Method Article

쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

DOI:

10.3791/54550

⸱

October 19th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

In This Article

Summary

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이 연구는 in vivo cell-free layer의 시각화를 위한 rat cremaster muscle의 외과적 준비를 보여줍니다. 이 연구에서는 cell-free layer width 측정의 정확도에 영향을 미치는 상당한 요인에 대해 논의합니다.

Abstract

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cell-free layer는 적혈구가 없는 미세혈관 흐름의 두정엽장층으로 정의됩니다. in vivo cell-free 층 너비와 시공간 변화의 측정은 미세순환의 혈류역학에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다. 이 연구에서는 고속 비디오 카메라와 결합된 생체 내 현미경 시스템을 사용하여 생체 내 세동맥의 cell-free 층 너비를 정량화했습니다. Sprague-Dawley 쥐의 크레마스터 근육은 혈류를 시각화하기 위해 외과적으로 외부화되었습니다. cell-free layer width의 이미지 처리 및 분석을 자동화하기 위해 맞춤형 이미징 스크립트도 개발되었습니다. 이 접근 방식을 사용하면 이전의 수동 측정보다 더 일관되게 시공간 변화를 정량화할 수 있습니다. 그러나 측정의 정확도는 부분적으로 파란색 필터의 사용과 적절한 임계값 알고리즘의 선택에 따라 달라집니다. 구체적으로, 블루 필터를 사용하거나 사용하지 않고 획득한 이미지의 대비와 품질을 평가했습니다. 또한 5가지 이미지 히스토그램 기반 임계값 적용 알고리즘(Otsu, 최소값, intermode, 반복 선택 및 퍼지 엔트로피 임계값 적용)을 비교하고 cell-free 레이어 너비 결정의 차이점을 설명했습니다.

Introduction

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생체 내 동물 연구는 인간의 생리학과 병리학을 이해하기 위한 기초 과학에 중요한 역할을 합니다. 특히, 생체 내 미세혈류역학 연구는 혈액의 비정상적인 유변학적 상태에 의해 변경되는 미세순환 기능의 잠재적 손상을 설명할 수 있습니다. 이전의 많은 미세혈류역학 연구1에서는 미세혈관 혈류를 시각화하기 위해 쥐 크레마스터 근육 모델을 사용했습니다. 크레마스터 근육(cremaster muscle)은 고환을 둘러싸고 있는 줄무늬 근육의 얇은 층입니다. 따라서 근육의 혈류는 외과적 노출을 통해 트랜스 조명 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 이를 통해 형광제나 조영제를 사용하지 않고도 생체 내 혈류 이미지를 획득할 수 있습니다. 또한, 복부 대동맥 폐색으로 상류 혈류를 감소시킴으로써 근육 네트워크의 전체 혈액 관류를 조절할 수 있습니다2. 이러한 장점으로 인해 cremaster 근육 모델은 미세혈관1,3에서 무세포층(CFL)의 형성을 조사하는 데 널리 사용되었습니다.

CFL 폭은 미세순환에서 두드러진 혈역학적 매개변수로, 미세순환 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 큰 관심을 받고 있습니다. CFL은 적혈구(RBC)가 흐름 중심을 향한 전....

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Protocol

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이 연구는 싱가포르 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 된 프로토콜 없음. R15-0225)의 국립 대학에 따른다.

동물 모델 1. 수술 준비

  1. 선박 삽관
    1. 남성 흰쥐 마취 - 무게 (6 7 주)를 (203 ± 20) 복강을 통해 케타민 (37.5 ㎎ / ㎖) 및 자일 라진 (5 ㎎ / ㎖) 칵테일 g (IP) 주입 (2 ㎖ / kg) . 바늘을 정리해 또는 주입 후 주사기에서 제거하지 마십시오.
    2. 동물이 마취되면 (핀칭 발가락으로 확인) 37 ℃에서의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치. 조심스럽게 견갑골, 전방 경부, 복부, 중간 뒷다리 및 음낭 주머니에 머리를 면도. 조심스럽게 접착 종이 테이프를 사용하여 다리를 억제.
    3. 미세 절제 가위와 직각 집게를 보는 동안을 사용하여 모든 수술 절차를 수행실체 현미경. 수술하는 동안 부상을 방지하기 위해 구멍 방지 트레이에있는 모든 날카로운 수술 도구를 놓습니다.
    4. 절개를 수행하기 전에 수술 부위를 교대 요오드, 70 % 에탄올로 3 회 문질러. 30 IU / ml의 헤파린 생리 식염수 용액으로 모든 카테터를 플래시합니다.
    5. 오른쪽 경정맥을 통해 수술 가위를 사용하....

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Results

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생체 내에서 CFL의 시각화 동물의 수술 준비에 크게 의존한다. 과도한 혈액 손실 또는 확장 수술 시간은 충격과 혈류 수차 동물 대상이된다. 가열 패드뿐만 아니라 수술 실험 기간 동안 맞춤형 플랫폼을 사용하는 조직의 유지 온도는 래트의 생리적 조건을 유지하기위한 중요하다. 현미경 시스템에서, 100 W 할로겐 램프를 사용하여 식별 할 수있는 조직 손상도 실험의 끝에서 관찰되지 않았다.

도 2a는 CFL의 RBC 코어와 내부 용기 벽 (도 2c) 사이에 관찰 될 수 래트 cremaster 근육에서 분지 세동맥을 통한 전형적인 RBC 흐름을 나타낸다. 실험 기간 동안 이들 구성 요소 사이의 적절한 콘트라스트 CFL 폭 측정의 정확성을 보장하기위한 중요하다. 이미지 분석의 초기 단계가 포함내부 용기 벽의 검출. 용기에 수직 분석 라인을 따라 광 강도 프로파일을 취득하여, 위치는 다크 행 천이 개의 화소 <.......

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Discussion

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CFL 폭의 측정은 미세 순환의 혈류 역학의 이해에 필수적이다. 특히, CFL 폭의 측정은 장간막 6에서 수행되어, 24, 25 microcirculations 대뇌를 spinotrapezius. 생체 CFL 폭의 측정은 종래의 녹화 된 비디오 프레임의 수동 검사 추정치로 제한 하였다. 수동 측정은 시각 RBC 코어 및 용기의 벽 (15, 16)의 경계를 식별하기 전에 몇 개의 연속적인 비디오 프레임의 평균화가 필요했다. 또 다른 연구에서, 형광 염료 (FITC)가 적혈구 -labelled 및 로다 B의 isothiocynate은 (RITC) 표지 된 플라즈마는 고양이 대뇌 미세 혈관 (25)의 평균 CFL 폭을 결정하는 데 사용 하였다. 이러한 이전의 측정 방법은 매우 시간 소모적이며, CFL 위스콘신의 공간 및 시간 해상도를 제한하는 형광 표식에 대한 추가 단계가 필요DTH 측정. 대조적으로, 효과적인 이미지 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 연구는 NMRC(National Medical Research Council)/CBRG(Cooperative Basic Research Grant)/0078/2014의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
생체 내 현미경올림푸스BX51WI장비
고속 카메라Photron1024PCI장비
블루 필터HOYAB390장비
압력 센서 및 바이오팩 시스템Biopac 시스템TSD104A, MP100장비
온도 조절기ShimadenSR 1장비
플라즈마 라이트 ABaxterNDC : 0338-022137 °에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
식염수 0.9%Braun
Heparin (5,000 IU/ml)LEO
PE-10 폴리에틸렌 튜브Becton Dickinson427400.024" OD x .011" ID 
PE-50 폴리에틸렌 튜브Becton Dickinson427411.038" OD x .023" ID
PE-205 폴리에틸렌 튜브Becton Dickinson427446.082" OD x .062" ID
2-0 비흡수성 실크 봉합사Deknatel113-S
5-0 비흡수성 실크 봉합사Deknatel106-S
물 순환 가열 패드Gaymar
수조Fisher ScientificIsotemp 205장비
멸균 면 거즈 Fisher Scientific22-415-468
면봉 애플리케이터Fisher Scientific23-400-124
Dumont 집게Kent ScientificINS14188수술 기구
마이크로 해부 겸자Kent ScientificINS15915수술 기구
아이리스 집게 1 x 2 치아Kent ScientificINS15917수술 악기
혈관 캐뉼레이션 겸자Kent ScientificINS500377수술 기구
마이크로 가위Kent ScientificINS14177수술 기구
아이리스 가위 KentScientificINS14225 수술 기구
혈관 클립Kent ScientificINS14120수술 기구
쌍둥이 자리 소작 시스템Braintree ScientificGEM 5917수술 기구

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
  2. Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S.

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Cell free LayerArteriolesRat Cremaster MuscleIntravital MicroscopyHigh speed Video CameraImage ThresholdingBlue FilterTemporal VariationSpatial VariationMedian Filter

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