뇌진탕은 가장 흔한 유형의 외상성 뇌 손상을 나타냅니다. 그러므로, 환자에서 부상의 중요한 특징을 복제하는 반복적인 뇌진탕 동물 모델은 엄격하고, 통제되고, 효율적인 방식으로 뇌진탕을 연구하는 수단을 제공할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌진탕/경미한 외상성 뇌손상(mTBI)이 외상성 뇌손상의 가장 빈번한 발생임에도 불구하고 손상과 그 영향에 대한 지식은 여전히 부족합니다. 뇌진탕에 대한 더 나은 이해를 개발하기 위해 동물은 통제되고 엄격하며 효율적인 모델을 제공하기 때문에 자주 사용됩니다. 연구에서는 손상 매개변수를 변경하여 경미한 부상의 중증도를 자극하기 위해 mTBI를 수행하도록 기존 동물 모델을 조정했습니다. 이러한 모델은 임상 상태와 형태학적으로 유사한 뇌 손상을 생성할 수 있고 손상 중증도의 스펙트럼을 제공할 수 있기 때문에 사용되었습니다. 그러나 환자의 부상과 동일한 특징을 나타낼 수 있는 능력에는 한계가 있습니다. 전통적인 충격 시스템을 사용하여 반복적 인 뇌진탕 부상 (rCHI) 모델은 경증에서 중등도의 인간과 유사한 뇌진탕을 유발할 수 있습니다. 부상 정도는 일시적인 호흡 정지 징후와 함께 의식 상실 기간(LOC)을 측정하여 결정할 수 있습니다. rCHI 모델은 mTBI 효과 및 잠재적 치료법을 결정하는 데 정확성과 단순성을 위해 사용하는 데 유용합니다.
서론
뇌진탕은라고도 가벼운 외상성 뇌 손상 (mTBI), 외상성 뇌 손상 (TBI)의 가장 흔한 발생하고 미국에서 수백만의 사람에 영향을 미친다. 뇌진탕 진단하는 까다로운 일이 될 수 있으며, 충격에 대한 특별한 치료법은 없습니다. 성장 인식 및 스포츠 부상, 군사 전투 및 기타 물리적으로 결합 추구로 인한 경미한 기계적 외상 누적 만성 신경 학적 결과 1, 2를 가질 수 있다는 몇 가지 증거가있다. 그러나, 여전히 뇌진탕과 그 효과에 대한 지식의 부족입니다. 만 신경 학적 평가 및 이미징 평가는 임상 진단에 사용할 수 있기 때문에 현재 방법론은 인간의 병리와 치료의 연구를 제한합니다. 동물 모델은 추가 진단 및 mTBI의 치료의 희망 효율적이고 엄격하고 통제 된 방식으로 뇌진탕을 연구 할 수있는 수단을 제공한다.
연구는 기존의 TBI 적응이러한 제어 대뇌 피질의 영향 (CCI)와 같은 모델은 유체 타악기에 미치는 영향 (FPI), 체중 감소 부상 및 폭발 부상 mTBI을 수행하고 부상 매개 변수를 변경하여 낮은 부상의 심각도를 자극합니다. 이 모델 인해 임상 상태에 형태 학적으로 유사한 뇌 외상을 복제 할 수있는 능력을 사용하는 것이 유리하다; 그러나, 그들은 또한 그들 자신의 한계를 가지고있다. 가속 부상 (체중 감소)에 의해 유도 부상의 심각도는 종종 매우 가변적이다. 온화한 CCI의 두 가지 결과 - 지주막 하 출혈 및 초점 타박상은 - 전형적인 인간의 뇌진탕과 비교할 수 없습니다. 폭발 부상이 노출 3-6 동안 서로 다른 노출 위치 및 피크 압력 측정에 관해서 논쟁 모델뿐만 아니라 변수 보조 부상 상태에서 CCI와 FPI는 임상 적으로 관련없는 개두술을 필요로합니다. 업데이트 진탕 동물 모델을 즉, 임상 setti에 전임상 연구를 번역 할 수 있습니다NG 연구에 필요하다.
가벼운 TBI 모델링의 핵심 문제는 가장 밀접하게 임상 설정에서 부상을 복제 실험 부상의 심각도를 정의하는 것입니다. 최근 다른 연구 그룹은 폐쇄 머리 부상 또는 진탕 머리 부상 (CHI) 모델 7-10을 개발했다. CHI는 개두술없이 CCI의 변형이지만, 여전히 두부 충돌을 생성하는 기존의 전자파 영향 시스템을 사용한다. 카이는 효과 매개 변수를 조정하여 중간에 온화한에 이르기까지 뇌진탕을 유도 할 수 있습니다. 의식 (LOC)의 손실은 호흡 속도 또는 호흡 과도 종단의 감소를 검출함으로써 충격 후 즉시 관찰 될 수있다. LOC의 기간은 상처의 정도를 결정하는 데 사용된다. 본 논문은 자세한 단계별 프로토콜과 대표적인 결과와 함께 마우스의 반복적 인 CHI (rCHI) 모델의 약간 개선 및 업데이트 된 버전이 포함되어 있습니다. rCHI 모델 연구 전략 a를뇌진탕에 의한 병리학 적 변화를 모두 모방 할 수없는 각각의 동물 모델이 없습니다 특히 때문에, mTBI 효과와 잠재적 인 치료를 결정하는데 도움이 다시.
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프로토콜
모든 절차는 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 승인 된 프로토콜 번호 201207692에서 수행 하였다.
1. 동물 관리
- 3-4 개월 된 수컷 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다. 침구, 중첩 재료, 음식과 임의 량의 물을 제공한다. 일정 12 시간 빛 / 12 시간 다크 사이클 22 ° C - 20 제어 주위 온도에 마우스를 유지합니다.
2. 사전 매복 준비
- 전자 정위 충격 장치에 맞춤형 실리콘 고무 코팅 금속 끝을 연결합니다. 팁의 평평한 바닥이 프로브 팁 (그림 1A)의 표면에 평행해야합니다.
- 2.5 %의 이소 플루 란의 유지 보수 마취 다음에 4 % 이소 플루 란과 마우스를 마취. 유량계를 통해 마취를 확인합니다. 과정 제어R 동물까지 마취 수준은 페달 철수 반사의 손실을 보여줌으로써 마취의 수술 수준에 도달.
- 가열 패드에 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. 마취 마우스를 유지하기 위해 깔때기 모양의 코 콘을 사용합니다. 완전히 트리머를 사용하여 머리를 면도. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 바셀린 안과 연고를 사용합니다.
3. 충격 매개 변수 설정
주 : 충격 시스템은 충격 파라미터를 설정하는 제어 박스의 박힘을 수행하기위한 액츄에이터, 및 3 운동 축을 디지털 정위 프레임을 포함한다.
- 4m / 초 충격 장치의 속도를 미리 설정하고 제어 박스에 240 msec의 시간 드웰.
4. 위치 충격 센터
- 39 ° C 부근의 체온을 유지하기 위해 동물의 신체에 따라 소프트 가열 패드를 넣는다. 포르노에 정위 프레임에 마우스를 장착무딘 엔드 귀 막대 전자 위치입니다.
- Z 축 드라이버를 이동하여 마우스의 머리에 가까운 충격 팁을 낮 춥니 다. 대상 시상 봉합 위 좌표의 중간 X- 및 Y 드라이버를 이동시켜 평면 영향 팁 (9 mm 직경)을 조정한다.
- 상하 두 귀 (도 1C) 사이에 그려진 가상 수평선에 평행 한 충돌 팁 확실히 한쪽 가장자리를 만든다. 충격의 중심 (0 mm, 측면 4.5 mm를 간가에 간가 9mm) interfrontal과 lambdoid 봉합 사이의 중앙 시상 봉합의 중간에 해당한다.
5. 충격 깊이 설정
- 정확하게 타격 깊이를 설정하기 위해, 절연 된 실리콘 고무 코팅 충격 팁을 교체 추가 탐침을 사용한다.
- 팁을 전환하기 전에 제로로 디지털 정위 제어판의 X와 Y의 채널을 설정 전환 팁 후 충격의 중심에는 변화가 없다 확인하십시오.
- PROB 이동수동 X 및 Y 축 모터를 이동하여 충격 영역의 중심에 예를 팁.
- 마우스의 꼬리에 클립 접촉 센서.
- 프로브 팁의 충격 부위의 표면에 닿을 때까지 임팩터 (Z 드라이브)를 이동.
- 제로로 정위 제어판의 Z 채널을 설정합니다.
- 수동 X- 및 Y 드라이버까지 X 및 Y 드라이버 (NOT 디지털 정위 조작부 제로 버튼)을 조정하여 다시 충돌 면적에 영향 팁을 이동 (충격 팁 나란히 배치 된)는 0이다.
- 제어 박스에 인입 스위치를 이동시킴으로써, 액추에이터 후퇴. 수동 4mm에 의해 아래로 임팩터 (Z 드라이버)를 이동합니다.
6. 영향
- 컨트롤 박스에 대한 영향 스위치를 눌러 영향을 트리거 4mm의 변형 깊이를 달성한다.
7. 후 매복
- 마우스의 첫 호흡 타이머를 사용하여 충격까지의 시간을 측정한다.
- 악기에서 동물을 제거하고 체온을 유지하기 위해 따뜻한 패드에 배치. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오.
- 깨끗한 케이지로 다시 동물을 반환하기 전에 복구 할 수 있습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 동물을 반환하지 않습니다.
- 관찰하고 매일 쥐를 무게. 쥐가 고통의 흔적이 보일 경우, 복강 1 멜 록시 캄로 주입 - 24 시간 - 2 밀리그램 / 각 12 kg이다.
8. 반복 매복
- 일 4, 7 쥐에게 추가 부상을주고, 초기 손상 (충격 사이에 72 시간 간격) 이후 10.
9. 면역 조직 화학 (IHC)
- Transcardial 관류
- 200m / kg 펜토 바르 비탈로 복강 내 주사를 통해 마우스를 마취.
- 평가 및 발가락 핀치에 의해 수술 평면 마취를 확신합니다. 비서URE 부드럽게 화학 물질 흄 후드 내부에 스티로폼 작업 표면에 앞발과 뒷발을 테이핑으로 누운 자세에서 마우스.
- 다만 쇄골에 칼 모양의 과정을 아래에서 흉부 중간 선을 따라 피부를 통해 절개를합니다. 칼 모양의 과정에서 두 개의 추가 피부 절개를 확인하고 옆으로 복부 흉곽의 기본을 따라 진행합니다.
- 흉강을 열고 흉부 근육과 흉곽을 절단하여 심장을 노출.
- 무딘 집게로 뛰는 심장을 보호하고는 1 - 좌심실에서 2mm 절개를.
- 즉시 우심방에 나비 바늘을 삽입합니다. 천천히 주사기를 밀어 20ml의 식염수의 주입을 시작합니다.
- 식염수에서 4 % 파라 포름 알데히드로 전환합니다. 파라 포름 알데히드의 20 ㎖와 재관류를 계속합니다.
- 마우스를 목을 벨과 가위로 피부를 제거합니다. 뼈 커터를 이용하여 두개골로부터 뇌를 분리.
- 기음절편 ryostat
- -80 ° C에서 최적의 절삭 온도 OCT () 수립 및 동결에 포함 된 뇌 조직. 시상 방향으로 그라 이오 스탯의 뇌를 놓습니다. 잘라 뇌 섹션 5 μm의 두께.
- 더럽히는 것
- 실온에서 1 시간 동안 고정 된 부분을 건조.
- RT에서 1 시간 동안 인산염 완충 식염수 100 2 % 염소 혈청 μL, 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS)로 슬라이드를 부화.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 4 ℃에서 별도로 하룻밤 : (200 일) 또는 항 페리틴 항체 : 다음 안티 GFAP (200 일)와 슬라이드를 품어.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 이어서 바이오틴 - 컨쥬 게이트 화 2 차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 슬라이드를 배양한다.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 이어서 실온에서 30 분 동안 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC) 용액 (1시 50분)로 슬라이드를 배양한다.
- PBS 300 μL와 슬라이드 3 회 반복한다. 8 분 - 그럼 3,3'- 디아 미노 벤지딘 5 (DAB) 기질 용액 (50 ㎖ PBS, 10 μL의 H 2 O 2, 10 mg을 DAB 알약, 사용하기 전에 필터)에 품어. 긍정적 인 세포가 나타날 때까지 현미경 슬라이드를 관찰한다.
- 5 분 동안 천천히 실행 수돗물에 슬라이드를 씻어. 실험실 닦아 청소 슬라이드. 그런 다음 설치 매체와 coverslip에와 섹션을 탑재합니다.
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결과
이 모델 (그림 1 AC)에서, 모든게 완벽 할꺼야 얕은 호흡의 짧은 기간이 있었다. (의식) 의식의 손실은 호흡 속도 또는 정상적인 호흡을 다시 시작하기 전에 호흡의 일시적인 중단의 감소로 정의된다. 머리의 중심에 미치는 영향은 단기 무의식의 원인 (7.5 ± 4.7, ± 5.5, 7.8, ± 8.8 10.2, 개별적으로 각각의 영향에서 9.5 ± 8.0 초, 그림 1D). 마우스의 뇌에 미치는 영향 (그림 2A)로 인한 명백한 구조적 병변 또는 조직 손상이 표시되지 H & E 조직 학적 염색에 의해 정상적인 형태를 보여 주었다. TBI에 대한 응답으로, 성상 세포는 활성화, 증식, 또는 반응성 신경교 증 (11, 12)를 포함하여 어떤 변화를 겪을 것으로 알려져있다. 대 세포 기관 및 두께 시냅스와 증가 glial fibrillary 산성 단백질 (...
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토론
임상 상태에 형태 학적으로 유사한 뇌 손상을 모방하기 위해 사후 뇌진탕 증상이 예상된다. 포스트 뇌진탕의 증상은 일반적으로 두통, 현기증, 현기증, 피로, 기억과 수면 문제, 문제가 집중뿐만 아니라 불안하고 우울한 기분을 포함한다. 신체 증상이 아직 동물 모델에서 측정되지 않을 수 있기 때문에, 모터 및인지 기능, 정서적 행동의 변화는 합리적으로 동물 모델에서 뇌진탕을 평가하기위한 기준으로 사용된다. 이전에보고 된 연구에서, 그것은 rCHI 마우스 모델은 공간 학습, 기억, 불안 8 결핍을 유도 것으로 나타났다. 더 중요한 것은,이 프로토콜에 사용되는 rCHI 모델은 침습적 인 뇌 손상이나 출혈, 출혈, 부종, 또는 급성 세포 죽음 / 조직 손실이 발생할 수 있습니다 둘 다 뇌 구조의 파괴없이 임상 적 설정을 나타냅니다.
다음 성공적으로 일관 concussio 모델링을위한 핵심 팁입니다N 전자 자석 영향 시스템을 사용 / mTBI :
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공개 사항
저자는 공개할 금전적 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Florida Health 보조금(Brain and spinal cord injury research fund) (KKW)의 자금 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취 기계 | Eagle Eye Anesthesia, Inc | 모델 150 | 마취 |
| 전자기 임팩터 | LeicaBiosystems | Impact One 입체 임팩터 | 임팩션 |
| 디지털 입체 기기 | LeicaBiosystems | 39462501 | 마운트 마우스 및 포지셔닝 팁 |
| Sicilone 고무 코팅 금속 팁 | 정밀 도구 및 기타 엔지니어링, Gainesvill FL | 맞춤형 | 임팩트 팁 |
| 리튬 이온 올인원 트리머 | WAHL 홈 제품 | 9854-600 | 면도 마우스 헤어 |
| 페이퍼 클립 | 맞춤형 | 프로브 팁 | |
| 코튼 팁 애플리케이터 | MEDLINE | MDS202055 | 가 있는 스크럽 헤드 |
| ASKURA FINETEK USA INC | 4583 | 조직 임베딩 | |
| 안티 GFAP | Dako | CA93013 | IHC |
| 안티 페리틴 | 시그마 | F6136 | 항체 IHC |
| VECTASTAIN Elite ABC 키트 | Vector laboratories | PK-6100 | IHC 감지 시스템 |
| Permount 마운팅 미디엄 | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Aperio XT ScanScope 스캐너 | Leica Microsystems Inc, | 슬라이드 스캐닝 | |
| Leica AutoStainer XL | Leica 병리학 회사 | ST2010 | H& E 염색 |
| DAB | SIGMA | D3939 | IHC 감지 시스템 |
참고문헌
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