Method Article

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

DOI:

10.3791/54543

⸱

September 15th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자가항체는 자가항원에 대항하는 항체로, 많은 질병 상태에 존재하며 질병 활성도의 표지자 역할을 할 수 있습니다. 특정 항원에 대한 자가항체 수준은 일반적으로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기법으로 검출됩니다. 그러나 ELISA로 여러 자가항체를 스크리닝하는 것은 시간이 많이 걸리고 많은 양의 환자 샘플이 필요할 수 있습니다. 항원 마이크로어레이 기술은 멀티플렉스 방식으로 자가항체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 대체 방법입니다. 이 기술에서는 항원을 로봇 마이크로어레이어를 사용하여 특별히 코팅된 현미경 슬라이드에 배열합니다. 슬라이드는 환자 혈청 샘플로 조사된 후 형광 표지된 2차 항체를 추가하여 혈청 자가항체가 항원에 결합하는 것을 검출합니다. 자가항체 반응성은 형광 신호를 감지할 수 있는 스캐너로 슬라이드를 스캔하여 드러나고 정량화됩니다. 여기에서는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 당사의 현재 어레이는 9개의 솔리드 핀으로 인쇄되어 있으며 중복으로 발견된 최대 162개의 항원을 포함할 수 있습니다. 어레이는 microarrayer에 의해 사용되는 소스 플레이트의 항원을 변경하여 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다. 당사는 동일한 슬라이드 표면에서 IgG와 IgM 반응성을 구별할 수 있는 2색 2차 항체 검출 체계를 개발했습니다. 검출 시스템은 인간과 쥐 자가항체의 결합을 연구하도록 최적화되었습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자가항체는 많은 질병 상태에 존재하며 종종 직접적인 병원성 활성을 가질 수 있습니다1. 자가항체의 확인은 특정 질병의 진단, 질병 결과의 예후, 특정 치료법의 혜택을 받을 수 있는 환자의 분류에 중요하다2. 자가항체는 일반적으로 ELISA 기술을 사용하여 환자 혈청에서 식별됩니다. 그러나 이 기법으로 여러 항원을 스크리닝하는 것은 힘들고 많은 양의 환자 샘플을 소비합니다. 따라서 더 큰 규모로 자가항체를 프로파일링하기 위해서는 새로운 기술이 필요합니다.

항원 마이크로어레이 기술은 자가항체를 멀티플렉스 방식으로 프로파일링할 수 있는 단백질체 기술입니다3. 이 프로세스의 첫 번째 단계에서는 로봇 마이크로어레이어를 사용하여 항원 라이브러리를 슬라이드 표면에 배열합니다. 슬라이드를 희석된 혈청으로 프로빙한 다음 형광 표지된 2차 항체를 추가합니다. 항체 반응성은 마이크로어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하여 시각화하고 형광 강도로 정량화합니다. 항원 마이크로어레이는 자가항체를 스크리닝하는 데 ELISA 기술에 비해 여러 가지 이점을 제공합니다: 1) 여러 항원에 자가항체를 동시에 프로파일링하기 위해 마이크로리터의 혈청만 필요하고, 2) 나노리터의 항원만 어레이에 발견되기 때문에 항원을 드물게 사....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 희석 항원 및 생성 항원 마이크로 어레이

  1. 0.2 mg / ml의 최종 농도로 PBS에 희석 항원. 9 핀과 미세 배열 구성과 중복에서 162까지 고유의 항원을 인쇄합니다. 항원 라이브러리로 양성 대조군에서의 IgG 및 IgM의 항원을 포함합니다. 단지 음성 대조군으로 PBS를 포함합니다.
  2. 384 잘 소스 판에 각 항원의 20 μl를 추가합니다. 프린트 헤드의 설치 미러 그룹의 소스 플레이트에 항원을 추가 (9 핀 인쇄에 사용하는 경우 등, (9)의 그룹이 항원을 준비).
  3. 배열을 인쇄 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 박 및 동결와 커버 소스 판.
  4. 3 × 1 분 동안 탈 이온수와 초음파 처리 조에서이를 배양하여 고체 미세 배열 핀을 청소합니다. 랙에 배치 핀은 건조 후 마이크로 어레이 프린트 헤드의 핀을 배치합니다. 9 핀, 3 × 3 구성을 사용합니다.
  5. 프린트 헤드 번호 핀을 설정하여 실행 인쇄 프로그램 미세 배열,슬라이드의 수는 각 슬라이드에, 패드의 번호를 인쇄하고, 각 항원에 대한 복제 지점 수 있습니다. 일반적으로 9 핀, 70 슬라이드, 2 패드 / 슬라이드, 각 항원에 대한 2 복제 지점을 사용합니다. 프로그램 미세 배열은 항원의 다른 그룹 사이에 물에 핀을 초음....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도 1에 나타낸 바와 같이 항원 로봇 미세 배열로 슬라이드 상에 384 웰 플레이트에 배치되어 인쇄된다. 2는 배양 챔버와 처리 후의 스캔 슬라이드 프레임에 배치 된 슬라이드를 나타낸다. (3) 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 나타낸다. 네가티브 슬라이드은 이차 항체로 프로빙하고, 양성 대조군 슬라이드 전신성 홍 반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로브된다. 두 별도로 표지 이차 항체를 이용하여 IgG를 및 IgM의 반응성이 동일한 슬라이드 표면에서 분리 될 수있다. (4)도 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 및 IgG를 다양한 위에 리보솜 P (Ribo를 P)에 대한 항체에 대한 IgM의 항체의 형광 강도를 나타낸다 혈청 희석의 범위. P Ribo에 대해 알려진 반응성 전신성 홍 반성 루푸스 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 프로토콜 항원 마이크로 어레이 기술을 이용하여자가 항체의 정량을 허용한다. 항원 마이크로 어레이는자가 항체 선별에 기존의 ELISA에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 우선, 핵산, 단백질, 펩티드, 및 세포 용 해물을 포함하는 다양한 항원에 따라서 다중화자가 항체 스크리닝을 허용 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드 상에 배치 될 수있다. 항원 나노 리터 각 슬라이드에 발견되기 때문에, 또, 항원의 마이크로 그램의 어레이를 생성 할 필요가있다. 100 샘플 희석 혈청의 5 μL가 1 배열 표면을 조사하는 데 필요한대로 배열은 매우 작은 환자 샘플을 필요로한다. 마지막으로, 배열은 니트로 셀룰로오스에자가 항체 9 검사에서 기존의 ELISA보다 더 민감한 것으로 나타났다 발견했다.

자가 항체에 대한 항원 스크리닝 마이크로 어레이를 사용하는 것 외에도, 상기 배열은 사용 될 수D는 단일 클론 항체의 특이성을 정의하고, 이전에 설명 된 바와 같이.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C.는 캐나다 심장 및 뇌졸중 재단(Heart and Stroke Foundation of Canada)의 박사 후 연구원과 재생 의학 교육 프로그램(Canadian Institutes of Health Research)의 지원을 받았습니다.F.Y.Y.H.는 재생 의학 교육 프로그램(Training Program in Regenerative Medicine)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 Astellas Pharma Canada의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 Mark Menenghini 박사(토론토 대학교)의 Axon 마이크로어레이 스캐너를 사용해 주신 데 대해 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ribosomal P0Diarect14100에서 0.2mg/
ml로 희석, PBS
인간 IgMJackson Immuno009-000-0120.2mg/ml로 희석, PBS
마우스 IgGSigma-AldrichI53810.2mg/ml로 희석, PBS 마우스 IgM Biolegend 401601
에서 0.2mg/ml로 희석PBS 이중 가닥 DNA에서 0.2 mg/ml로 희석
Sigma-AldrichD1626에서 0.2 mg/ml로 희석
PBS에서 0.2 mg/ml로 희석
VirtekVersArray Chipwriter Pro많은 유형의 어레이어가 적합합니다
Arrayer, Arrayit CorporationSSP015
로봇 마이크로어레이 VirtekChipwriter Pro를 위한 소프트웨어 
FAST 슬라이드(2 패드)GVS Northa America10485317
FAST 프레임GVS Northa America10486001
FAST 인큐베이션 챔버(2 패드)GVS Northa America10486242
384웰 플레이트Whatman7701-5101
플레이트 실러VWR60941-062
호일 플레이트 커버VWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
태아 송아지 혈청Invitrogen12483020
Cy3 염소 항인간 IgGJackson Immuno109-165-09650% glyercol
Cy5 염소 항인간 IgMJackson Immuno109-175-129사용 50% glyercol
Cy3 염소 안티 마우스 IgGJackson Immuno115-165-07150% glyercol
Cy5 염소 안티 마우스 IgMJackson Immuno115-175-075사용 작업 재고 50% glyercol
Microarray 스캐너분자 장치 Molecule DevicesAxon 4200A
Microarray 소프트웨어분자 장치Genepix 6.1
클러스터링 소프트웨어eisenlab.orgCluster 3.0
Heatmap softwareeisenlab.orgTreeview 1.60
Microarray 통계 소프트웨어Stanford UniversitySAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)
은 PBS 인간 IgG Jackson Immuno 009-000-003에서 에서 은 PBS 단일 가닥 DNA, microarrayer, , .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention....

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