Method Article

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

DOI:

10.3791/54529

⸱

September 20th, 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

Abstract

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작은 분자의 분자 표적을 식별하는 것은 도전적이지만 그들의 작용 메커니즘을 이해하는 데 필요한 단계입니다. 다양한 소분자의 결합 단백질을 성공적으로 규명하기 위해 여러 표적 식별 방법이 개발되어 사용되었지만, 이러한 기술에는 특정 유형의 소분자-표적 상호 작용을 검출하는 데 적합하지 않은 단점이 있습니다. 특히, 세포 용해에 따라 구조가 교란될 수 있는 막 단백질의 상호 작용과 같이 네이티브 세포 조건에 의존하는 비공유 상호 작용은 친화성 기반 표적 식별 방법에 적합하지 않은 경우가 많습니다. 여기에서는 광불안정기를 포함하는 프로브를 사용하여 살아있는 세포의 환경 내에서 소분자 결합 단백질에 공유 가교를 하여 세포 용해 후 상호 작용을 유지할 필요 없이 표적 단백질을 검출 및 분리할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 기초 생물학과 약물 발견의 맥락에서 알려지지 않은 메커니즘을 가진 생물학적으로 흥미로운 작은 분자를 연구하는 데 유용한 도구입니다.

Introduction

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생리 활성 소분자 근본적 셀과 상호 작용하는 하나 이상의 "대상"분자, 가장 일반적으로 단백질의 기능을 변경함으로써 작동한다. 약물 발견에 때 활성 화합물 표현형 선별을 통해 발견되고, 그 화합물의 분자량이 타겟 (들)의 식별은 작용 화합물의 잠재적 부작용의 메커니즘을 이해뿐만 아니라 대한 잠재적으로 발견되지 중요 새로운 생물학 질병 모델을 기본 및 치료제 (1)의 새로운 기계적인 클래스의 개발을위한 방법을 포장. 목표 식별이 치료에 사용하고자하는 약물이 필요하지 않지만, 최근에는 신약 후보 검증 대상이 알려진 경우보다 투자 수익률을 수득 때문에 임상 시험에 성공하고, 가능성이 있음을 점점 인식되고있다 2. 따라서, 작은 식별하는 방법에 대한 관심이 증가되고있다분자 표적 단백질.

고전 목표 식별 실험은 일반적으로 관심의 작은 분자는 수지상에 고정화 비 결합 단백질을 씻어, 나머지 단백질 용출 3를 식별 한 후, 전체 세포 용 해물과 배양 친 화성 정제에 의존한다. 이 기술은 여러 개의 작은 분자들 (4)의 타겟을 식별하기 위해 사용되었지만, 여러 가지 이유로, 범용 대상 ID 방법으로 적합하지 않다. 먼저, 표적 단백질은 작은 분자에 결합하는 능력을 유지하기 위....

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Protocol

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참고 :이 프로토콜은 살아있는 세포에 사용 맥키와 톤턴 (10)에서 적응했다.

배양 된 세포의 1. 준비

  1. (아래 참조) 원하는 샘플 수에 대한 멸균 6 cm 세포 배양 접시를 준비합니다.
    주 : 셀들 중 하나 접시가 처리 조건에 따라 사용되지만, 더 많은 단백질이 2 또는 3 요리 상태별로 준비하고, UV 조사 후 결합 될 수있다 요구되는 경우.
    1. 세포의 최소 3 요리를 준비; DMSO 만 (D) 프로브 처리 만 (P)과 프로브 + 경쟁 (C)와 음성 대조군.
    2. 선택적으로, 아니 UV 컨트롤로 4 번째 접시, 프로브로 치료하지만 자외선에 노출되지 할 준비를합니다.
      주 : 여러 경쟁 분자는 관심 소분자 다른 유사체로서 시험 할 경우, 필요에 따라 추가로 경쟁 판을 준비한다.
  2. 4 ml의 배양 배지에서 배양 접시에 HEK293T 세포를 추가합니다. 350 만 C를 사용하여접시 당 ELL 학생.
    주 : 셀은 실험 시작시 약 100 % 컨 플루 언트되도록 세포의 수가 최대 단백질 수율을 달성하기 위해, 각 세포 유형에 대해 결정되어야한다. HUVEC를 들어, 접시 당 0,300,000 세....

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Results

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여기에 표시된 결과는 이전에 16 게시 된 사용하는의 항진균제 이트라코나졸의 사진 친 화성 프로브를 얻었다. 이러한 결과는 성공적 35 kDa의 막 단백질 전압 가변 음이온 채널 1 (VDAC1)와 같은 주요 이트라코나졸 결합 단백질을 확인하기 위해 살아있는 세포 photoaffinity 라벨링 기술의 사용을 입증한다.

상기 프로토콜은 참가자 분자로서 photolabeling 및 변성 이트라코나졸 용 프로브를 사용하여 이트라코나졸 HEK293T 세포에서 수행 하였다. 설명 된 바와 같이 샘플을 제조 하였다 후, 이들은 분자량 단백질을 분리하기 위하여 SDS-PAGE를 실시 하였다. 왼쪽 분자량 마커 단위는 킬로 달톤 (kDa의)에있다. 첫 차선은 DMSO 제어 시료 (D)이며, 두 번째는 레인 프로브 샘플 (P)이고, 상기 제 차선 대전 샘.......

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Discussion

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약물의 세포 표현형가 알려진 기능에 따라 잠재적 인 대상을 좁힐하는 데 사용되는 하향식, 또는 상향식 (bottom-up), 대상 : 작은 분자의 목표를 확인하는 다른 방법은 크게 두 가지 범주로 분류 할 수 있습니다 화학 물질 또는 유전 적 수단 (3)에 의해 직접적으로 식별됩니다. 하향식 또는 표현형 연구 약물의 영향을 특정 세포 프로세스를 식별 할 수있다 (예를 들면, 전사 / 번역 / DNA 합성, 세포주기 블록 통로 활성화 / 금지 등 시그널링) 소분자의 궁극적 인 표현형을 기초 수도있는 그 과정에 관여하는 단백질에 대한 잠재적 대상 목록을 좁히는 데 도움이됩니다. 그러나, 하향식 접근법의 주요 단점은 이미 이러한 프로세스에 대해 알려진에 의존하므로, 그 기능 특징되지 않았거나 이전에 관여하는 것으로 설명되지 않은 표적에 대해 가압된다는 점이다주어진 프로세스이다.

상향식 접근 방식은 공정한 방식으로 직접 대상을 식별.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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광친화성 라벨링 프로토콜의 설계에 대한 조언을 해주신 Ben Nacev 박사님, 이트라코나졸 광친화성 프로브를 합성해 주신 Wei Shi 박사님, 친화성 풀다운 실험에 대한 조언을 해주신 Yongjun Dang 박사님, 그리고 도움이 되는 의견과 지원을 해주신 J.O.L. 연구소의 다른 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 약리학/독성학 분야의 PhRMA 재단 펠로우십(S.A.H.로)의 일부 지원을 받았습니다. 국립 암 연구소 보조금 R01CA184103; 승무원 의료 연구소(Flight Attendant Medical Research Institute); 전립선암 재단(J.O.L.); 존스 홉킨스 임상 및 중개 연구 연구소(Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research)는 NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)의 UL1 TR 001079 보조금으로 부분적으로 자금을 지원합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)Life Technologies20490상쾌한 하루를 사용하십시오. 4eq NaOH로 물에 100mM 스톡을 준비합니다.
트리스 [(1- 벤질 -1H-1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA)AnaSpec63360-50 t-부탄올과 DMSO의 4:1 비율로 1.7mM 재고를 준비하고 -20 에 보관합니다. °C입니다.
구리 황산염 (CuSO4• 5H2O)랩켐, Inc.LC13440-1물에 50mM 재고를 준비하고 실온에서 보관하십시오.
Biotin-azideClick Chemistry ToolsAZ104-100 DMSO에서 10 mM 재고를 준비하고, -20  °C입니다.
알렉사 플루어 647-아지드 Life TechnologiesA10277DMSO에 1 mM 재고를 준비하고, -20 에 저장; °C입니다.
365nm UV lampSpectrolineFC100자외선 차단 안경은 작동 중 착용해야 합니다.
프로테아제 억제제 정제, EDTA-freeRoche Life Science11873580001물에 50x 용액을 준비하고 -20  °C입니다.
SonicatorBransonSonifier 250출력 1, 듀티 30%로 설정합니다. 
형광 젤 스캐너GE Healthcare Life SciencesFLA 9500적색 레이저를 사용하여 Alexa-fluor 647을 감지합니다.
세제 호환 Dc 단백질 분석 키트Bio-Rad5000112
고용량 Streptavidin Agarose 비즈 Life Technologies20359
Dulbecco's Modified Eagles 배지, 저포도ThermoFisher Scientific11885092
소 태아 혈청, 인증ThermoFisher Scientific26140079
페니실린/스트렙토마이신 용액ThermoFisher Scientific15140122
SDS Sample Buffer (2x)ThermoFisher ScientificLC2676
당

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  2. Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learne....

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Live cell Photoaffinity LabelingSmall Molecule Target IdentificationPhotoaffinity Probe BindingNative Cellular EnvironmentCovalent CrosslinkingHEK 293 T CellsFluorescent Gel ScanningStreptavidin Agarose BeadsSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

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