Summary
Liggende under adipose-avledet stilk celler (ASCs) er enkelt isolert og høstet fra fettet til vanlig rotter. ASC ark kan lages med cellen arks engineering og kan være transplantert inn Zucker diabetiker fet rotter viser full-tykkelse hud defekter utsatt bein og deretter dekket med en bilayer av kunstig huden.
Abstract
Kunstig huden har oppnådd betydelig terapeutiske resultater i klinisk praksis. Men kan kunstig hudbehandlinger for sår i diabetespasienter hindret blodstrøm eller store sår bli forlenget. Cellen-basert behandling har dukket opp som en ny teknikk for behandling av diabetiker magesår, og cellen arks engineering har forbedret effekten av cellen transplantasjon. En rekke rapporter har antydet at liggende under adipose-avledet stilk celler (ASCs), en type mesenchymal stromal cell (MSC), ha terapeutiske potensial på grunn av deres relative overflod i fettvev og deres tilgjengelighet for samling i forhold til MSCs fra andre vev. Derfor synes ASCs å være en god kilde til stamceller for terapeutisk bruk. I denne studien ble ASC ark fra epididymal adipose fett av vanlig Lewis rotter opprettet med temperatur-responsive kultur retter og normal kultur medium som inneholder askorbinsyre. ASC arkene ble transplantert inn Zucker diabetiker fatty (ZDF) rotter, en rotte modell av type 2 diabetes og fedme, som viser redusert sårtilheling. Et sår ble opprettet på bakre skallen overflate, ASC ark ble transplantert i såret og en bilayer kunstig hud ble brukt til å dekke ark. ZDF rotter mottatt ASC ark hadde bedre sårtilheling enn ZDF rotter uten transplantasjon av ASC ark. Denne tilnærmingen var begrenset fordi ASC ark er følsomme for tørre forhold, som krever vedlikehold av et fuktig såret miljø. Derfor ble kunstig huden brukt til å dekke ASC arket for å hindre tørking. Allogenic transplantasjon av ASC ark i kombinasjon med kunstig huden kan også gjelde andre vanskelige sår eller forbrenninger, som observert med perifere arterial sykdom og kollagen sykdom, og kan gis til pasienter som er underernærte eller bruker steroider. Denne behandlingen kan dermed være første skritt mot å forbedre behandlingsalternativer for diabetiker sår helbredelse.
Introduction
Befolkningen i diabetespasienter er økende over hele verden og nådde 400 millioner i 20151; rundt 15-25% av pasienter med diabetes er utsatt for utviklingen av en nedre ekstremitet diabetiker sår2. Nedre ekstremitet diabetiker sår er vanskelige og krever en terapeutisk lengre med rehabilitering trening etter fullstendig gjenoppretting. En lang behandling periode ofte resulterer i en betydelig reduksjon i pasienten livskvalitet. Derfor må det utvikles nye behandlingsformer som redusere eller hindre forverring for behandling av diabetiker sår. For å evaluere diabetiker sårheling, vi optimalisert en diabetiker sår sår-tilheling modell i rotter, som etterligner praktisk klinisk betingelser, og vurdert om transplanting liggende under adipose-avledet stilk cellen (ASC) ark ved hjelp av cellen arks engineering akselerert sårtilheling.
Mesenchymal stromal celler (MSCs) viser en utmerket potensial for akselererende sårheling på grunn av deres selvtillit fornyelse kapasitet, deres immunmodulerende effekter og evnen til å differensiere i ulike celle linjene3. ASCs er en type MSC Hentet fra fettvev, og de viser flere fordeler sammenlignet med MSCs avledet fra andre vev, inkludert angiogenic potensielle og paracrine aktivitet4,5. Fettvev er relativt rikt på kroppen sin tilgjengelighet tillater samlingen med minimal invasiv prosedyrer. Derfor har ASCs blitt brukt eksperimentelt for sårhelende programmer6,7.
Tidligere rapporter har vist at den direkte injeksjon av encellede MSC suspensjoner i områdene rundt sår kan akselerere sårheling8,9. Men til tross for rapporter om akselerasjon av sårheling diabetiker sår modeller etter injeksjon av encellede suspensjoner, er overlevelse tidspunktet for transplantert celler i såret området ikke klart.
I denne studien brukt vi celle arks engineering bruker temperatur-responsive kultur retter. Disse rettene har temperaturen svarer polymer N- isopropylacrylamide covalently bundet til deres overflate10. Podet polymer laget tillater temperaturkontrollert celle vedheft til eller avdeling fra overflaten av kultur parabolen. Overflaten av fatet blir hydrofobe ved 37 ° C, slik at cellene å overholde og sprer, mens celler spontant koble fra overflaten når det blir hydrofile ved temperaturer under 32 ° C. Kultivert celler kan høstes som sammenhengende celle ark med intakt celle til celle veikryss og ekstracellulære matriser (ECMs) ved å redusere temperaturen; Dermed er proteolytiske enzymer som skade ECM, som trypsin, ikke nødvendig11. Derfor kan celle arks engineering bevare celle til celle tilkoblinger og forbedre effekten av cellen transplantasjon.
I tillegg øker celle arks transplantasjon celle overlevelse sammenlignet med celle injeksjon12. I denne protokollen, ble Zucker diabetiker fet (ZDF) rotter valgt som type 2 diabetes og fedme modell med forsinket sårtilheling. ZDF rotter utvikle spontant fedme på ca 4 uker. De deretter utvikle type 2 diabetes med fedme mellom 8 og 12 ukens av alderen, da de viser hyperglykemi assosiert med insulin resistens, dyslipidemi og hypertriglyceridemia13. Forsinket sårheling, redusert blodstrøm i perifere blodkar og diabetiker nephropathy er også observert14,15,16. Videre kan ZDF rotter være en passende modell for å studere helbredelse av uløselige kutan sår, som diabetisk magesår.
Forskjellene mellom mennesker og gnagere i sårhelende mekanismer er forbundet med anatomiske forskjeller i huden. Sårheling i vanlig rotter er basert på såret kontraksjon, mens sårheling hos mennesker er basert på nytt epithelialization og korning vev formasjonen. Vanligvis såret splinting brukes på gnager modeller bidrar til å minimere såret sammentrekning og gir gradvis dannelsen av korning vev17, selv om sår i nondiabetic rotter er nesten helt lukket av sammentrekning. Imidlertid diabetiker sår sammentrekning i ZDF rotter er svekket, og sårtilheling primært oppstår gjennom re epithelialization og korning vev formasjonen; Dermed er denne prosessen mer lik menneskelige sårheling14.
Diabetiker sår med utsatt bein etter rensing er ofte møtte klinisk. Tidligere studier har undersøkt 12 mm diameter full-tykkelse huden sår på ryggen av athymic naken mus18,19 og 10 mm diameter full-tykkelse huden sår på ryggen av normal mus20. For å utvikle en klinisk modell for alvorlig diabetiker sår, større (15 x 10 mm2) full-tykkelse hud defekter med synlige og uten periosteum ble opprettet, som beskrevet tidligere21, i rotter med type 2 diabetes og fedme.
Rotte ASC (rASC) ark fra ASCs normal Lewis rotter ble opprettet via allogenic transplantasjon av ASC ark. I klinisk praksis er autolog transplantasjon drivverdige fordi diabetiker pasienter med sår oppfører seg ofte alvorlig diabetiker komplikasjoner, som ukontrollert høyt blodsukker og høy body mass indekser, og disse komplikasjoner årsaken sårhelende lidelser som øker vanskelighetene med å skaffe fettvev fra disse pasientene. Videre ASCs fra dyr med diabetes utstillingen endret egenskaper og nedsatt funksjon22. Derfor beskriver protokollen presenteres her allogenic transplantasjon av rASC ark fra vanlig rotter og bruk av kunstig huden til diabetiker rotter.
Bilayer kunstig huden brukes i denne protokollen hindrer spontan sammentrekning av sår, fremmer syntesen av en ny bindevev matrise og ligner ekte dermis23. I denne protokollen, er kunstige huden plassert på en rASC ark og fast med nylontråder å forhindre sår sammentrekning eller utvidelse som følge av løs rotte huden. Dessuten, kunstige huden gir en tredimensjonal ramme for ASC arkene opprettholder et fuktig miljø for transplantert ASC ark og sår og beskytter sår fra infeksjon og ytre krefter. Til slutt, en ingen-klebe-dressing er plassert over såret å beskytte den mot eksterne påkjenninger, opprettholde et fuktig såret miljø og absorbere sårvæske.
En rASC er tynn, fleksibel og deformerbare og kan bli overholdt flytte mottaker områder, for eksempel en bankende hjerte24. Celle-ark er brukt for gjenoppbyggingen av ulike vev og kan generere helbredende effekter25,26. ASC ark som stiller ut kliniske terapeutiske potensialet kan akselerere healing for mange typer av sår. Videre allogene transplantasjon av ASC ark, kombinert med bruk av kunstig hud, kanskje er relevante for behandling av vanskelige sår eller forbrenninger, som observert i perifere arterial sykdom eller kollagen sykdom, eller de kan gis til pasienter som er underernærte eller bruker steroider. Denne metoden øker effektiviteten av transplanting ASCs. Sårhelende ZDF rotte modell produserer en alvorlig såret tilstand som ligner menneskelige såret helbredelsesprosessen og etterligner klinisk betingelser i en lite eksperimentelle dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen forsøkte å etablere en ny cellen-basert terapi for intractable diabetiker sår. Kort (som illustrert i figur 1), fører allogene rASC ark ble opprettet fra vanlig rotter bruke celle arks engineering og ble deretter transplanted bruker en bilayer av kunstig huden på en full-tykkelse huden feil på rotte diabetiker. Lys mikroskop bilder av et godt eksempel på en rASC ark (figur 2A) og et dårlig eksempel for en rASC ark (figur 2B) er vist i figur 2. Når ASCs er belagt på en ny kultur parabol, skal retten sakte rocka frem og tilbake og venstre og høyre i en inkubator uniform rASC frø og et jevnt tykke rASC ark (figur 2A). Hvis rASCs ikke kan være jevnt knyttet og kultivert på overflaten av kultur parabol, samles ikke arket som sammenhengende ASC ark (figur 2B). Figur 3 viser ASC ark som har vært høstet som sammenhengende celle ark ved romtemperatur fordi ASCs var jevnt tilknyttet tallerken overflaten. RASC ark kan vanligvis behandles med en tang. Hvis nødvendig, en overføring membran kan brukes til å overføre en celle ark fra kultur parabol til såret området, for eksempel hvis er cellen arket sprø og skjøre.
Figur 4 viser ZDF rotter som en diabetiker sårhelende modell og transplantasjon av allogene rASC ark kombinert med kunstig huden. En rASC ark er myk og fleksibel, justerbar i størrelse og kan utvides til hvert hjørne av såret området med en tang (Figur 4A-F). RASC ark-dekket feilen var også dekket med kunstig hud (15 x 10 mm2) og sutured med ca 10 sting med en 5-0 nylon Sutur (figur 4G). For å beskytte såret, et fuktig såret miljø ble opprettholdt og eksudater ble absorbert, en ingen-klebe dressing (20 x 15 mm2) ble plassert over kunstig huden og 5-0 nylon sømmer ble brukt (figur 4I). Ingen-klebe dressing er ofte fjernet av ZDF rotter i flere dager med programmet. Derfor må rotter overvåkes etter transplantasjon. Vanligvis erstattes ikke selvklebende dressing hver 2 dager under narkose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Makroskopisk fotografier i figur 5 er representativt resultatene av transplantasjon av en rASC ark. I vår forrige studie var gjennomsnittlig såret området i rASC ark transplantasjon gruppen (figur 5B) betydelig mindre enn i kontrollgruppen (figur 5A). For kontrollene ble bare kunstig huden brukt til å dekke såret, uten transplantasjon av en rASC ark. Disse bildene ble tatt på 14th dagen etter etableringen av såret (n = 6 i hver gruppe)31.
Figur 1: skjematisk av eksperimentelle transplantasjon prosedyren. Skjematisk av eksperimentelle transplantasjon prosedyren utføres med et allogene rotte liggende under adipose-avledet stilk cellen (rASC) ark og kunstig huden i en rotte sårhelende modell av type 2 diabetes og fedme. (A) rotte adipose vev var inngrep forbrukeravgift fra vanlig Lewis rotter. rASCs ble isolert og seeded på en 60 cm2 kultur parabol og kultivert på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 7-8 dager. (B) rASCs var subcultured hver 2-3 dager, og passering 3 rASCs var frø på en 35 mm diameter temperatur-responsive kultur parabol. Cellene ble kultivert i fullstendig medium som inneholder 16.4 µg/mL L-ascorbic syre fosfat magnesium salt n-hydrat (AA) ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 7-8 dager. RASCs ble høstet som sammenhengende rASC ark ved å redusere temperaturen til 20 ° C. (C) rASC ark transplantert til 15 x 10 mm2 full-tykkelse huden feil med utsatt bein på hodene til rotter viser diabetes og fedme (Zucker diabetiker fet (ZDF) rotter) brukes som sårhelende modell. (D) en rASC ark var plassert på skallen direkte over feilen og dekket) med en 15 x 10 mm2 ark bilayer kunstig hud, som var sutured i sted med 10 nylon (5-0) suturer. Diabetes 2015, 64: 2723-2734; med tillatelse. Diabetes (c) copyright (2015) av American Diabetes Association. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Lys mikroskop bilder av ASCs. Lys mikroskop bilder av ASC spredning til kanten av kultur, uten mellomrom mellom ASCs. (A) en rASC ark med en ensartet tykkelse i alle retninger 7 dager etter starten av dyrking (A). (B) en rASC ark uten uniform seeding. Et sammenhengende rASC ark kan fås på dag 7 etter starten av dyrking (B). Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Time-lapse bilder av rASC ark statuer ved romtemperatur. Tid-lapse bilder av statusen for en rASC ark ved romtemperatur. rASCs på en 35 mm diameter temperatur-responsive kultur parabol spontant og gradvis løsrevet fra parabolen overflaten ved romtemperatur (ca 20 ° C) og ble høstet som sammenhengende ark. (A) ca 5 min etter flytting temperatur-responsive kultur parabol til romtemperatur. (B) ca 10 min etter flytting 35 mm diameter temperatur-responsive kultur parabol til romtemperatur. (C) ca 20-30 min etter flytting temperatur-responsive kultur parabol til romtemperatur. Dette er en god kvalitet rASC ark (C). (D-E) rASC ark status ca 20-30 min etter flytting temperatur-responsive kultur parabol til romtemperatur. Dette rASC arket er av gjennomsnittlig kvalitet (D). (F-G) rASC ark behandles vanligvis med en tang. Hvis cellen arket er sprø og skjøre, kan en membran brukes som et stillas for overføring celle arket fra kultur parabol til såret området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Gang-serie bilder av sår skaperverket og rASC ark transplantasjon med kunstig hud og en ikke-klebende Dressing
Tid serie bilder av såret opprettelse og rASC ark transplantasjon med kunstig hud og en ingen-klebe-dressing. (A) hodene på ZDF rotter var barbert med en elektrisk barberhøvel. Etter barbering kroppshår, var merker (15 x 10 mm2) tegnet med en fet hydrofobe penn. (B) en full-tykkelse huden defekt (15 x 10 mm2) ble opprettet på hodet av en bedøvet ZDF rotte ved å fjerne kutan vev fra overhuden å periosteum. Huden og kutan vevet ble fjernet med en skalpell og periosteum ble fjernet med en periostal rasper. Bruker gasbind fuktet med sterilt saltvann, ble press brukt for å stoppe blødningen etter excision. (C) rASC ark transplantasjon. En rASC ark ble plassert over feilen rett over skallen av rotte med en tang. (D-G) Justere rASC ark forlengelsen å matche sår størrelse. Den rASC er fleksibelt, justerbart, og kan utvides til hvert hjørne av såret området med en tang. For større sår, kan to eller tre fleksible rASC ark stables. (H) Suturing kunstig huden dekke det rASC arket. Feilen og transplantert rASC arket var dekket med kunstig hud (15 x 10 mm2), som var sutured med 10 sting med 5-0 nylon sømmer. (jeg) Suturing av ikke-limet dressing (20 x 15 mm2) til såret området dekket med kunstig hud. For å beskytte såret, ble ikke selvklebende dressing (20 x 15 mm2) plassert over kunstig huden med 5-0 nylon sømmer. Diabetes 2015, 64: 2723-2734; med tillatelse. Diabetes (c) copyright (2015) av American Diabetes Association. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: makroskopisk bilder av Full-tykkelse hud defekter. Makroskopisk fotografier av full-tykkelse hud defekter uten transplantasjon av en rASC ark (A) og med transplantasjon av en rASC ark (B) 14 dager etter såret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigste trinnene for dyrking er en rASC ark er som følger: 1) temperaturen må opprettholdes på ca 37 ° C under dyrking på temperatur-responsive kultur retter. Under opprettingen av en rASC ark, hver prosedyren ble utført på en 37 ° C thermo-plate, og hver reagens ble varmet til 37 ° C for å hindre at cellene spontant frakobling fra parabolen31. 2) mottaker ZDF rotter må overvåkes for å hindre fjerning av ikke-klebende dressing, som er avgjørende for vellykket transplantasjon av rASC ark. Hvis dressing er fjernet, må en ny ikke-klebende dressing brukes for å hindre at transplantert ASC arkene frakobling fra såret området.
Bruker denne fremgangsmåten, anskaffet rASC ark vanligvis innen 5-7 dager fra såing passering 3 celler temperatur-responsive kultur retter. Kultur tiden det tar å generere en rASC ark justeres etter den første celle tettheten og hvor fullstendig kultur medium med AA er brukt. Hvis en rASC ark festet rett under cellen dyrking, rASC arket skal gjenvinnes og flere retter bør være forberedt ved celle avdeling.
Begrensningene for denne protokollen er som følger: 1) strenge temperatur ledelse må brukes for å opprettholde en omtrentlig temperatur på 37 ° C under hele prosessen ved temperatur-responsive kultur retter. 2) etter å skaffe en rASC ark, må spesiell medisinsk utstyr brukes til å vedlikeholde fuktige forhold, fordi det rASC arket er sensitive til tørre forhold. 3) postoperativ ledelse, inkludert daglige observasjon av tilstanden til mottakeren rotte, kreves.
Større sår med utsatt bein er ofte observert klinisk. For eksempel kan trafikkulykke traumer, brannskader, infiserte sår og skadet eller nekrose sår etter rensing utvikle seg til store sår med utsatt bein. Her, ble en klinisk modell av alvorlige sår utviklet med en stor, full-tykkelse hud defekt utsatt bein i rotter med type 2 diabetes og fedme. Denne modellen har potensial til å bli brukt som en standard modell for å vurdere sårheling i diabetiker rotter.
Kunstig huden er kommersielt tilgjengelige medisinsk utstyr for full-tykkelse hud defekter etter rensing rekombinant grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) har vært mye brukt for sårheling for å fremme angiogenese og korning. Disse to behandlinger har vært brukt oppnå betydelig terapeutiske resultater, selv for kroniske sår, som diabetisk sår. Det har blitt rapportert at ASCs skiller angiogeneic vekstfaktorer28, som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), hepatocyte vekstfaktor (HGF) og bFGF, som kan bidra til neovascularization29,30 og akselerere sårtilheling. Vår forrige studie bekreftet at ASCs kontinuerlig skiller disse vekstfaktorer31. Derfor ASC ark, kombinert med kunstig hud, har potensial til å bli brukt som et nytt terapeutisk alternativ for akselererende endometrial blodkar og sårtilheling31, og disse kan være gjelder for behandling av mange typer vanskelige sår eller forbrenninger i menneskets kliniske innstillinger i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Følgende forfattere avsløre økonomiske relasjoner relevant for denne publikasjonen: Teruo Okano er grunnlegger og direktør av cellen frø Inc., som lisenser teknologi og patenter fra Tokyo kvinners medisinske universitet, og Teruo Okano og Masayuki Yamato er interessenter i cellen frø Inc. Tokyo kvinners medisinske universitet mottar forskningsmidler fra cellen Seed Inc. Andre forfattere erklærer at de ikke har økonomiske relasjoner relevant for denne publikasjonen.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Yukiko Koga avdeling av plast og rekonstruktiv kirurgi, Juntendo University School of Medicine, for å gi praktiske råd. Vi har også takke Mr. Hidekazu Murata av diabetiker sentrum av Tokyo kvinnenes Medical University School of Medicine utmerket kundestøtte. Denne studien ble støttet av etableringen av innovasjon sentrene for avanserte tverrfaglig forskning områder programmet prosjektets for utvikling innovasjon systemer "celle ark Tissue Engineering Center (CSTEC)" fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60 cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
