01NS077863)의 티에리 Latran 재단 (OHEX 프로젝트), 근육 병증에 대한 프랑스 협회 ( 승인 번호 16026) 및 대상 ALS는 기꺼이 인정한다. 펠릭스 리로이는 고등 사범 학교, Cachan의에서 "Contrat 박사"의받는 사람이었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Na-kynurenateABCAMab120256다른 브랜드보다 더 잘 용해됩니다
KClSigmaP3911
NaH2PO4SigmaP5655
수크로스 시그마S9378
NaHCO3 시그마S6014
CaCl2 G BiosciencesR040
MgCl2 품질 생물학351-033-721
포도당 시그마G5767
아스코르브산 시그마A5960
Na-피루브산 시그마P2250
K-글루코네이트 시그마P1847
EGTA 시그마E3889
HEPES 시그마H4034
NaCl시그마S9888
한천시그마A9799
QX-314알로몬Q150
Mg-ATP시그마A9187
CsOH시그마232041
Na-GTP시그마51120
글루콘산시그마G1951
세슘 수산화물 솔루션시그마232041
KOH시그마P5958
Vannas 스프링 가위 - 2.5mm FST15000-08경막을 절단하는 데만 사용되며 뼈를 절단하면 손상될 수 있습니다.
자극기A-M 시스템절연 펄스 자극기 모델 2100
진동Campden진동 마이크로톰 7000 - 모델 7000smz-2
은 . 은 기

참고문헌

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