초파리와 포유류의 조혈 시스템은 조혈을 연구하기 위해 초파리에게 매력적인 유전 적 모델을 만들고, 많은 일반적인 기능을 공유 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 면역 조직 화학의 주요 애벌레 조혈 기관의 해부 및 장착을 보여줍니다. 우리는 또한 순환 혈구 세포와 고착 결정 세포 등 다양한 애벌레 조혈 구획을 분석하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
많은 유사점. 초파리 포유류 적응 면역 특성화 림프 혈통 부족에도 초파리 및 포유류 조혈 시스템 간에는 초파리 및 포유류 조혈 여러 혈액 세포 계통을 생성 시공간적 가지 단계에서 발생한다. 두 시스템 확장하거나 성숙한 계통을 대체 할 수있는 혈액 세포 전구 세포의 저수지를 유지한다. 조혈 시스템은 초파리와 포유류에 대응하는 면역 도전에 적응 할 수 있습니다. 중요한 것은, 생성, 유지 보수 및 조혈 시스템의 기능을 조절하는 전사 규제 및 신호 전달 경로는 포유류에 파리에서 보존된다. 이러한 유사성은 초파리 유전자 모델 개발 및 조혈 질환에 사용될 수 있도록.
여기에 우리 세부 분석은 초파리 애벌레의 조혈 시스템을 검사합니다. 에서특히, 우리는 혈액 세포 수와 농도를 측정하는 생체 내에서 특정 성숙한 혈통 시각화 및 순환과 조혈 기관의 혈액 세포에서 면역 조직 화학 법을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 유전자 발현의 변화 및 신호, 생존, 증식 및 분화를 포함하는 세포 과정을 공개하고 조혈에 대한 질문의 다양성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 초파리 가능한 유전 도구와 결합 된 분석 방법은 정의 된 유전자 변형시의 조혈 시스템을 평가할 수있다. 특히 여기에 설명되지는 않았지만, 이러한 분석법은 조혈 시스템의 감염이나식이 요법 등의 환경 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다.
서론
혈액 학적 질환의 조혈 시스템의 개발 및 그 고장 좌표 전사 인자 및 신호 전달 경로를 조절 복잡한 메커니즘이 제대로 이해 남아. 이러한 전사 인자 및 신호 경로뿐만 아니라, 그 조절은 매우 초파리 및 포유류 조혈 1-5 사이에 보존된다. 따라서 초파리 조혈 시스템은 조혈 및 기저 혈액 질환을 제어하는 분자 메커니즘을 정의하는 우수한 유전 모델을 나타낸다.
포유 동물과 유사하게, 초파리는 조혈의 공간적 및 시간적으로 별개의 단계에서 혈구 불리는 혈액 세포를 생성. 전통적으로, 초파리의 조혈는 배아 중배엽과 애벌레 림프 글 랜드에서 단계로 제한 될 것으로 생각되었다. 조혈 또한 애벌레 정착 클러에서 발생하는 최근의 연구는 증거를 제공sters과 6-8 복부 성인이다. plasmatocytes 및 액정 셀 모든 조혈 상 성숙 혈구 세포의 두 가지 유형을 생성한다. Plasmatocytes은 식균 작용, 선천성 면역, 및 상처 치유에 관여하는 대 식세포와 같은 세포이다. 크리스탈 세포는 melanization, 곤충 면역 반응 및 상처 치유에 사용되는 반응에 필요한 프로 phenoloxidases가 포함되어 있습니다. 제 성숙한 혈구 유형을 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 순환 혈구 농도
- 6 시간 -이 분석을 위해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성이 2의 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다.
- 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, 표 1) 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다.
- 각각의 애벌레를 들어, 얼음에 microcentrifuge 관에 PBS 1X 10 μl의 깨끗한 해부 패드에 PBS 1X 10 μl를 배치합니다. 조명 실체베이스에 해부 패드를 놓습니다.
- 조직에 배치하여 각각의 유충을 건조는 해부 패드에 PBS 드롭에 전송하기 전에 닦아주십시오.
- 포셉 한 쌍을 사용하여 부드럽게 열고 눈물 조심스럽게 체액을 해제 할 수있는 표피를 반전.
참고 : 긁어 또는이 잠재적으로 정착 혈구 세포 (29)를 방출 수로 표피를 잽주의 바랍니다. - 피펫을 사용하여 해부 패드로부터의 체액을 수집한다. 공동 피이러한 지방 본문으로 애벌레 파편을 llecting.
- 미세 원심 튜브에 체액을 추가로 pipetting 아래로 섞는다.
주의 : 샘플을 여러 번에 수집 시간까지 얼음 상에 유지 될 수있다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
혈구 농도 순환
혈구 수는 애벌레 개발 (35)에 걸쳐 증가한다. 이 방법은 혈구 수와 농도의 차이를 감지하는지 설명하기 위해, 상관없이 생물학적 원인, 우리는 지연 및 비 지연 유충의 혈구 농도를 측정 하였다. ptth 생산 뉴런 (ptth> 냉혹)의 유전 적 절제에 의해 prothoracicotropic 호르몬 (ptth)의 손실 애벌레 개발 (36)의 지연을 생산하고 있습니다. 25 ℃로 올려 8 이상의 개별 유충의 프로토콜 1에 기재된대로 각 유전자형 들어 혈구 농도를 측정 하였다. 2 시간 달걀 수집 후 120 시간에서 지연 유충 당 평균 혈구 농도는 (ptth> 냉혹 한)는 제어 유충 (ptth) 당 평균 혈구 농도보다 작다. 만 구일 후 그 컨트롤의 지연 유충의 접근 당 평균 혈구 농도를 (수행
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
유전 적 또는 환경 변화에 따라, 여기에 설명 된 네 가지 방법은 신호, 생존, 증식 및 분화와 같은 조혈 동안 별개 프로세스를 분석하기 위해 개별적으로 또는 함께 사용할 수 초파리 조혈 동적 프로세스이다.; 동물 당 혈구 세포의 수가 증가하고 35 임파선의 구조 및 유전자 발현이 발달 동안에 32를 변경한다. 이러한 분석을 수행하기 이전에, 따라서, 고정 된 시간에 대한 산란 원하는 유충 발달 단계를 확인 암컷시킴으로써 달걀 모음을 제한하는 것이 중요하다. 짧은 계란 컬렉션 (이하 6 시간) 또는 여성이 건강에 해로운 또는 부족한되는 인스턴스를 들어, 달걀 누워는 음식에 균열을 생성하여 격려 할 수있다. 이는 에탄올 세정 주걱 음식의 부분을 제거함으로써 달성 될 수있다. 를 초과하는 액체 식품에 축적 경우, 사용 조직을 흡수하기 위해 잎사귀액체. (그림 1A를 참조하십시오.)
혼자, 여기에.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
도움을 주신 Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi, Andreas Jenny에게 감사드립니다. 원형질세포 특이적 항체를 제공해 주신 István Andó님, dome-meso-EBFP2 파리를 주신 Utpal Banerjee님, antp>GFP 파리를 주신 Julian Martinez-Agosto님, ptth 및 ptth>grim 파리를 주신 Michael O'Connor님께 감사드립니다. 이러한 방법은 Kimmel Foundation, Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 및 NIH/NCI T32CA078207의 지원으로 개발되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PBS 정제 | MP Biomedicals | 2810305 | |
| 해부 접시 | Corning | 7220-85 | |
| 마이크로 원심 분리기 튜브 | Denville | C2170 | |
| 실리콘 해부 패드, Sylgard 184 키트 | Krayden으로 제작(Fisher를 통해 배포) | NC9644388(Fisher 카탈로그 번호) | 제조사 지침에 따라 Sylgard 엘라스토머 키트의 구성 요소를 혼합하여 페트리 접시에서 만들어졌습니다. |
| 실체 현미경 | Morrell Instruments (Nikon 대리점) | mna42000, mma36300 | Nikon 모델 SMZ1000 및 SMZ645 |
| 티슈 와이프 | VWR | 82003-820 | |
| 겸자 | 전자 현미경 과학 | 72700-DZ | |
| p200 피펫 | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| 백작 세포 계수 챔버 슬라이드 | Invitrogen | C10283 | |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 3200 | |
| 트리판 블루 스테인 | Life Technologies | T10282 | |
| 포름알데히드 | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| 트윈 20 | Fisher | BP337-500 | |
| 소 혈청 알부민 | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| 일반 염소 혈청 | 시그마 | G9023-10ML | |
| 일반 당나귀 혈청 | 시그마 | D9663-10ML | |
| 200 프루프 에탄올 | VWR | V1001 | |
| N-프로필 갈레이트 | MP Biomedicals | 102747 | |
| 글리세롤 | VWR | EM-4750 | |
| DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌) | Fisher | 62248 | |
| 6웰 플레이트 | Corning | 351146 | |
| 12웰 플레이트 | Corning | 351143 | |
| 현미경 커버 유리, 22mm 정사각형 | Fisher | 12-544-10 | |
| 현미경 커버 유리, 18mm 원형 | Fisher | 12-545-100 | |
| 유리 현미경 슬라이드 | Fisher | 22-034-980 | |
| 열 순환기 | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR 튜브 | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24웰 플레이트 | Corning | 351147 | |
| 일회용 이송 피펫 | Fisher | 13-711-9AM | |
| 형광 현미경 | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
참고문헌
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M.....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
