생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

요약

지방 유래 줄기 세포 (ASCs) 쉽게 격리 하 고 정상 쥐의 지방에서 수확. ASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 주 커 전체 두께 전시 하는 당뇨 지방 쥐 결함 노출 된 뼈와 피부와 다음 인공 피부의 bilayer 덮여에 이식 될 수 있다.

초록

인공 피부는 임상 연습에 상당한 치료 결과 달성 했다. 그러나, 당뇨병 환자 비능률적된 혈 또는 큰 상처와 상처에 대 한 인공 피부 치료 연장 될 수 있습니다. 세포 기반 치료 당뇨병 궤 양의 치료에 대 한 새로운 기술로 등장 하 고 셀 시트 공학 세포 이식의 효능을 향상 했다. 보고서의 수는 지방 유래 줄기 세포 (ASCs), 중간 엽 기질 세포 (MSC), 유형의 지방 조직 및 다른 조직에서 MSCs에 비교 될 때 컬렉션에 대 한 그들의 접근에서 그들의 관계 되는 풍부 때문에 치료 잠재력을 전시 하는 건의 했다. 따라서, ASCs 치료 용 줄기 세포의 좋은 원천이 될 나타납니다. 이 연구에서는 일반 루이스 쥐의 epididymal 지방 지방에서 ASC 시트 온도 응답 문화 요리와 의약품을 포함 하는 일반 문화 매체를 사용 하 여 성공적으로 창조 되었다. ASC 시트 커 당뇨병 지방산 (ZDF) 쥐에 이식 했다의 저하는 비만 2 형 당뇨병 쥐 모델 상처 치유. 상처 후부 두개골 표면에 만들어진, ASC 시트는 상처에 이식 했다 그리고 bilayer 인공 피부는 시트 커버를 사용 되었다. 받은 ASC 시트에서 쥐에서 쥐 ASC 시트 이식 없이 보다 치유 상처 더 했다. ASC 시트는 습 한 상처 환경 유지 보수를 필요로 건조 조건에 과민 하기 때문에이 접근은 제한 되었다. 따라서, 인공 피부 건조를 방지 하는 ASC 시트 커버를 사용 되었다. 인공 피부와 함께에서 ASC 시트 allogenic 이식 또한 다른 다루기 힘든 궤 양이나 화상, 말 초 동맥 질환 및 교원 질 질병, 관찰 등을 적용할 수 있습니다 그리고는 영양 또는 스테로이드를 사용 하는 환자에 게 관리 될 수 있습니다. 따라서,이 치료는 당뇨병 상처 치유에 대 한 치료 옵션을 개선 향한 첫 번째 단계를 수 있습니다.

서론

당뇨병 환자의 인구 세계 전반 증가 하 고 2015¹;에서 400 백만 도달 당뇨병 환자의 약된 15-25% 더 낮은 말단 당뇨병 궤 양²의 진행에서 위험에 있습니다. 더 낮은 말단 당뇨병 궤 세공 되지 않으며 완전 한 회복 후 재활 훈련으로 장기간 치료를 해야 할 수도 있습니다. 긴 치료 기간을 종종 환자 삶의 질에 있는 뜻깊은 감소에 있는 결과. 따라서, 당뇨병 상처 치료에 대 한 감소 또는 악화를 방지 하는 새로운 치료를 개발 해야 합니다. 당뇨병 상처 치유를 평가 하려면 우리는 당뇨 궤 양 상처 치유 모델 쥐, 모방 실용적인 임상 조건, 최적화 그리고 치유 상처 가속 지방 유래 줄기 세포 (ASC) 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 이식 여부 평가.

Mesenchymal stromal 세포 (MSCs) 그들의 자기 갱신, 그들의 immunomodulatory 효과 용량과 다양 한 세포 계보³으로 차별 하는 그들의 능력 때문에 상처 치유를 가속을 위한 우수한 잠재력을 전시. ASCs는 지방 조직에서 파생 된 MSC의 유형 그리고 그들은 그들의 잠재적인 신생 및 paracrine 활동^4,5를 포함 하 여 다른 조직에서 파생 된 MSCs에 몇몇 이점을 전시. 지방 조직, 인체에서 상대적으로 풍부한 이며 최소한 침략 적 절차를 사용 하 여 컬렉션에 대 한 접근 허용. 따라서, ASCs 상처 치유 응용 프로그램^6,7에 대 한 실험적으로 사용 되었습니다.

이전 보고서 상처 주변 지역에 단일 셀 MSC 정지 직접 주입 상처 치유^8,9를 가속화할 수 있습니다 나타났습니다. 그러나,이 당뇨병 궤 양 모델 단일 세포 현 탁 액의 주입에 따라 상처 치유의 가속의 보고서에도 불구 하 고 상처 사이트에서 이식된 세포의 생존에 명확 하지 않습니다.

이 연구에서 우리가 온도 응답 문화 요리를 사용 하 여 셀 시트 공학 적용. 이 요리는 온도 응답성 고분자 N-isopropylacrylamide covalently 그들의 표면¹⁰에 바인딩된. 이식할된 폴리머 레이어를 온도-제어 세포 접착 또는 문화 접시의 표면에서 분리 수 있습니다. 접시의 표면이 된다 37 ° C에서, 반면 세포 표면에서 32 ° c 온도에서 친수성이 되 면 저절로 분리 준수 및 증식, 세포 수 소수 배양된 세포 온도; 감소 하면 그대로 셀 접합 및 세포 외 매트릭스 (ECMs)와 인접 셀 시트 수확 수 있습니다. 따라서, ECM, 트립 신, 등을 손상 하는 분해 효소 필요¹¹않습니다. 따라서, 셀-시트 공학 셀 연결을 유지 하 고 세포 이식의 효능을 향상 시킬 수 있습니다.

또한, 셀-시트 이식 세포 주입¹²에 비교 될 때 세포 생존 율을 증가 시킵니다. 이 프로토콜에서 커 당뇨 지방 (ZDF) 쥐 지연된 상처 치유와 타입 2 당뇨병과 비만 모델 선정 됐다. 쥐 자발적으로 약 4 주에 비만 개발합니다. 그들은 다음 어느 시점에서 그들은 혈당 인슐린 저항, dyslipidemia, 그리고 hypertriglyceridemia¹³과 관련 된 전시 하는 나이의 8과 12 주 사이 비만과 2 형 당뇨병을 개발. 상처 지연된 치유, 주변 혈관, 당뇨병 신 장병에 감소 된 혈은 또한^14,,1516을 관찰 했다. 또한, ZDF 쥐 다루기 힘든 피부 궤 양, 당뇨 궤 양 등의 치유 공부에 대 한 적절 한 모델을 수 있습니다.

상처 치유 메커니즘에 인간과 설치류의 차이 피부에 해 부 차이와 연결 됩니다. 정상적인 쥐에서 치유 하는 상처는 다시 epithelialization 및 알갱이 만듦 조직 형성에 따라 인간의 상처 치유 하는 반면 상처 수축, 기반. 일반적으로, 상처 부 설치류 모델에 사용 되 상처 수축 최소화 하는 데 도움이 하 고 비록 nondiabetic 쥐에 상처 수축에 의해 거의 완전히 폐쇄는 알갱이 만듦 조직¹⁷, 점차적인 형성에 대 한 수 있습니다. 그러나, 당뇨병 상처 수축 ZDF에서 쥐 장애인, 그리고 상처 치유 주로 발생 통해 다시 epithelialization 및 알갱이 만듦 조직 형성; 따라서,이 과정은 인간의 상처 치유¹⁴더 비슷합니다.

Debridement 임상 발생 종종 후 당뇨병 상처를 노출 된 뼈. 12 m m 직경 athymic 누드 마우스^18,19 의 뒤에 전체 간격 피부 상처와 정상적인 쥐²⁰의 뒤에 10 m m 직경 전체 간격 피부 상처 이전 연구 조사가 있습니다. 심한 당뇨병 상처에 대 한 임상 모델을 개발, 큰 (15 x 10 m m²) 전체 간격 피부 결함 뼈를 노출 하 고는 하지 않고 만들어졌습니다, 앞에서 설명한²¹, 제 2 형 당뇨병 및 비만 쥐에서.

일반 루이스 쥐의 ASCs에서 쥐 ASC (rASC) 시트는 ASC 시트 allogenic 이식 통해 창조 되었다. 임상 연습에서 궤 양은 당뇨병 환자 자주 전시 통제 높은 혈액 포도 당 수준 및 높은 몸 질량 색인, 이러한 환자에서 지방이 많은 직물을 얻기의 어려움을 증가 하는 이러한 합병증 원인 상처 치유 장애 등 심각한 당뇨 합병증 때문에 헌 식은 가능 하지입니다. 또한, 당뇨병 전시회와 동물에서 ASCs 속성을 변경 하 고 기능²²장애인. 따라서, 여기에 제시 된 프로토콜 정상 쥐에서 rASC 시트 allogenic 이식 및 당뇨병 쥐에 인공 피부의 응용 프로그램 설명 합니다.

이 프로토콜에서 사용 하는 bilayer 인공 피부 상처의 자발적 수축 방지, 새로운 결합 조직 매트릭스의 합성을 촉진과 진정한 피²³를 닮았다. 이 프로토콜에서 인공 피부는 rASC 시트에 배치 하 고 상처 수축 또는 느슨한 쥐 피부에서 발생 하는 확대를 방지 하기 위해 나일론 스레드 고정. 또한, 인공 피부 ASC 시트에 대 한 3 차원 프레임 워크를 제공, 이식 ASC 시트 및 상처, 습 한 환경 유지와 감염과 외부 세력 으로부터 상처를 보호 합니다. 마지막으로, 비 접착 드레싱 외부 충격에서 그것을 보호, 촉촉한 상처 환경을 유지 및 흡수 exudate 상처 위에 배치 됩니다.

RASC 시트, 유연한, 얇고 변형 이며 박동 심장²⁴같은 받는 사람 사이트 준수 수 있습니다. 셀-시트 엔지니어링과 다양 한 조직 재건을 위해 사용 되어 치료 효과^25,26. 를 생성할 수 있습니다. 임상 치료 잠재력을 전시 하는 ASC 시트의 다양 한 상처 치유 가속 수 있습니다. 또한, ASC 시트, 인공 피부의 사용과 결합의 수용자 이식 다루기 힘든 궤 양이나 화상, 말 초 동맥 질환 또는 교원 질 질병, 관찰 등의 치료에 적용할 수 있습니다 또는 영양 부족은 또는 스테로이드를 사용 하는 환자에 게 관리 될 수 있습니다. 이 방법은 ASCs 이식의 효율성을 증가 시킵니다. 상처 치유에서 쥐 모델 인간의 상처 치유 과정을 닮 고 소형 실험 동물 임상 상태를 모방 하는 심각한 상처 상태를 생성 합니다.

프로토콜

아래에 제시된 모든 실험 프로토콜은 도쿄 여자 의과 대학 의과 대학 동물 복지 위원회의 승인을 받았으며 동물 실험의 올바른 수행을 위한 지침의 모든 요구 사항을 준수했습니다.

1. 동물, 악기, 문화 배지 및 요리의 준비

1. 20% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 최소 필수 배지 알파를 사용하여 완전한 배양 배지를 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 몇 달 동안 보관하십시오.
2. 성인 수컷 ZDF 쥐를 제2형 당뇨병성 비만 모델로 사용합니다. 수컷 루이스 쥐의 지방 패드를 사용하여 지방 조직을 분리하여 세포 시트를 준비합니다.

2. rASC의 격리 및 배양

1. 루이스 쥐(8-33주령, 수컷)에서 이소플루란을 사용하여 전신 마취 하에 지방 조직을 얻습니다.
   1. 설치류 기계식 인공호흡기와 4% 이소플루란을 준비합니다. 멸균 면봉 몇 개, 깨끗한 거즈, 메스, 바늘 홀더, 작동 중인 가위, 집게 한 쌍, 5-0 나일론 봉합사를 준비합니다. 수술 기구 및 용품을 소독하십시오.
   2. 얻어진 지방 조직을 임시로 보존하기 위해 10mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 100mm 페트리 접시를 준비합니다. 수집된 지방 조직을 측정하기 위해 수술을 시작하기 전에 저울을 사용하여 PBS로 페트리 접시의 무게를 잰다. 멸균 커튼에 수술 기구와 용품을 놓습니다.
   3. 설치류 기계식 인공호흡기를 통해 3 - 4%의 이소플루란을 사용하여 쥐를 마취하고 수술 중 쥐를 2 - 3%의 이소플루란으로 유지합니다. 각 쥐의 호흡 깊이와 속도를 관찰하여 마취 깊이를 모니터링합니다.
   4. 멸균 장갑을 착용한 상태에서 멸균 커튼 위에 쥐를 누운 자세로 놓습니다. 전기 면도기로 수술 부위를 면도하고 70% 에탄올에 적신 멸균 거즈를 사용하여 쥐의 복
   부를 청소합니다.
   5. 쥐의 측면 하복부에 메스로 약 5cm 길이의 피부 절개를 만듭니다. 외부 경사근을 노출시키고 해부합니다. 그런 다음 부고환을 둘러싼 부고환 지방 조직을 노출시킵니다. 부고환 지방 조직을 부드럽게 당겨 빼냅니다.
      참고: 지방 조직은 쥐의 복부 양쪽에서 얻을 수 있습니다.
   6. 부고환 지방 조직만 절제하여 부고환, 고환 및 부고환 혈관의 손상을 방지합니다(그림 S1). PBS의 절제된 지방 조직을 페트리 접시에 담궈 건조를 방지하고 조직의 무게를 잰다.
   7. 5-0 VICRYL로 복부 근육을 봉합하고 5-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다. 그런 다음 수술을 받은 각 쥐를 별도의 우리(우리당 쥐 1마리)로 되돌립니다.
      참고: 쥐가 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.
2. 2 - 3 g의 지방 조직에서 rASC를 분리하십시오 (Lewis rat에서 절제 및 이전에보고 된 방법에 따라 처리) ²⁷. 간단히 말해서, 절제된 지방 조직을 0.1% A형 콜라겐분해효소로 37°C에서 1시간 동안 효소로 분해하여 기질-혈관 분획(SVF; 그림 S2).
   1. 생물학적 세척 벤치에서 100μm 세포 여과기 여러 개, 50mL 튜브 여러 개, 15mL 튜브 여러 개 및 메스 2개를 준비합니다. 원심분리기를 켜고 수조를 37°C로 예열합니다. 또한 50mL 튜브에 A형 콜라겐분해효소 0.1%(최종 농도)로 약 50mL의 멸균 PBS를 준비합니다.
   2. 메스 두 개를 사용하여 지방 조직을 작은 조각으로 다집니다.
   3. 다진 지방 조직을 모두 50mL 튜브로 옮기고 PBS를 추가하여 총 부피를 15mL로 만듭니다.
   4. 50mL 튜브를 5분 동안 똑바로 세웁니다. 상층을 버리고 이물질을 제외한 하층을 수집합니다.
   5. 효소로 지방 조직을 분해하기 위해 상층이 포함된 PBS가 있는 50mL 튜브에 A형 콜라겐분해효소 용액 0.1%를 추가합니다.
      참고: 37°C의 수조에서 지방 조직 2 - 3 g당 약 20 mL의 PBS를 데웁니다.
   6. 50mL 튜브를 기울여 120 - 130rpm으로 37°C 수조에서 1시간 동안 부드럽게 흔듭니다.
   7. 흔든 후 50mL 튜브를 똑바로 세워 5분 동안 그대로 둡니다.
   8. 100μm 세포 스트레이너를 사용하여 용액을 여과하고 새 50mL 튜브에 용액을 붓습니다. 여과된 용액을 15mL 튜브 2개에 분주합니다.
   9. 15mL 튜브의 용액을 700 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액의 상층을 조심스럽게 제거하고 용액의 하층을 5mL 남겨 둡니다. 펠릿을 흡입하지 마십시오.
   10. 각 15 mL 튜브에 약 5 mL의 완전 배양 배지를 추가하고, 15 mL 튜브당 최대 10 mL를 추가하고, 펠릿을 조심스럽게 다시 현탁시킵니다.
   11. 2.2.8 - 2.2.9단계를 반복합니다. 그런 다음 SVF를 얻습니다.
3. 60cm² 배양 접시 2 개를 준비합니다. 700 × g에서 5분 동안 2회 원심분리 후 SVF를 수집합니다. SVF를 현탁하고 각 60cm² 배양 접시에 10mL의 SVF 용액을 플레이트화합니다.
4. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 접시를 배양합니다.
5. PBS와 0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 준비하고, 사용할 때까지 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
6. 초기 도금(24시간) 후 PBS로 셀을 3회 세척하여 부착되지 않은 세포와 파편을 제거합니다. 신선한 완전한 매체를 추가하십시오.
7. 3일차에 거의 sub-confluent에 있는 세포를 계대분석합니다. 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 추가하고 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 3 - 5분 동안 세포를 배양합니다.
   참고: 세포 손상을 방지하기 위해 10분 이내에 트립신화 단계를 완료하십시오.
8. 트립신화 후 광학 현미경으로 세포를 관찰하여 모든 세포가 접시에서 완전히 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 접시에 9mL의 완전 배양 배지를 추가합니다.
9. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
10. 1.7 x 10³ cells/^cm2의 밀도로 세포를 계대배양 3일까지 3일마다 3번씩 배양합니다. 계대배양된 세포를 5%_CO2 인큐베이터의 가습된 분위기에서 37°C로 배양합니다.

3. rASC 시트 생성

1. 직경 35mm의 온도 반응형 배양 접시를 여러 개 준비합니다. 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 1시간 이상 동안 FBS(또는 FBS를 포함하는 완전한 배지)로 접시를 사전 코팅합니다.
   알림: 직경 35mm의 온도 반응형 배양 접시는 시판되는 제품입니다.
2. 써모플레이트를 준비하고 다음 실험 절차를 위해 37°C에서 배양합니다.
   참고: 세포가 접시에서 자발적으로 분리되는 것을 방지하기 위해 37°C 열 플레이트에서 온도 반응형 배양 접시를 사용하여 모든 절차를 수행합니다.
   1. 실험 전에 절차에 사용된 전체 배양 배지를 37°C로 가열합니다.
   2. 루이스 쥐에서 유래한 종자 통로 3 rASCs를 2mL 총 부피의 완전 배양 배지를 사용하여 3일 동안 1.5 x 10⁵ cells/dish 직경의 35mm 직경 온도 반응형 배양 접시에 넣습니다.
      참고: rASC가 새로운 배양 접시에 도금될 때 균일한 rASC 파종과 균일한 두께의 rASC 시트를 얻기 위해 인큐베이터에서 접시를 앞뒤, 왼쪽, 오른쪽으로 천천히 흔들어야 합니다.
   3. 파종 후 3일차에 배지 2mL를 16.4μg/mL L-아스코르브산 인산염 마그네슘 염 n-수화물(AA)을 포함하는 완전 배양 배지 2mL로 37°C 열 플레이트에서 배양한 온도 반응형 배양 접시로 변경합니다.
      참고: 용존 AA는 -30°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
   4. 추가로 4 - 5일 동안 세포를 배양하고 2일마다 배지를 AA를 함유한 새로운 배지로 교체합니다.
   5. 광학 현미경으로 ASC의 증식과 생성을 확인하여 인접한 세포 시트의 세포 사이에 갭이 발생했는지 여부를 확인합니다.
3. cell sheet를 incubator에서 benchtop으로 15 - 20분 동안 옮겨 실온으로 냉각시킵니다.; 세포가 연속적인 cell sheet로 자발적으로 분리되는 것을 관찰합니다. 한 쌍의 집게로 접시 표면에서 rASC 시트를 수확합니다.
   알림: 일반적으로 rASC 시트는 한 쌍의 집게로 처리할 수 있습니다. 필요한 경우, 세포 시트가 부서지기 쉽고 깨지기 쉬운 경우 이식 멤브레인을 사용하여 배양 접시에서 상처 부위로 세포 시트를 옮길 수 있습니다.

4. full-thickness skin defect wound model의 준비 및 rASC 시트의 이식

1. 설치류 기계식 인공호흡기와 4% 이소플루란을 준비합니다. 멸균 면봉 여러 개, 깨끗한 거즈, 5-0 나일론 봉합사, 메스, 골막 박식술, 바늘 홀더, 작동 가위, 집게 한 쌍을 준비합니다. 수술 기구 및 용품을 소독하십시오. 멸균 커튼에 수술 기구와 용품을 놓습니다.
2. PBS를 준비하고 약간의 인공 피부 및 비접착성 드레싱과 함께 실온에서 유지하십시오. 인공 피부(15 x 10mm)와 비접착 드레싱(20 × 15mm)을 미리 자릅니다. 인공 skin.
   를 사용하기 전에 인공 피부의 내부 콜라겐 스폰지 층을 식염수에 담그십시오. 참고: 인공 피부는 외부 실리콘 시트 층과 내부 콜라겐 스폰지의 두 가지 층으로 만들어집니다.
3. ZDF 쥐 (16-18 주령, 수컷, 500-600g)를 제 2 형 당뇨병 및 비만의 상처 치유 모델로 사용하십시오.
4. 설치류 기계식 인공호흡기를 사용하여 4% 이소플루란을 흡입하여 ZDF 쥐를 마취합니다. 설치류 기계식 인공호흡기를 통해 이소플루란을 4 - 5%로 사용하여 마취를 유도하고 수술 중에는 3 - 4%로 유지합니다. 발가락 꼬집기를 통해 각 쥐의 호흡 깊이와 속도를 관찰하여 마취 깊이를 모니터링합니다.
5. 멸균 장갑을 착용한 상태에서 멸균 커튼에 쥐를 엎드린 자세로 놓습니다. 70% 에탄올에 적신 멸균 거즈를 사용하여 쥐의 머리를 청소하고, 전기 면도기로 수술 부위를 면도하고, 면도 후 70% 에탄올에 적신 멸균 거즈를 사용하여 피부를 청소합니다.
6. 표피에서 골막까지의 피부 조직을 제거하여 마취된 ZDF 쥐의 머리에 제곱된 전체 두께 피부 결함(15 x 10mm²)을 만듭니다. 메스로 피부와 피부 조직을 절제하고 골막절 천술로 골막을 제거합니다.
7. 35mm 온도 반응형 배양 접시의 rASC를 이식 직전에 인큐베이터에서 실온 환경으로 옮깁니다.
8. 35mm 온도 반응형 배양 접시의 rASC가 상처가 형성된 후 접시 표면에서 시트로 자발적으로 분리되는 것을 관찰합니다. 온도에 반응하는 배양 접시에서 7일 동안 배양한 후 rASC 시트를 수확합니다. 배양된 배지를 제거하고 PBS로 rASC 시트를 세 번 세척합니다. 건조를 방지하기 위해 이식할 때까지 rASC 시트를 PBS에 담그십시오.
9. 한 쌍의 집게를 사용하여 rASC 시트를 두개골 결손 바로 위에 놓습니다. 세포 시트가 부서지기 쉽고 깨지기 쉬운 경우, 멤브레인을 배양 접시에서 상처 부위로 세포 시트를 옮기기 위한 골격으로 사용할 수 있습니다.
10. rASC 시트와 결손부위를 인공피부(15 x 10mm²)로 덮고 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 약 10개의 봉합물로 상처를 봉합합니다. 상처를 보호하기 위해 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 인공 피부 위에 비접착 드레싱(20 x 15 mm²)을 올려 상처 환경을 촉촉하게 유지하고 삼출물을 흡수합니다.
    참고: 비접착성 드레싱은 적용 후 며칠 이내에 ZDF 쥐에 의해 제거됩니다. 따라서 이식 후 쥐를 정기적으로 모니터링 할 필요가 있습니다. 일반적으로 비접착성 드레싱은 전신 마취 하에 2일마다 교체합니다.
11. 수술을 받은 각 쥐가 완전히 회복될 때까지 별도의 우리로 되돌립니다(우리당 쥐 한 마리). 관찰 기간이 지난 후, 승인된 이소플루란 과다 투여 방법을 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.

결과

이 프로토콜 다루기 힘든 당뇨병 상처에 대 한 새로운 세포 기반 치료를 설정 하려고 했습니다. ( 그림 1에서 그림)로 짧게 수용자 rASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 정상적인 쥐에서 만들어진 하 고 전체 간격 피부 결함에 인공 피부의 bilayer를 사용 하 여 당뇨병 쥐에 이식 했다. 가벼운 현미경의 이미지 rASC 시트 (그림 2A)의 좋은 본보기와 rASC 시트 (그림 2B)의 나쁜 예를 들어 그림 2에 표시 됩니다. 때 ASCs는 새로운 문화 접시에 도금, 접시 천천히 앞뒤로 누 볐 어 및 왼쪽 및 오른쪽 유니폼 rASC 시드 및 균일 두께 rASC 시트 (그림 2A)을 달성 하는 인큐베이터에 있어야 합니다. rASCs를 균일 하 게 붙어 있을 수 없습니다 있으며 문화 접시의 표면에 교양, 시트 연속...

토론

성공적으로 경작 된 rASC 시트에 대 한 가장 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 1) 온도 약 37 ° C에서 온도 응답 문화 요리에 경작 하는 동안 유지 되어야 합니다. RASC 시트를 생성 하는 동안 모든 절차 37 ° C 온도-접시에, 수행 하 고 모든 시 약은 저절로 요리³¹에서 분리에서 세포를 방지 하기 위해 37 ° C로 예 열. 2) 받는 사람에서 쥐 rASC 시트의 성공적인 이식에 대 한 중요 한 비 접착 드레싱의 제거를 방지 하기 위해 모니터링 해야 합니다. 드레싱 제거 되 면 새로운 비 접착 드레싱 상처 사이트에서 분리에서 이식된 ASC 시트를 방지 하기 위해 적용 되어야 합니다.

이 절차를 사용 하 여, rASC 시트 일반적으로 얻은 했다 시드 통로의 5-7 일 이내 3 셀 온도 응답 문화 요리. 초기 셀 밀도와 AA를 포함 하는 완전 한 문화 매체 적용 시간 rASC 시트를 생성 하는 데 필요한 문화 시간을 조정할...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
α-MEM glutamax	Invitrogen	32571-036	Carlsbad, CA
태아 소 혈청 (FBS)	Japan Bioserum Co Ltd.	S1650-500
페니실린/스트렙토마이신	Life Technologies	15140-122
콜라겐분해효소 A	Roche Diagnostics	10 103 578 001	독일 만하임
60 cm2 Primaria 조직 배양 접시	BD Biosciences	353803	Franklin Lakes, NJ
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수(PBS)	Life Technologies	1490-144
0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)	Life Technologies	25200-056
L-아스코르브산 인산염 마그네슘염 n-수화물	Wako	013-19641
35mm 온도 반응형 배양 접시(UpcellTM)	CellSeed	NUNC-174904	일본 도쿄(
MP-1000)	Kitazato Science Co., Ltd.	1111
설치류 기계식 인공호흡기	Stoelting	#50206	Wood Dale, IL
4% 이소플루란	Pfizer Japan	114-13340-3	Tokyo, Japan
인공 피부 (Pelnac® )	스미스 & 조카	PN-R40060	일본 도쿄
-비접착성 드레싱 (Hydrosite plus® )	스미스 & 조카	66800679	Allevyn non-adhessing®로 알려져 있습니다. 미국에서
5-0 나일론 봉합	Alfresa	EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES	greiner bio-one	227 261
15 mL 원심분리기 튜브	Corning Incorporated	430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL	Hu-Friedy	P14	Chicago, IL