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방법 논문

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

12.2K 조회수

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DOI:

10.3791/54532

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2016년 12월 9일

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1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 종양 저산소증이 전이에 미치는 영향을 직접 테스트하고 그 작용 메커니즘을 해독할 수 있는 동물 모델의 개발을 설명합니다. 여기에 설명된 실험은 유잉 육종에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종양 유형에도 유사한 접근법을 적용할 수 있습니다.

초록

저산소증은 임상적 관찰과 체외 데이터에 의해 유잉 육종(ES)의 전이와 관련이 있지만, 전이성 촉진 효과에 대한 직접적인 증거가 부족하고 정확한 작용 기전이 불분명합니다. 여기에서는 종양 저산소증이 ES 보급에 미치는 영향을 직접 테스트하고 관련된 기본 경로를 조사할 수 있는 동물 모델을 보고합니다. 이 접근법은 잘 정립된 두 가지 실험 전략, 즉 ES 세포의 정소성 이종이식술과 뒷다리 허혈을 유발하는 대퇴동맥 결찰술(FAL)을 결합합니다. 인간 ES 세포를 SCID/베이지색 마우스의 비복근에 주입하고 원발성 종양이 250mm3 크기로 성장하도록 했습니다. 이 단계에서 종양을 절제하거나(대조군) 동물에게 FAL을 투여하여 종양 저산소증을 유발한 후 3일 후에 종양을 절제했습니다. FAL의 효율성은 종양 조직에서 hypoxyprobe-1의 결합이 현저히 증가하고, 심각한 종양 괴사가 발생하며, 원발성 종양 성장의 완전한 억제에 의해 확인되었다. 중요한 것은, 허혈의 이러한 직접적인 영향에도 불구하고, 저산소성 종양으로부터 종양 세포의 향상된 전파가 관찰되었다는 것입니다. 이 실험 전략은 크기는 같지만 저산소증 수준이 현저히 다른 원발성 종양의 전이성 특성을 비교 분석할 수 있습니다. 또한 생체 내에서 전이성 종양 진행 중에 발생하는 저산소증으로 인한 변화에 대한 기계론적 기초를 추가로 평가할 수 있는 새로운 플랫폼을 제공합니다. 또한, 이 모델은 ES 세포를 사용하여 확립되었지만, 이 실험 전략은 혈액 공급 경로가 잘 정의된 부위에 종양이 정소적으로 이식된 종양뿐만 아니라 다른 육종에 대한 저산소증의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있을 것으로 기대합니다.

서론

유잉 육종 (ES)은 어린이와 청소년에 영향을 미치는 공격적인 악성 종양이다. 1 종양은 일반적으로 사지에, 연부 조직과 뼈에 개발할 수 있습니다. 전이의 존재 ES 환자를위한 가장 강력한 부작용 예후 인자이지만, 그 현상의 기초가되는 메카니즘은 불분명. 이 종양의 저산소증은 ES의 진행에 연루 몇 가지 요소 중 하나입니다. ES 환자의 종양 조직 내에서 비 ​​- 관류 영역의 존재는 불량한 예후와 연관된다. (3) 시험관에서 저산소증은 ES 세포의 침윤을 증가시키고 프로 전이 유전자의 발현을 트리거합니다. 4-6 그러나, 증거의이 라인에도 불구하고, 저산소증 유도 ES 진행 및 확산에 대한 직접적인 증거는 존재하지 않는다. 또한, 미지의 저산소증은 현재, 이러한 효과가 발휘되는 메커니즘. 따라서, 우리는 시험 관내 데이터와 임상 obser에 존재 사이의 갭을 채우기 위해 생체 내 모델을 만들었습니다적인 혁신. 이 모델 시스템은 생체 병리학 적 및 분자 분석 (도 1)와 결합하여 생체 내에서 종양 진행 및 전이를 수행하는 자기 공명 영상 (MRI)를 사용하여, 자연 환경에서 발생하는 종양에 대한 저산소증의 효과를 직접 테스트 할 수있다.

ES의 확립 된 형질 전환 모델은 현재 사용할 수 없기 때문에, 이러한 종양의 전이 특성에 대한 생체 내 연구는 면역 저하 쥐에 인간 세포의 주사에 의존하고 있습니다. 면역 손상 동물 사용은 질병의 진행에 대한 면역계의 영향을 과소 평가할 수 있지만, 인간의 세포를 사용하는 기능 연구는 번역 가능성을 증가시킨다. 다른 이종 이식 모델 중에서, 꼬리 정맥에 전신 주사를 수행하는 가장 쉬운 아직 이들은 종양 세포 intravasation의 초기 단계를 생략하고 성장 차 사이트에서 탈출. 한편 7-12, orthoto 뼈 (대퇴골, 리브) 또는 근육으로 종양 세포의 주입을 포함 PIC는 xenografting은보다 생물학적으로 인간 암에 관련된 기술적으로 어려운 물론이다. 전이 현상 전에 13-16 그러나, 과거에, 일차 종양의 급속한 성장과 관련된 높은 질병 율을 종종 필요로했다 동물 안락사. 본 연구에서는 MRI에 의해 전이성 진행의 길이 모니터링과 결합 된 결과 원발 종양의 절제 다음에 비복근 근육에 세포 주사의 이전에 설립 모델을 고용했다. 근육과 뼈 - - 경골에 근접 비복근 근육에 (17, 18) 이러한 주사는이 자연 ES 환경에서 종양의 성장을 허용하고 일반적으로 인간에 영향을받는 위치에 원격 전이가 발생. (18) 따라서,이 모델은 정확하게 질병 진행 동안 ES 환자에서 발생하는 전이 과정을 되풀이되었습니다.

텐트 "> 하부 사지 일차 종양의 위치 파악은 종양 조직에 혈액 공급의 정확한 제어를 용이하게한다. 대퇴 동맥 결찰 (FAL)은 원위 영역에 혈액 흐름을 차단하는 혈관 신생 연구에서 이용되는 잘 확립 된 기법이다 레그 및 허혈에 응답 조직 혈관을 조사. 19-20를 중요한 혈류 초기 드롭 3 일 정도 FAL 후에 관찰 담보 용기 개구 조직 재관류 따른다. (20) 이와 같이, 담암 사지에서 수행되면 이 모델은 빠르게 성장하는 종양에서 자연적으로 발생하는 저산소증 / 재관류 이벤트를 재현하고 새로 열린 측부 혈관을 통해 하부 사지에 관류의 복원으로 인한 전이성 종양 세포의 이탈을 가능하게한다. (21) 중요한 것은, 종양의 크기 인 경우,이 절차가 수행되어야 일반적 담암 소 부피의 제어 종양에서 과잉 저산소증 (방지하기에 충분히 작은제어 FAL 투여군간에 종양 저산소증의 수준에서 상당한 차이를 확보 250mm 3) - (150)의 UME.

ES 지연에 저산소증의 효과 및 전이의 주파수의 길이 모니터링에 더하여,이 모델은 또한 조직 수집 및 차 종양 및 전이에서 모두 새로운 세포주의 개발을 허용한다. 중요한 것은, 이전의 연구는 전이 유래 세포주는 종양 보급 영구 종양 세포 표현형의 변화시킴으로써 전이 프로세스를 해독하는데이 세포주의 사용을 검증과 연결되어 있는지를 나타내는 동물에 재 도입에 향상된 전이 가능성을 나타내는 것을 설치했다. 총체적으로 18이 모델은 이제 저산소증 유발 전이 경로를 식별하기 위해 필요한 유전 및 분자 분석을 위해 사용될 수있다.

저산소증으로 다양한 t의 악성 종양을 향상 프로 전이성 요인이다umors, 우리의 모델은 골육종 및 횡문근 자연스럽게 사지 발전 다른 유형의 종양에서 저산소증의 역할을 조사하기위한 플랫폼으로 사용될 수있다. 21-23 또한, 유사한 접근법은 혈액 공급이 잘 정의 된 경로와 다른 해부학 적 위치에서 성장하는 악성 종양에 적용 할 수있다. 궁극적으로, 모델이 수정 될 수 및 유틸리티는 또한 개별 연구 필요에 따라 확장.

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프로토콜

모든 절차는 조지 타운 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

동소 이식 주입 1. 셀 준비

  1. 표준 조건에서 배양 인간 ES 세포. 하지 5 마우스의 주입을위한 포화 상태의 70 %를 초과하는 약 15 cm 세포 배양 접시를 사용합니다.
    주 :이 연구에서, SK-ES1 세포는 10 % FBS와 1 % 4- (2- 히드 록시 에틸로 RPMI에서 콜라겐 - 코팅 된 플레이트 및 TC71 세포를 15 % 소 태아 혈청 (FBS)로 배양 된 맥코이 5A 배지에서 배양 하였다이었다 ) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES). 두 매체는 항생제가 보충 된 - 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / mL) 및 fungizone (1 μg의 / ㎖).
  2. 5 분 동안 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 70 %의 합류에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)과를 Trypsinize으로 ES 세포를 씻으십시오.
  3. 세포 배양 메디칼와 함께 접시에서 ES 세포를 제거A, 실온에서 200 × g으로 5 분 동안 원심 분리. 다시 일시 차가운 PBS 10 ㎖에 ES 세포 후 세포의 수를 계산.
  4. 다음 원심 분리기 ES의 실온에서 200 XG에 5 분 동안 세포 및 일시 중지 다시 2 × 10 7 (SK-ES1) 또는 차가운 PBS에서 ml의 당 10 7 (TC71) 세포에서. 주사를 수행하는 동안 얼음에 최종 세포 현탁액을 유지합니다.

비장근 근육 ES 세포의 2 동소 이식 주입

  1. 4-6주 세 여성 SCID / 베이지 색 마우스를 사용합니다.
  2. ES 세포를 주입, 부드럽게 낮은 사지의 내측을 노출, 마우스를 잡고 네 번째와 다섯 번째 손가락 사이의 왼쪽 다리를 안정.
  3. 28 G ½ 바늘을 사용하여, 어느 비복근 근육에 2 × 106 (SK-ES1) 또는 106 (TC71) ES 세포 (도 2a)를 포함하는 미리 제조 한 세포 현탁액 0.1 ml를 주입.
    참고 : 비록 근육 INJ 최대 볼륨ections 인해 주입 높은 세포 수에이 특정 절차, 일반적으로 0.1 ml의 필요에 볼륨 증가 0.05 ml 인 것을. 이 절차는 조지 타운 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
    1. 경골 가문 / 결절의 방향으로 45도 각도 - 비복근 근육에 전방에서 약 30 바늘을 삽입합니다.
    2. 이 경골 문장 / 결절을 터치하면 약간 바늘을 철회. 천천히 압력을 서서히 방출 바늘 인출, 세포 현탁액을 주사.
  4. 고통의 흔적이 다음 24 시간 동안 주입 된 쥐를 모니터링합니다.
    참고 : 동물 취급 적은 경험이있는 연구자들은 종양 세포 주사에 대한 쥐를 마취 고려해야합니다. 일부 기관은 안전상의 이유로 마취가 필요할 수 있습니다.

3. 주요 종양의 성장을 모니터링

  1. D 차 종양의 성장을 모니터링aily 종양 크기는 원하는 양에 도달 할 때까지.
    참고 : 본 연구에서, 250mm (3)의 커프 용적 실험 (도 2B)의 시작점으로 사용 하였다. 종양이 크기에 도달하는 이주 - 일반적으로는 약 1 소요됩니다.
    1. 그-중간 측면과 전후방 길이를 통해 디지털 캘리퍼스 매일 송아지 크기를 측정한다.
    2. D는 긴 직경이고, d는 종양 - 함유 낮은 사지의 짧은 직경 3.14 X 화학식 (D XD는 6분의 2)에 의한 종아리의 볼륨을 결정한다.
      참고 : - 50mm 3 일반 성인 마우스 송아지의 크기는 약 40이다. 부피 의한 종양 성장 및 종아리 주로 종양 조직으로 구성되는 나중 단계에서 증가 할 것이다.

종양 베어링 뒷다리에 저산소증을 유도 4. 대퇴 동맥 결찰 (FAL)

  1. 이 작업에 필요한 수술 도구를 준비 : CURVED 또는 지적 미세 집게는 집게, 외과 가위와 바늘 홀더를 지적했다. 오토 클레이브 또는 핫 비드 살균기를 사용하여 수술하기 전에 이러한 도구를 소독. 또한이 수술에 대한 준비가 잘 면봉 있습니다.
    주 : 도구이 절차를 수행하는 동안 필요에 따라 끝을 다시 소독하는 것이 좋습니다.
  2. 진통제 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏) 피하 (SQ)를 주입한다. 검색 및 저산소증을 확인하려면, hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 ㎎ / ㎏)을 주입.
    주 :이 투여 량은 마우스 당 1.5 mg의 총점 및 PBS를 복강 내 (IP)에 15 ㎎ / ㎖ hypoxyprobe 용액 0.1㎖를 주입함으로써 달성된다. hypoxyprobe는 면역 조직 화학 염색에 의한 동물의 조직에서 검출 사후이다.
  3. 1 L / min의 유속에서 100 % 산소, 5 % 이소 플루 란 - (3)을 포함하는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓는다.
  4. 그것은 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에서 마우스를 둡니다. 다음 i에서 동물을 제거nduction 실. 운영 표면에 온난 패드 위에 배치 멸균 드레이프의 부정사 위치에 동물을 배치합니다. 0.8 L / 분의 유속에서 100 % 산소 3 % 이소 플루 란 - (1)의 연속적인 흐름으로 연결하는 노즈 콘 (nose cone)을 사용한다.
    1. 각막 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 멸균 비 약용 안과 연고를 적용합니다. 철저하게 수술 영역을 털을 뽑다하려면 더 이상 10 초 동안 피부에 그것을 떠나, 머리 제거 크림을 적용합니다. 그런 다음 에탄올 준비 패드를 사용하여 머리 제거 크림을 닦아.
  5. 확장 및 약 45도 마우스의 중간 선에서 테이프의 조각으로 사지를 고정합니다. 사지가 안전하면, 두 번 더 각을 반복, 에탄올 다음 10 % 포비돈 / 요오드 면봉 / 솔루션에 노출 된 피부를 닦아냅니다. 수술의 나머지 부분은 사지의 영역의 확대도를 얻기 위해 스테레오 현미경을 사용한다.
  6. 뾰족한 집게, 외과 가위를 사용하면은 SK의 절개를약 1cm 길이에, 사타구니 지역으로 허벅지 중간에서. 생리 식염수에 적신 고급 면봉을 사용하여 부드럽게 허벅지 근육을 둘러싼 피하 지방 조직을 멀리 브러시.
  7. 조심스럽게 피하 지방 조직을 통해 무딘 절개를 통해 기본 대퇴 동맥을 알 수있다. 중앙 상부 내전근 근육의 혈관을 노출 상처 및 수술 필드를 안정화.
  8. 부드럽게 피어스 멤브레인 대퇴 칼집을 통해 미세 집게를 사용하면 신경 혈관 다발을 노출. 미세 집게의 깨끗한 세트를 사용하여 해부와 사타구니 인대에 말단 사타구니 근처 근위 위치에서 대퇴 정맥과 신경의 대퇴 동맥을 분리합니다. 대퇴 정맥 벽을 관통하지 않도록주의하십시오.
  9. 해부에 따라, 측면 곡절 대퇴 동맥 (LCFA)의 분기에 대퇴 동맥 및 말초 아래에 6-0 실크 봉합사의 가닥을 전달합니다. 더블 노트 (그림 3)를 사용하여 대퇴 동맥을 폐색.
  10. 6-0 폴리 프로필렌 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다. 절개를 닫은 후, 유체 균형 치료를위한 따뜻한 식염수 SQ 0.5 ml를 주입. 복구 케이지에 드리 워진 따뜻한 패드의 상단에있는 동물을 놓고 깨어 때까지 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.
  11. 진통 에이전트를 수술 후 처음 6 시간 동안 동물을 모니터링하고 주입 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏, SQ) 3 일간 매일. 봉합을 멸균 가위를 사용하여 십일 후 수술을 제거합니다.

다리 절단 수술 5. 차 종양 절제술

주 : 송아지 크기가 대조군 250mm 3 저산소 그룹 FAL 후 3 일에 도달했을 때 종양 베어링 하부 사지 절단 될.

  1. 부드럽게 동물을 잡고 머리를 가위로 골반 영역으로 원위 경골에서 종양 베어링 다리에서 머리를 면도. 절차 전에 진통제를 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏, SQ) 주입한다.
  2. 마취 유도 채널에 마우스를 놓고1 L / min의 유속에서 100 % 산소, 5 % 이소 플루 란 - 황색 3을 함유. 그것은 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에서 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다.
  3. 운영 표면에 온난 패드에 배치 멸균 드레이프에 오른쪽 측면 기댄 위치에있는 동물을 놓습니다. 0.8 L / 분의 유속에서 100 % 산소 3 % - 이소 플루 란 (1)의 연속적인 흐름으로 연결하는 노즈 콘 (nose cone)을 사용한다. 각막 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 멸균 비 약용 안과 연고를 적용
  4. 3 회 반복 한 다음, 에탄올 10 % 포비돈 / 요오드 면봉 / 용액을 사용하여 수술 부위를 준비. 멸균 된 수술 부위를 얻기 위해 마우스를 통해 멸균 거즈 (예를 들어, 수술 드레이프)을 적용한다.
  5. 무딘 해부 및 근위 피부의 수축 다음에 중간 대퇴 원주 피부 절개를합니다. 다리의 중간 측의 내측 대퇴 신경 혈관 척추 경을 노출하고 결찰4-0 코팅 (polyglactin 910) 흡수성 봉합사를 이용하여 서혜부 인대 근처.
  6. coxofemoral 관절 연부 조직의 무딘 절개 한 다음 가위로 근육 그룹의 중간 대퇴부 절개를 수행합니다. 뼈 커터를 사용하여, 중간 대퇴골 절골술을 수행합니다. 멸균 고급 면봉이나 흡수성 젤라틴 스폰지를 사용하여 부드럽게 최소화하고 출혈을 방지하기 위해 절골술 사이트를 누릅니다.
  7. 수술 상처 클립을 사용하여 상부의 피부를 닫고 유체 균형 치료에 따뜻한 식염수 SQ 0.5 ml를 주입. 복구 케이지에 드리 워진 따뜻한 패드의 상단에있는 동물을 놓고 깨어 때까지 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.
  8. 수술시, RNA, DNA 또는 단백질 분리를위한 기본 종양에서 조직 샘플을 수집 -80 ℃에서 액체 질소 저장에서 동결 스냅. 아래의 9 절에 설명 된 바와 같이 일차 세포 배양의 경우,이 단계에서 조직 샘플을 수집한다. 조직학 및 immunochemis 10 % 중성 완충 포르말린에 남아있는 사지 조직을 수정hypoxyprobe-1 검출을 포함 해보십시오.
  9. 3 일간 후 매일, 수술 후 처음 6 시간에 운동, 통증과 식품 소비에 대한 동물을 모니터링합니다. 3 일간 매일 진통제를 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏, SQ) 주입한다. 상처 클립 제거제를 사용하여 절단 후 상처 클립 10 일 제거합니다.

전이의 존재 6. 모니터링 마우스

  1. 매일 쥐를 관찰하고 적어도 일주일에 두 번 전이의 임상 적 징후를 평가합니다.
    1. 다양한 위치, 일반적으로 어깨, 반대편 다리와 턱에 개발 질량으로 제시 macrometastases의 존재 동물을 관찰한다. 이를 위해 조심스럽게 머리, 목, 겨드랑이 지역과 반대측 사지를 만져. MRI 검사와 함께 복부 팽만을 통해 내부 장기의 전이를 확인합니다.
    2. 색인 전압으로 xyphoid 처리 (흉골의 하단)을 눌러 폐 전이의 존재를 확인X 손가락. (24)
      참고 :이 압력은 횡격막 호흡 용량을 감소. 고급 폐 전이와 마우스는 힘든 호흡에 의해 나타난 호흡 곤란의 징후를 보여줍니다.
    3. 이러한 중추 신경계에 전이을 제안 다리 마비 및 운동 장애 등의 신경 학적 증상의 동물을 관찰한다.
    4. 잠재적 인 질병 진행의 표시로, 체중 감량을 위해 적어도 일주일에 한 번 마우스를 모니터링합니다. 예비 절차 중량의 15 %를 초과하는 체중 감소는 인간 엔드 여겨진다.

7. 자기 공명 영상 감지 전이에 대한 (MRI)

  1. 목적하는 시점에서 전이를 검출하는 MRI를 수행한다. (18)
    참고 : 본 연구에서는 7 테슬라 수평 분광계를 사용 하였다. MRI는 일 (15)에서 수행하고 SK-ES1 세포 및 TC71 세포 일 15시 35 후 절단되었다.
  2. 마취 유도 chambe에 마우스를 놓고30 %의 산소 및 70 %의 산화 질소의 혼합 가스에 3 % 이소 플루 란 1 - 함유 R.
  3. 그것은 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에서 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다.
  4. 1.5 %의 이소 플루 란의 지속적인 관리와 30 % 질소 산화물과 호흡 및 온도 monitorization와 정위 홀더 위에 마취 마우스를 전송합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 멸균 비 약용 안과 연고를 적용합니다. 이미지 동물 중 하나를 각각 몸 전체 또는 뇌 영상을위한 40 또는 23mm 브루 커 마우스 볼륨 코일입니다.
  5. TR = 3000 밀리 초, TE = 24 밀리 초, 매트릭스 = 256, FOV = 4.35 X 3.0 cm, 슬라이스 두께 = 0.5 mm, RARE 요인 = 4 평균 = 4. 18 : 이차원, T2 강조 RARE 시퀀스를 사용하여
  6. 따뜻한 복구 케이지에 동물을 놓고 깨어 때까지 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.
    주 : 마취의 얕은면을 사용하기 때문에 마우스는 빠르게 회복됩니다.
  7. 마취의 부작용이 없는지 확인하기 위해 촬영 후 처음 6 시간 동안 동물을 모니터링합니다.

8. 안락사와 부검

  1. MRI 및 / 또는 질병 진행의 임상 증상에 의해 검출 전이에 존재하는 동물 한 번 쥐를 안락사.
    참고 : 현재의 연구에서, 마우스 일 (50)에 희생 된 각각 SK-ES1 및 TC71 이종 이식 베어링 동물 25 후 절단. 어떤 경우에는, 이전에 안락사 인해 높은 전이 부담 할 필요가 있었다.
  2. (- 안락사 실 부피 / 분 30 ~ 10 %의 CO 2) / 분 1.5 L에서 2 CO에 노출 쥐를 안락사. 동물의 죽음을 보장하기 위해, CO 2에 노출 된 후 자궁 전위를 수행합니다.
  3. 70 % 에탄올로 전체 마우스 스프레이와 층류 후드에 배치합니다. 혈액 수집 TU에 1 ML의 주사기 및 전송로 25 G ½ 바늘을 사용하여 심장 천자하여 혈액을 수집EDTA 2 ㎎을 함유 할.
  4. 상완골 (humeri) 및 척추뿐만 아니라 다른 위치에 존재하는 거시적 전이 모두에서 비장, 부신, 난소, 신장, 간, 폐, 뇌, 오른쪽 다리, 골수 다음 조직을 수집합니다. 25, 26
  5. hypoxyprobe-1 검출을 포함 조직학 및 면역 화학, 10 % 중성 완충 포르말린의 각 조직의 절반을 수정합니다. 스냅는 RNA, DNA 또는 단백질 분리를위한 -80 ℃에서 저장, 액체 질소에 나머지 절반을 동결. 아래의 9 절에 설명 된 바와 같이 일차 세포 배양 용 25, 26는 조직 샘플을 수집한다.

9 차 세포 ​​배양

  1. 차 세포 배양을 수행하려면, 층류 후드에서 무균 조건에서 검시 (위의 섹션 8) 중에 절단 된 사지 (위의 섹션 5) 또는에서 조직을 해부하다.
  2. 페니실린 소성을 주사에 사용 된 세포주 (200 단위 / ㎖)를위한 세포 배양 배지에 적절한 준비스트렙토 마이신 (200 μg의 / ㎖) fungizone (1 μg의 / ㎖), 0.2 %의 마이코 플라즈마 예방 항생제. 6 cm 세포 배양 접시에 차 배양액 2.5 ml에 놓습니다.
  3. 차 종양이나 전이에서 가능한 종양 조직 영역을 선택하고 멸균 가위를 사용하여 각 2-3mm에 두세 세그먼트를 분리.
    참고 유력한 종양 조직은 일반적으로 종양의 가장자리에서 볼 때, 그 분홍 또는 붉은 색 상당한 광택 및 전체 습식 외모 괴사로부터 판별 될 수있다. 반대로, 괴사 조직은 일반적으로 종양의 중심에서 볼 ​​및 무딘, 치즈 외관 희끄무레 / 크림색 질량으로 제시한다. (27)
  4. 단계 9.2에 설명 된 기본 배지를 함유하는 6 cm 세포 배양 판에 절연 세그먼트를 전송합니다.
  5. 표준 조건 하에서 배양 세포로 부 1 (주) 9.2에 기재. 18, 28 ㅁ 조직 조각에서 발생하는 세포 부산물의 문화를 확인무형 문화 유산은 몇 일 이내에 관찰해야한다. 세포가 합류점에 도달하면를 Trypsinize 표준 세포 배양 기술에 따라이를 전달.
    주 : 일차 세포 배양 물은이어서 전술 한 바와 같이, 성장 제어 및 저산소 종양뿐만 아니라 분자 특성으로부터 유도 된 세포의 전이 특성을 평가하는 데 사용될 수있다. (18)

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결과

비복근 근육에 ES 세포의 주입 후, 일차 종양 250mm (3)의 소 사이즈로 성장할 수있다 (도 1, 2). 각각 SK-ES1 이종 이식에 대한 TC71 20 ~ 25 일 15 일 - 종양에 필요한 시간이 볼륨은 일반적으로 10 범위에 도달합니다. 250mm 3 전시 내인성 저산소증의 비교적 낮은 레벨의 체적 소에서의 종양 hypoxybrobe -1- (pimonidazole)에 기초하여, (종양 조직의 약 3 %) (도 4a, C)를 염색. 중요한 것은, 이들 제어 종양, hypoxyprobe-1에 대한 양성 염색은 혈관으로부터 먼 세포 사멸 (도 4a)를 거쳐 시작 종양 세포에서 전적으로 즉 생리 저산소증의 영역에서 관찰되었다. 건강한 종양 조직의 대부분이 hypoxyprobe-1에 대한 부정적인 남아있는 동안 이러한...

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토론

우리의 모델은 두 개의 실험 그룹 전이 비교 포함 - 종양 250mm (3)의 커프 용적에 도달시 절단 뒤에 뒷다리에서 개발 허용 대조군 및 저산소증 노출기를되는 tumor-에서 베어링 뒷다리 3 일 후에 절단 한 다음, 동일 볼륨 FAL 받는다. 제어 종양에 비해이 실험의 FAL 처리 된 종양은 약간의 지연과 함께 절단 된 경우에도, 그 사이즈 및 절단 결찰 사이 3 일 동안 증가하지 않는다. 따라서, 이러한 접근법은 유사한 크기이지만 저산소증 극적으로 다른 레벨 간의 전이성 암 전위의 비교를 가능하게한다. 대조적으로, 모의 수술을 이용하여 종양 성장 후 3 일 뒤에 수술 개입 흔히 이용 제어부는 모의 - 수술 치료와 실험군 간의 종양 크기에 유의 한 차이를 초래내인성 저산소증 유의 수준을 갖는 차 종양 에드. 파일럿 실험을 바탕으로, 모의 수술 크게 종양 성장 또는 저산소증 수준에 영향을주지 않으며, 따라서 실험 설계로부터 제거 될 수있다. 대신에, 유사한 크기의 다른 저산소 농도의 종양을 비교하는 전략...

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 NIH(National Institutes of Health) 보조금의 지원을 받았습니다: UL1TR000101(이전 UL1RR031975)은 Clinical and Translational Science Awards Program을 통해 JK에 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 및 1R21CA198698을 제공했습니다. MRI는 조지타운-롬바르디 종합 암 센터의 전임상 영상 연구소(PIRL)에서 수행되었으며 조직 처리는 NIH/NCI 보조금 P30-CA051008의 지원을 받는 조지타운-롬바르디 종합 암 센터의 조직병리학 및 조직 공유 리소스에서 수행되었습니다. 저자들은 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 캠퍼스 세포생물학 및 생리학과의 Dan Chalothorn과 James E. Faber에게 사후 X선 혈관 조영술에 도움을 주고 측부 형성에 대한 통찰력과 전문 지식을 제공한 것에 대해 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cellsATCC
TC71 Human ES cellsKindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) MediumGibco by Life Technologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBSSigma-AldrichF2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)Gibco by Life Technologies25200-056
Penicillin-StreptomycinGibco by Life Technologies15140-122
Fungizone® Life Technologies의 AntimycoticGibco15290-018
MycoZap™ 예방적인LonzaVZA-2032
콜라겐 타입 I 쥐 꼬리 고농도BD Biosciences354249
SCID/베이지 마우스Harlan 또는 Charles River250 (Charles River) 또는 18602F (Harlan)
1 ml 인슐린 주사기와 영구적으로 부착된 28  G ½ 바늘BD329424
식염수 (0.9% 염화나트륨 주사, USP)Hospira, INCNDC 0409-7984-37
디지털 캘리퍼스World Precision Instruments, Inc501601
수술 도구미세 과학 도구
Rimadyl (Carprofen) 주사 가능 Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)HPI, IncHP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)HPI, IncCCI-103F-250mg
포비돈-요오드 SwabstickPDIS41350
멸균 알코올 준비 패드Fisher HealthCare22-363-750
LubriFresh P.M. (눈 윤활제 연고) 주요 PharaceuticalsNDC 0904-5168-38
방수 수분 장벽이 있는 VWR 흡수 언더패드VWR56617-014 
Oster Golden A5 싱글 스피드 수의사 클리퍼(50 사이즈 블레이드 포함Oster078005-050-002(클리퍼), 078919-006-005(블레이드)
베이비 오일이 있는 Nair 로션Church & 드와이트 주식회사
Silk 6-0Surgical Specialties Corp752B
Prolene (폴리프로필렌) 봉합사 6-0Ethicon8680G
Vicryl (Polyglactin 910) 봉합사 4-0 EthiconJ386H
Fisherbrand 애플리케이터 (정제면)Fisher Scientific23-400-115
GelFoam 흡수성 치과 스폰지 - 사이즈 4Pfizer 제약9039605
Autoclip Wound Clip ApplierBD427630
스테레오 현미경OlympusSZ61
Autoclip 제거제BD
Aound 클립BD427631
MRI 7 TeslaBruker Corporation
Paravision 5.0 소프트웨어Bruker Corporation
CO2 안락사 시스템VetEquip
25 G 5/8 바늘 (심장 천자용)BD305122
0.1 ml 주사기 (용 TerumoSS-01T
K3-EDTA 마이크로 튜브 1.3mlSarstedt41.1395.105
10% 중성 버터 포르말린Fisher ScientificSF100-4
) 427637

참고문헌

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