여기에서는 불투명 티타늄 지지체에 세포 생존을 검출뿐만 아니라, 골격 불순물 일별을 검출하는 형광 기반 이미징 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 비 투명 지지체에 세포 세포 또는 세포 상호 작용 금속을 묘화의 결점이 문제를 해결합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
추간판 퇴행과 추간판 탈출증은 허리 통증의 주요 원인 중 하나입니다. 세포외 기질의 고갈은 NP(nucleus pulposus) 압출로 절정에 이르며 추간판 파괴로 이어집니다. 현재 이용 가능한 외과적 치료법은 통증을 감소시키지만 척추의 기계적 기능을 회복시키지는 못합니다. 따라서 척추의 기계적 특징을 보존하기 위해 전체 디스크 또는 핵 교체가 광범위한 관심사가 되었습니다. 그러나 이 관절 치환술 시대는 기존 제품 중 어느 것도 임상적으로 평가되지 않았기 때문에 여전히 미성숙한 상태에 있습니다.
이 연구는 니트 티타늄 와이어로 만든 새로운 핵 임플란트의 생체 적합성을 테스트하기 위한 것입니다. 모든 기계적 장점에도 불구하고, 이 재료는 결과 임플란트가 불투명하기 때문에 기존 광학 분석에 한계가 있습니다. 여기에서는 골격에 있는 골연골전구세포의 체외 시각화, 추적 및 생존력 테스트를 설명하는 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 세척 프로토콜의 효율성을 시각화하고 이러한 골격 및 기타 불투명 골격의 생체 적합성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 세포의 부착 패턴뿐만 아니라 골격 상에서/골격 내에서 세포 생존율 및 증식률을 보여주는 데 사용할 수 있습니다. 이 체외 생체 적합성 검사 분석은 불투명 및 불투명 골격에서 세포-물질 상호 작용을 분석할 수 있는 유용한 도구를 제공합니다.
서론
만성 허리 통증은 다 인성 질환이다. 퇴행성 디스크 질환의 최소 침습적 치료 방법에 대한 관심은 1950 년대 이후 성장했다. 오늘날, 척추의 분절 다중 융합은 가장 널리 사용되는 치료는 상태가 될 때까지. 이후,이 방법은 종종 영향을받는 세그먼트 1, 2의 이동성의 한계에 이르게의 전 치환술 시대의 탐사는 넓은 관심이되었다. 전체 디스크 교체 및 핵 교체에 상당한 발전 만성 허리 통증 1을 치료하는 좋은 대안이되고있다. 거대한 진전에도 불구하고, 방법 중 어느 것도 임상 적으로 평가되지 않았다. 덜 엄격한 핵 이식은 전체 디스크 교체에 유망한 대안을 나타내는 섬유륜이 3,4 그대로 것이어야한다. 그러나, 시장에 현재 존재하는 핵 이식은 종종 추체, 전위, 디스크 및 t의 수직 높이 손실의 변화와 같은 합병증과 연관된필요한 관련 기계 강성 5 그는 부족. 현재의 문제점을 해결하기 위하여, 티탄 니트 와이어로 이루어지는 신규 한 핵 이식이 성공적 6 개발되었다. 때문에 독특한 니트 구조로, 새로 개발 된 인공 지지체는 예를 들어, 고유 생체 역학적 특성, 감쇠 기능, 기공 크기, 적재 능력 및 신뢰성 (7)을 보여 주었다. 이 새로운 핵 임플란트의 생체 적합성....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
주 : 불멸화 된 인간 간엽 기질 전구체 세포 (SCP-1 세포)를 실험에 사용 하였다. SCP-1 세포 교수 마티아스 Schieker (12)에 의해 제공되었다.
SCP-1 세포의 1. 확장
- 전에 SCP-1 세포와 협력에 제대로 70 % 에탄올 (v / v)로 입고 장갑 작업 영역 (지정 바이오 안전성 캐비닛 I)를 청소합니다.
- 세정 바이오 캐비닛의 표 1에 나타낸 바와 같이 필요한 성분을 혼합하여 세포 배양 배지의 적당한 양을 준비한다. 기본 배지의 무균 상태를 유지하기 위해서, 0.22 ㎛의 공극 크기에 살균 필터를 통과함으로써 보충을 추가한다.
- , 오염을 방지 사용하기 전에 매체 적어도 24 시간을 준비합니다. 37 ° C, 5 % CO 2, 20 % O 2와 90 % 습도의 멸균을 테스트하기 위해, 표준 세포 배양 인큐베이터에서 세포없이 세포 배양 접시에 1 ml의 배지를 배양한다. 후24 시간은, 매체 현미경으로 적어도 200 배의 배율을 사용하여 확인합니다.
- 37 ° C, 5 % CO 2, 20 % O 2와 90....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
예비 결과는 설명 새로운 핵 이식뿐만 아니라 좋은 댐핑 기능을 가지고뿐만 아니라 SCP-1 세포와 생체 적합성 인 것으로 나타났다. 임플란트의 제조 공정 동안, 강한 부식성 및 독성 물질 (윤활제, 매염제, 전기 연마 용액)와 접촉한다. 간접 형광 염색하는 기술을 사용하여, 우리는 잔여 불순물을 시각화하고, 결과적으로, 골격에 물질 부하의 상당한 감소를 도시하는 클리닝 프로토콜을 최적화 할 수 있었다. (3)이 성립 세정 프로토콜의 효율을 나타낸다.
프로토콜 부 (6) 트랜스 상당한에 설명 된대로 셀 재 계면에서 발생하는 이벤트에 의해 결정된다 치환술 치료에 사용되는 임플란트의 성공.도 4는 도금의 24 시간 후 지지체에 부착 된 세포를 나타낸다SCP-1 세포의 fect.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
골격 표면하여 임플란트를 기능적 내구성을 결정 생체 내에서 주변 조직과의 상호 작용에서 중요한 역할을한다. 따라서, 지지체의 생체 적합성의 지지체 상에 플레이 팅 세포를 이용한 시험 관내 분석법 (SCP1 세포주)에 의해 연구된다.
얇고 광학적으로 투명 지지체와 잘 작동 현미경 기술은 가난 생체 적합성을 연구하는 불투명 발판 적합합니다. 이것은 불투명 지지체 상당한 왜곡없이 15 침투하는 광을 방지 주로 때문이다. 부분적으로 이러한 문제점을 극복하기 위해, 우리는 이것과 각종 형광체를 사용하는 니트 제조 티타늄 지지체의 ON / 셀 평가 방법을 확립한다.
티타늄 와이어 폴딩 하였다 편성을 가능하게하기 위해, 재료는 강한 부식성 및 독성 물질 (윤활제, 매염제, 전기와 접촉트레이스는 발판에 /에 남아있는 경우 지지체의 생체 적합성을 변경할 수있는 솔루션을), -polishin.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 더 경쟁 관심이 없음을 선언합니다. 작품의 어떤 부분은 없었 또는 게시를 위해 고려중인 현재 또는 다른 곳에 게시 된있다.
감사의 글
이 프로젝트는 부분적으로 Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand에 (ZIM) 데 Bundesministeriums 대 Wirtschaft 싶게 에네르기 -KF3010902AJ4에 의해 투자된다. 발행 수수료는 BG 외상 병원 튀빙겐, 독일에 의해 덮여있다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6/24/48 웰 플레이트, T25/ T75 배양 플라스크 | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 웰 플레이트 | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 웰 플레이트 | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6웰 플레이트 | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| 아세트산, 푸럼 ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| 아세톤 | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, 독일 | ||
| 생물 안전 작업대 | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µ m) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| 원심 분리기 5810 R 및 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco ' s Ca 없이 PBS & Mg | 시그마 | H15-002 | |
| 에탄올 99% | SAV 액체 prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS 형광 이미징 시스템 | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| 혈구계 | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| 니트 티타늄 핵 임플란트 | Buck co & KG, 독일 | ||
| MEM 알파 수정 글루타민 w/o 뉴클레오시드 | 시그마 | E15-832 | |
| 오메가 마이크로플레이트 리더 | BMG Labtech, 독일 | FLUOstar 오메가 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마 | P11-010 | |
| 레사주린 나트륨 염 | 시그마 | 199303-1G | |
| 설포로다민 B 나트륨 염 | 시그마 | S1402-1G | |
| 시험관 회전기 | Labinco BV, 네덜란드 | 모델 LD-76 | |
| TRIS (하이드 록시 메틸) 아미노메탄 | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 | |
| 트립신 / EDTA | 시그마 | L11-004 |
참고문헌
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- S....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
