방법 논문

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

DOI:

10.3791/54543

⸱

2016년 9월 15일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

초록

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자가항체는 자가항원에 대항하는 항체로, 많은 질병 상태에 존재하며 질병 활성도의 표지자 역할을 할 수 있습니다. 특정 항원에 대한 자가항체 수준은 일반적으로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기법으로 검출됩니다. 그러나 ELISA로 여러 자가항체를 스크리닝하는 것은 시간이 많이 걸리고 많은 양의 환자 샘플이 필요할 수 있습니다. 항원 마이크로어레이 기술은 멀티플렉스 방식으로 자가항체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 대체 방법입니다. 이 기술에서는 항원을 로봇 마이크로어레이어를 사용하여 특별히 코팅된 현미경 슬라이드에 배열합니다. 슬라이드는 환자 혈청 샘플로 조사된 후 형광 표지된 2차 항체를 추가하여 혈청 자가항체가 항원에 결합하는 것을 검출합니다. 자가항체 반응성은 형광 신호를 감지할 수 있는 스캐너로 슬라이드를 스캔하여 드러나고 정량화됩니다. 여기에서는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 당사의 현재 어레이는 9개의 솔리드 핀으로 인쇄되어 있으며 중복으로 발견된 최대 162개의 항원을 포함할 수 있습니다. 어레이는 microarrayer에 의해 사용되는 소스 플레이트의 항원을 변경하여 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다. 당사는 동일한 슬라이드 표면에서 IgG와 IgM 반응성을 구별할 수 있는 2색 2차 항체 검출 체계를 개발했습니다. 검출 시스템은 인간과 쥐 자가항체의 결합을 연구하도록 최적화되었습니다.

서론

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자가항체는 많은 질병 상태에 존재하며 종종 직접적인 병원성 활성을 가질 수 있습니다1. 자가항체의 확인은 특정 질병의 진단, 질병 결과의 예후, 특정 치료법의 혜택을 받을 수 있는 환자의 분류에 중요하다2. 자가항체는 일반적으로 ELISA 기술을 사용하여 환자 혈청에서 식별됩니다. 그러나 이 기법으로 여러 항원을 스크리닝하는 것은 힘들고 많은 양의 환자 샘플을 소비합니다. 따라서 더 큰 규모로 자가항체를 프로파일링하기 위해서는 새로운 기술이 필요합니다.

항원 마이크로어레이 기술은 자가항체를 멀티플렉스 방식으로 프로파일링할 수 있는 단백질체 기술입니다3. 이 프로세스의 첫 번째 단계에서는 로봇 마이크로어레이어를 사용하여 항원 라이브러리를 슬라이드 표면에 배열합니다. 슬라이드를 희석된 혈청으로 프로빙한 다음 형광 표지된 2차 항체를 추가합니다. 항체 반응성은 마이크로어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하여 시각화하고 형광 강도로 정량화합니다. 항원 마이크로어레이는 자가항체를 스크리닝하는 데 ELISA 기술에 비해 여러 가지 이점을 제공합니다: 1) 여러 항원에 자가항체를 동시에 프로파일링하기 위해 마이크로리터의 혈청만 필요하고, 2) 나노리터의 항원만 어레이에 발견되기 때문에 항원을 드물게 사용하며, 3) ELISA에 비해 향상된 감도3를 가지고 있으며 4) 아직 동시성을 허용합니다. 하나 이상의 항체 동형을 별도로 검출합니다. 항원 마이크로어레이는 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 전신성 홍반성 루푸스4-6과 같은 자가면역 질환에서 자가항체를 프로파일링하는 데 사용되었습니다. 이 세 가지 질병 모두에서 어레이를 사용하여 대규모로 자가항체를 프로파일링하여 질병 발병에 대한 새로운 통찰력을 얻었습니다.

여기에서는 니트로셀룰로오스 코팅 슬라이드를 사용하여 항원 마이크로어레이를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 단백질, 펩타이드 및 세포 용해물을 포함한 다양한 항원을 이 기술을 사용하여 슬라이드에 배열할 수 있습니다. 어레이는 antigen library를 보유하는 source plate에 관심 항원을 포함하여 쉽게 사용자 정의할 수 있습니다. 또한 한 쌍의 2차 항체를 사용하여 동일한 슬라이드 표면에서 IgG 및 IgM 반응성을 분리하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이제 인간과 생쥐 모두의 자가항체를 측정하기 위해 이 기술을 최적화했습니다.

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프로토콜

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1. 희석 항원 및 생성 항원 마이크로 어레이

  1. 0.2 mg / ml의 최종 농도로 PBS에 희석 항원. 9 핀과 미세 배열 구성과 중복에서 162까지 고유의 항원을 인쇄합니다. 항원 라이브러리로 양성 대조군에서의 IgG 및 IgM의 항원을 포함합니다. 단지 음성 대조군으로 PBS를 포함합니다.
  2. 384 잘 소스 판에 각 항원의 20 μl를 추가합니다. 프린트 헤드의 설치 미러 그룹의 소스 플레이트에 항원을 추가 (9 핀 인쇄에 사용하는 경우 등, (9)의 그룹이 항원을 준비).
  3. 배열을 인쇄 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 박 및 동결와 커버 소스 판.
  4. 3 × 1 분 동안 탈 이온수와 초음파 처리 조에서이를 배양하여 고체 미세 배열 핀을 청소합니다. 랙에 배치 핀은 건조 후 마이크로 어레이 프린트 헤드의 핀을 배치합니다. 9 핀, 3 × 3 구성을 사용합니다.
  5. 프린트 헤드 번호 핀을 설정하여 실행 인쇄 프로그램 미세 배열,슬라이드의 수는 각 슬라이드에, 패드의 번호를 인쇄하고, 각 항원에 대한 복제 지점 수 있습니다. 일반적으로 9 핀, 70 슬라이드, 2 패드 / 슬라이드, 각 항원에 대한 2 복제 지점을 사용합니다. 프로그램 미세 배열은 항원의 다른 그룹 사이에 물에 핀을 초음파 처리합니다.
  6. 해동 소스 플레이트와 100 × g에서 1 분 후 원심 분리 판. 미세 배열의 지정된 자리에 소스 판을 놓습니다. 인쇄 할 항원의 첫 번째 그룹을 덮고 박의 부분을 제거합니다.
  7. Arrayer에 표면 및 실행 인쇄 프로그램에 인쇄되지 않은 슬라이드를 정렬합니다. 어레이 시스템의 가습기의 빌드 60 % - 습도 RT에서 인쇄 슬라이드 (55)에 Arrayer에에 설정합니다.
  8. 항원의 각 그룹은 모든 슬라이드 상에 인쇄 된 후, 미세 배열을 일시. 다만 호일로 인쇄 된 표지 항원 (증발을 방지하기 위해) 및 항원의 다음 그룹에 인쇄 될 발견. 인쇄 프로그램을 계속합니다.
  9. 모든 항원에 인쇄 한 후, 커버 소스 PL-80 ° C에서 박 및 동결의 새로운 조각을 먹었다. 슬라이드 상자와 진공 밀봉에 인쇄 된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 다음날를 사용하거나 최대 한 달 후에 할 수있다.

2. 희석 혈청과 항원 마이크로 어레이를 프로빙

  1. 배양 챔버를 사용하여 프레임으로 슬라이드를 놓습니다. 각 배열 표면에 차단 버퍼 (2.5 %의 [권 / 권] 태아 혈청 (FCS), PBS에 트윈 20 0.1 % [의 / 권 권])의 700 μl를 추가합니다.
  2. 젖은 조직의 조각 밀폐 용기에 프레임과 장소를 통해 접착 필름을 배치합니다. 로커에 4 ° C에서 O / N을 품어.
  3. 혈청 샘플 1을 희석 : (100) 버퍼를 차단에서. 대기음 배열에서 솔루션을 차단 및 각 배열 표면에 희석 한 시료 500 μl를 추가합니다.
  4. 접착 필름으로 덮고 락으로 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
  5. 버퍼를 차단에서 이차 항체를 희석. 인간 연구의 경우, 0.33 μg의 / ㎖ 및 Cy5에로 Cy3가 표지 된 염소 항 - 인간 IgG 항체가 희석 된 염소 항 - 구호 물자 표지0.25 μg의 / ㎖에 대한 IgM 항체 n은. 마우스 연구를 들면, Cy3에가 ㎖의 0.38 μg의 /에 염소에게 항 - 마우스 IgG 항체를 표지와 Cy5에가 / ㎖ 0.7 μg의에 염소 항 - 마우스 IgM의 항체를 표지 희석.
  6. 어레이에서 대기음 샘플 및 배열 표면을 세척 완충액 (PBS 중 0.1 % 트윈 20)로 4 회 헹군다. 슬라이드에 버퍼 빠르게 떨어져 가볍게 붓는다.
  7. 락과 RT에서 각 배열 표면을 씻어 10 분 부화 버퍼를 차단의 700 μl를 추가합니다. 반복 세척 단계를 두 번 더.
  8. 각 슬라이드 표면에 희석 차 항체의 500 μl를 추가하고 접착 필름 커버. 락과 4 ° C에서 45 분을 품어.
  9. 대기음 차 항체 슬라이드에서 혼합하고 위의 4 번 헹군다. 워시는 상기 차단 / 희석액 700 ㎕를 3 번​​ 슬라이드.
  10. PBS에 침지 금속 슬라이드 랙 프레임과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. 궤도 흔들림와 실온에서 20 분을 품어. PBS의 새로운 용기에 놓고 다른 20m를 품다진탕한다.
  11. 탈 이온수 15 초 용기에 넣어 슬라이드 랙. 물이 새 컨테이너에 선반을 놓고 다른 15 초를 품어.
  12. 건조 슬라이드, RT에서 5 분 220 XG에 원심 분리기와 스핀에서 ELISA 플레이트 어댑터에 장소 슬라이드 랙.
  13. 스캔 할 준비가 될 때까지 빛을 꽉 상자에 슬라이드를 놓습니다.

3. 스캔 항원 마이크로 어레이 및 데이터 내보내기

  1. 를 Cy3 및 Cy5의 형광 신호를 검출 할 수있는 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔 슬라이드. 스캐너의 광전자 증 배관 (PMT) 레벨을 조정하기 위해, 단지 이차 항체로 프로빙 하였다 슬라이드 사전 스캔.
    참고 :이 슬라이드 전체 양 (IgG에와 IgM의)를 포함하여 그것에 인쇄 항원 라이브러리뿐만 아니라 음 (PBS) 컨트롤이 있어야합니다. 프리 스캔 최적 PMT 설정을 찾기 위해 신속하게 사용자를 허용하는 낮은 해상도로 스캔한다.
  2. PMT를 값을 설정되도록합니다 (Cy3에 채널에서) 인간 IgG 기능과 잡음합니다 (Cy5에 채널)을 IgM의 기능은 비슷한 평균 형광 강도를 뺀 배경 (MFI-B) (일반적으로 40000)가 있습니다. PMT를 레벨은 "하드웨어"버튼을 누름으로써 설정된다. 일단 설정되면, 일정이 PMT 설정을 유지.
  3. 은 "스캔"버튼을 누름으로써 두 개의 채널에 대한 실험 슬라이드 스캔. 각 스캔 한 후 슬라이드 이미지 (두 채널 모두)를 저장합니다.
  4. 슬라이드를로드하는 "파일"버튼을 사용하여 마이크로 어레이 소프트웨어로 분석된다.
  5. "파일"버튼을 이용하여 유전자 배열 목록 (GAL) 파일을로드합니다. 는 GAL 파일 어레이 피처들의 신원을 가진 어레이의 레이아웃을 가진다.
  6. 배열 기능을 최대한 가깝게 템플릿을 일치하도록 스캔 한 이미지를 통해 배열 템플릿을 놓습니다.
  7. 은 "정렬"버튼을 눌러 템플릿으로 모든 블록의 기능을 맞 춥니 다. 프로그램은 일반적으로 원형의 기능의 개요를 확인할 수 있지만, 일부 수동 조정이 필요할 수있다. 이러한 조정 기능 모드를 입력 할 수있다. 소프트웨어는 각 항원에 대해 MFI-B를 계산한다.
  8. 텍스트 파일로 결과를 내보내려면 "파일"버튼을 사용합니다.

마이크로 어레이의 의미 분석 4. 분석 배열 데이터 (SAM)

  1. 엑셀로 개별 텍스트 파일을로드하고를 Cy3와 Cy5에 채널 MFI-B가 열을 식별합니다.
  2. 중복 기능의 평균을 계산합니다.
  3. 어떤 부정적인 MFI-B의 경우, (10)와 음수 로그베이스 (2)를 계산하여 다음 100 원 MFI-B를 나누고하여 데이터를 변환 대체합니다.
  4. 이전에 7 설명한 바와 같이 마이크로 어레이 (SAM)의 의미 분석과 로그 변환 된 데이터를 분석 할 수 있습니다.
  5. 두 그룹 (예를 들어, 건강한 대조군 대 명), 하나의 그룹 라벨 「1」및 그룹을 이용하여 연구를위한 "2" 의있는 항원의 반응성을 식별하기 위해 SAM의 두 클래스 짝이 분석을 사용하여두 군간 ignificantly 다른 (Q 값 <0.05).
  6. 프리젠 테이션 8 이미지를 만들기 위해 클러스터링 및 열 맵 생성 소프트웨어를 사용합니다.

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결과

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도 1에 나타낸 바와 같이 항원 로봇 미세 배열로 슬라이드 상에 384 웰 플레이트에 배치되어 인쇄된다. 2는 배양 챔버와 처리 후의 스캔 슬라이드 프레임에 배치 된 슬라이드를 나타낸다. (3) 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 나타낸다. 네가티브 슬라이드은 이차 항체로 프로빙하고, 양성 대조군 슬라이드 전신성 홍 반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로브된다. 두 별도로 표지 이차 항체를 이용하여 IgG를 및 IgM의 반응성이 동일한 슬라이드 표면에서 분리 될 수있다. (4)도 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 및 IgG를 다양한 위에 리보솜 P (Ribo를 P)에 대한 항체에 대한 IgM의 항체의 형광 강도를 나타낸다 혈청 희석의 범위. P Ribo에 대해 알려진 반응성 전신성 홍 반성 루푸스 ...

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토론

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여기에 설명 된 프로토콜 항원 마이크로 어레이 기술을 이용하여자가 항체의 정량을 허용한다. 항원 마이크로 어레이는자가 항체 선별에 기존의 ELISA에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 우선, 핵산, 단백질, 펩티드, 및 세포 용 해물을 포함하는 다양한 항원에 따라서 다중화자가 항체 스크리닝을 허용 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드 상에 배치 될 수있다. 항원 나노 리터 각 슬라이드에 발견되기 때문에, 또, 항원의 마이크로 그램의 어레이를 생성 할 필요가있다. 100 샘플 희석 혈청의 5 μL가 1 배열 표면을 조사하는 데 필요한대로 배열은 매우 작은 환자 샘플을 필요로한다. 마지막으로, 배열은 니트로 셀룰로오스에자가 항체 9 검사에서 기존의 ELISA보다 더 민감한 것으로 나타났다 발견했다.

자가 항체에 대한 항원 스크리닝 마이크로 어레이를 사용하는 것 외에도, 상기 배열은 사용 될 수D는 단일 클론 항체의 특이성을 정의하고, 이전에 설명 된 바와 같이...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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A.C.는 캐나다 심장 및 뇌졸중 재단(Heart and Stroke Foundation of Canada)의 박사 후 연구원과 재생 의학 교육 프로그램(Canadian Institutes of Health Research)의 지원을 받았습니다.F.Y.Y.H.는 재생 의학 교육 프로그램(Training Program in Regenerative Medicine)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 Astellas Pharma Canada의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 Mark Menenghini 박사(토론토 대학교)의 Axon 마이크로어레이 스캐너를 사용해 주신 데 대해 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ribosomal P0Diarect14100에서 0.2mg/
ml로 희석, PBS
인간 IgMJackson Immuno009-000-0120.2mg/ml로 희석, PBS
마우스 IgGSigma-AldrichI53810.2mg/ml로 희석, PBS 마우스 IgM Biolegend 401601
에서 0.2mg/ml로 희석PBS 이중 가닥 DNA에서 0.2 mg/ml로 희석
Sigma-AldrichD1626에서 0.2 mg/ml로 희석
PBS에서 0.2 mg/ml로 희석
VirtekVersArray Chipwriter Pro많은 유형의 어레이어가 적합합니다
Arrayer, Arrayit CorporationSSP015
로봇 마이크로어레이 VirtekChipwriter Pro를 위한 소프트웨어 
FAST 슬라이드(2 패드)GVS Northa America10485317
FAST 프레임GVS Northa America10486001
FAST 인큐베이션 챔버(2 패드)GVS Northa America10486242
384웰 플레이트Whatman7701-5101
플레이트 실러VWR60941-062
호일 플레이트 커버VWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
태아 송아지 혈청Invitrogen12483020
Cy3 염소 항인간 IgGJackson Immuno109-165-09650% glyercol
Cy5 염소 항인간 IgMJackson Immuno109-175-129사용 50% glyercol
Cy3 염소 안티 마우스 IgGJackson Immuno115-165-07150% glyercol
Cy5 염소 안티 마우스 IgMJackson Immuno115-175-075사용 작업 재고 50% glyercol
Microarray 스캐너분자 장치 Molecule DevicesAxon 4200A
Microarray 소프트웨어분자 장치Genepix 6.1
클러스터링 소프트웨어eisenlab.orgCluster 3.0
Heatmap softwareeisenlab.orgTreeview 1.60
Microarray 통계 소프트웨어Stanford UniversitySAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)
은 PBS 인간 IgG Jackson Immuno 009-000-003에서 에서 은 PBS 단일 가닥 DNA, microarrayer, , .

참고문헌

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  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
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  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224(2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555(2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).

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