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방법 논문

쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

6.1K 조회수

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DOI:

10.3791/54550

⸱

2016년 10월 19일

 ,  ,  ,  , 
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

이 논문에서

요약

이 연구는 in vivo cell-free layer의 시각화를 위한 rat cremaster muscle의 외과적 준비를 보여줍니다. 이 연구에서는 cell-free layer width 측정의 정확도에 영향을 미치는 상당한 요인에 대해 논의합니다.

초록

cell-free layer는 적혈구가 없는 미세혈관 흐름의 두정엽장층으로 정의됩니다. in vivo cell-free 층 너비와 시공간 변화의 측정은 미세순환의 혈류역학에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다. 이 연구에서는 고속 비디오 카메라와 결합된 생체 내 현미경 시스템을 사용하여 생체 내 세동맥의 cell-free 층 너비를 정량화했습니다. Sprague-Dawley 쥐의 크레마스터 근육은 혈류를 시각화하기 위해 외과적으로 외부화되었습니다. cell-free layer width의 이미지 처리 및 분석을 자동화하기 위해 맞춤형 이미징 스크립트도 개발되었습니다. 이 접근 방식을 사용하면 이전의 수동 측정보다 더 일관되게 시공간 변화를 정량화할 수 있습니다. 그러나 측정의 정확도는 부분적으로 파란색 필터의 사용과 적절한 임계값 알고리즘의 선택에 따라 달라집니다. 구체적으로, 블루 필터를 사용하거나 사용하지 않고 획득한 이미지의 대비와 품질을 평가했습니다. 또한 5가지 이미지 히스토그램 기반 임계값 적용 알고리즘(Otsu, 최소값, intermode, 반복 선택 및 퍼지 엔트로피 임계값 적용)을 비교하고 cell-free 레이어 너비 결정의 차이점을 설명했습니다.

서론

생체 내 동물 연구는 인간의 생리학과 병리학을 이해하기 위한 기초 과학에 중요한 역할을 합니다. 특히, 생체 내 미세혈류역학 연구는 혈액의 비정상적인 유변학적 상태에 의해 변경되는 미세순환 기능의 잠재적 손상을 설명할 수 있습니다. 이전의 많은 미세혈류역학 연구1에서는 미세혈관 혈류를 시각화하기 위해 쥐 크레마스터 근육 모델을 사용했습니다. 크레마스터 근육(cremaster muscle)은 고환을 둘러싸고 있는 줄무늬 근육의 얇은 층입니다. 따라서 근육의 혈류는 외과적 노출을 통해 트랜스 조명 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 이를 통해 형광제나 조영제를 사용하지 않고도 생체 내 혈류 이미지를 획득할 수 있습니다. 또한, 복부 대동맥 폐색으로 상류 혈류를 감소시킴으로써 근육 네트워크의 전체 혈액 관류를 조절할 수 있습니다2. 이러한 장점으로 인해 cremaster 근육 모델은 미세혈관1,3에서 무세포층(CFL)의 형성을 조사하는 데 널리 사용되었습니다.

CFL 폭은 미세순환에서 두드러진 혈역학적 매개변수로, 미세순환 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 큰 관심을 받고 있습니다. CFL은 적혈구(RBC)가 흐름 중심을 향한 전단 유도 횡방향 내향 이동에 의해 형성됩니다4. 결과적으로, 이러한 이동은 혈관 벽 근처의 적혈구를 고갈시켜 결국 cell-free plasma layer를 생성하게 됩니다. 따라서, 두정엽 CFL은 자연적으로 적혈구 코어에서 조직으로의 산소(O2) 전달과 적혈구5,6에 의한 산화질소(NO)의 소거에 대한 확산 장벽이 됩니다. 또한, NO의 생산은 CFL 폭7,8의 동적 변화에 의해 조절될 수도 있습니다. 따라서 미세순환에서 혈류를 더 잘 이해하기 위해서는 가스 수송과 미세순환에서 항상성 조절에서 CFL의 역할을 완전히 확인해야 합니다. 최근 연구는 미세순환9-12에서 CFL의 혈류역학 및 가스 수송 기능을 연결하는 데 중점을 두었습니다. 또한, 별도의 연구 세트에서는 RBC 응집체의 병리학적 상승이 CFL 형성을 조절하는 방법과 조직에서 O2 및 NO 생체 이용률에 미치는 영향을 조사했습니다13,14.

CFL의 역할은 혈관 직경에 대한 CFL 너비의 상대적 크기가 두드러지는 미세 순환에서 더욱 중요해집니다. 이를 위해서는 생체 내 혈류에서 CFL을 정량화하는 효과적인 접근 방식이 필요합니다. 특히, 이미지 획득과 이미지 분석은 CFL 폭 측정의 정확도를 결정하는 두 가지 핵심 구성 요소입니다. 조직 혈류의 성공적인 시각화는 동물 모델의 적절한 수술 준비가 선행되어야 합니다. 또한, 대부분 인적 오류에 의해 유발되는 기존 수동 측정의 한계를 극복하기 위해 적절한 이미지 분석 기술이 필요합니다15,16. 디지털 이미지 처리를 위한 광학 계측 및 컴퓨팅 성능의 발전으로 이제 CFL 폭17-19를 보다 정확하고 일관되게 측정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이미지 기반인 이러한 측정의 정확도는 여전히 궁극적으로 이미지의 품질에 달려 있습니다.

따라서 본 연구에서는 in vivo CFL 폭 측정에 영향을 미치는 요인을 탐구합니다. 우리는 특히 쥐 크레마스터 근육의 세동맥에서 CFL 너비를 측정하기 위한 수술 준비 및 디지털 이미지 분석을 시연하는 데 중점을 두었습니다.

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프로토콜

이 연구는 싱가포르 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 된 프로토콜 없음. R15-0225)의 국립 대학에 따른다.

동물 모델 1. 수술 준비

  1. 선박 삽관
    1. 남성 흰쥐 마취 - 무게 (6 7 주)를 (203 ± 20) 복강을 통해 케타민 (37.5 ㎎ / ㎖) 및 자일 라진 (5 ㎎ / ㎖) 칵테일 g (IP) 주입 (2 ㎖ / kg) . 바늘을 정리해 또는 주입 후 주사기에서 제거하지 마십시오.
    2. 동물이 마취되면 (핀칭 발가락으로 확인) 37 ℃에서의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치. 조심스럽게 견갑골, 전방 경부, 복부, 중간 뒷다리 및 음낭 주머니에 머리를 면도. 조심스럽게 접착 종이 테이프를 사용하여 다리를 억제.
    3. 미세 절제 가위와 직각 집게를 보는 동안을 사용하여 모든 수술 절차를 수행실체 현미경. 수술하는 동안 부상을 방지하기 위해 구멍 방지 트레이에있는 모든 날카로운 수술 도구를 놓습니다.
    4. 절개를 수행하기 전에 수술 부위를 교대 요오드, 70 % 에탄올로 3 회 문질러. 30 IU / ml의 헤파린 생리 식염수 용액으로 모든 카테터를 플래시합니다.
    5. 오른쪽 경정맥을 통해 수술 가위를 사용하여 견갑골에 1.5 cm 중간 선에 피부 절개 - 1을 만듭니다. 경정맥을 노출 무딘 절개하여 밴드를 분리하고,이를 폴리에틸렌 관 (PE-50) 5-0 실크 봉합사를 이용하여 헤파린 염수로 가득 cannulate. 추가 마취를 주입 할 때 필요한 (1/3 초기 용량의 1/2, 정맥 주사 (IV)) 수술과 실험의 과정을 통해.
    6. 기도 명백을 유지하기 위해 기관 절개술을 수행합니다. 전방 경추 지역에 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 대신에 카테터를 고정 2-0 실크 봉합사로 폴리에틸렌 관 (PE-205)를 이용하여 기관을 Cannulate.
    7. 혈압 모니터대퇴 동맥에 삽관을 통해. 뒷다리의 왼쪽 내측 표면에서 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 무딘 절개에 의한 대퇴 동맥을 분리합니다. 헤파린 염수 5-0 실크 봉합사를 이용하여 충전 된 폴리에틸렌 관 (PE-10)를 대퇴 동맥 Cannulate.
  2. Cremaster 근육 준비 및 흐름 시각화
    1. 를 확장하기 위해 음낭 주머니의 정점을 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 음낭 주머니의 복부 표면을 따라 절개를합니다. 노출 된 근육, 정기적으로 따뜻한 등장 성 용액 (pH 7.4의 37 ° C)를 적용합니다.
    2. 신중하고 철저하게 결합 조직을 둘러싸고있는 면봉을 사용하여 제거합니다.
    3. cremaster 근육의 꼭대기를 통해 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 같은 길이의 두 조각으로 봉합사를 잘라 양쪽에 매듭을 묶어. 두 매듭 사이의 근육을 잘라 조심스럽게 봉합을 잡아 당겨 사용자 정의 투명한 플렉시 글라스 플랫폼에 그것을 스트레칭. 고치다블루 압정와 플랫폼 상에 봉합사의 끝.
      참고 : 결합 조직을 주변의 철저한 제거는 최적의 이미지 대비를 얻는데 매우 중요하다.
    4. 5 ~ 6 고착이 이루어 될 때까지 단계를 반복 1.2.3. 조심스럽게 고온 소작을 사용하여 부고환에서 cremaster 근육을 제거합니다. 조직의 탈수를 방지하기 위해 노출 된 근육에 따뜻한 등장 솔루션을 Superfuse.
      1. 거즈의 접힌 부분과 cremaster 근육을 둘러싸고 있습니다. 비닐 막을 노광 근육 커버. 영화와 함께 거즈 조각 물 침수 현미경 목표 (그림 1A) 따뜻한 등장 솔루션을 보유 얕은 분지를 형성한다.
    5. 생체 내에 현미경 (그림 1C)의 동물 무대에 동물을 전송합니다. 지속적인 압력 모니터링 (그림 1E)에 대한 생리 학적 데이터 수집 시스템에 동맥 삽관을 연결합니다.
    6. 근육 temperat 유지동물 플랫폼 (그림 1B) 아래에 부착 된 발열체와 35 ° C에서 URE. 발열체 (도 1D)의 전력 제어기에 네거티브 피드백을 제공하도록 근육 옆에 온도 센서를 배치했다.
    7. 15 분은 환경과 평형을 무대에 동물을 둡니다.
    8. 40 배의 물 액침 대물 긴 작동 응축기와 생체 내에 현미경 혈류 시각화.
    9. 분지 세동맥 적혈구 코어 사이에 명확한 이미지 초점 및 콘트라스트에 기초하여 (<60 μm의)을 선택 CFL 및 용기 벽이 순서 혈관의 직경 평면 현미경을 집중한다. 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 현미경에 장착 카메라를 돌립니다.
    10. 1 초 동안 3000 / 초의 프레임 레이트로 고속 비디오 카메라를 사용하여 혈액의 흐름을 기록한다. 이미지 품질을 보존하기 위해 비 압축 8 비트 그레이 스케일 AVI 형식으로 녹화 된 영상을 저장한다.
      노트: / 초 3000 프레임의 최소 기록 프레임 레이트는 CFL 측정 생리 동맥 흐름 조건 하에서 적어도 한번 RBC 당 수행 될 수 있도록 권장한다.
    11. 적혈구와 플라즈마 사이의 대비를 향상시키기 위해 510 나노 미터 - 310에서 394 nm의 스펙트럼 대역의 파장에서 최대 전송과 푸른 필터를 사용합니다.
      참고 : 현미경 광원 (100 W 할로겐 램프)에서 파란색 필터를 통과하는 빛의 스펙트럼이 잠재적 인 조직 손상을 방지하기 위해 낮은 조명 강도의 확인하십시오.
    12. 실험의 끝에, 펜토 바르 비탈 나트륨의 과량으로 동물을 안락사.

2. 이미지 분석

  1. CFL 폭 측정 전처리
    1. MATLAB을 열고 'CFL_pre.m'파일을 실행합니다. (이 다른 MATLAB 파일은 찾을 수 있습니다IP "> 기업 MATLAB 보관.)
    2. 분석 할 비디오 파일을 선택하려면 '파일 열기'를 클릭하십시오.
    3. 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 '회전'슬라이더를 조정합니다.
      주 : 사용자는 '격자에'버튼을 선택하여 용기 정렬 어시스트 그리드 라인을 표시하고, '축소'슬라이더를 밀어 화상의 줌 레벨을 조정할 수있다.
    4. 용기 정렬을 확인하는 '확인 편집'버튼을 클릭합니다.
    5. 관심 (ROI)의 영역을 정의하려면 '설정 ROI 작물에 대한'버튼을 클릭합니다. 정렬 된 이미지가 팝업 창에 표시됩니다. 이미지에 직사각형 목표를 조정하고 두 번 투자 수익 (ROI)을 확인합니다. 이미지 자르기가 필요하지 않은 경우이 단계를 건너 뜁니다.
      참고 : 전용 용기로부터의 CFL 폭을 분석 할 수있는 ROI에서 하나의 용기를 포함한다. 필요한 경우, 원래의 형태로 이미지를 복원 할 '재설정 이미지'버튼을 클릭합니다.
    6. 클릭9 ''(BMP '형식 연속 비트 맵 이미지를 8 비트 그레이 스케일)에 모든 편집 된 비디오 프레임을 추출 버튼'이미지의 압축을 풉니 다. 추출 된 이미지는 선택된 비디오 파일과 동일한 이름을 가진 폴더에 있습니다.
  2. CFL 폭 측정
    1. MATLAB을 열고 'CFL_measure.m'파일을 실행합니다.
    2. 추출 된 이미지가 들어있는 폴더를 선택 '폴더 선택'을 클릭합니다.
    3. 이미지가 들어있는 폴더를 클릭하고 '폴더 선택'을 클릭합니다. 폴더의 첫 번째 이미지 프레임을로드하고 '이미지 히스토그램'패널에서의 회색 강도 히스토그램과 함께 '그레이 스케일 이미지'패널에 표시됩니다.
    4. 분석, 그렇지 않으면 제 1 이미지 프레임이 선택 될을 수행하는리스트 박스에서 원하는 영상 프레임을 선택한다.
    5. 위치에 결정되는 이미지의 내부 용기 벽을 식별하는 '선박 벽 찾기'를 클릭 곳어두운 빛 강도 프로파일 피크 천이 두 픽셀 위에 점등한다.
    6. '소금과 후추'소음을 줄이기 위해 이미지에 중간 필터를 적용하는 '중간 필터'를 선택합니다.
    7. 이미지 대비를 강화하기 위해 디지털 이미지의 강도를 조절하는 '자동 명암 조정'을 선택합니다.
    8. τ 위의 그레이 레벨 (CFL), 그리고 τ 아래의 그레이 레벨 (RBC 코어) 블랙 픽셀 화이트 픽셀 - 두 개의 클래스로 계조를 분할하는 자동 임계 값 (τ)을 결정 목록 상자에서 임계 알고리즘을 선택합니다.
      참고 : 자동 - 임계 알고리즘 중 어느 것도 적절한 이미지 임계 값을 제공하지 않는 경우 다른 방법으로, 수동 임계 값을 사용합니다. '수동'라디오 버튼을 클릭하고 수동 임계 값을 정의하는 슬라이더를 조정합니다.
    9. (해상도는 CFL 폭의 공간 변화를 측정하고 '픽셀 해상도'상자에 픽셀 해상도를 입력하려면이 실험 장치와 0.42 μm의 / 픽셀)이었다.
    10. CFL 폭의 공간 변화를 얻기 위해 '계산'버튼을 클릭합니다. 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보내려면 '내보내기 .CSV'을 클릭합니다.
    11. 프레임 속도 정보, 선박 따라 특정 분석 라인의 CFL 폭의 시간적 변화를 측정하고 '시간 변화'라디오 버튼을 클릭하고 입력하려면 (이 실험 장치에서 사용되는 프레임 속도를 3000 프레임 / 초였다).
    12. 각각 '프레임 시작'과 '마지막 프레임'상자의 첫 번째 프레임과 분석을위한 이미지의 마지막 프레임을 입력합니다.
    13. '분석 선'슬라이드 막대를 밀어 혈관을 따라 분석 라인의 위치를 ​​선택합니다. '그레이 스케일 이미지'와 '바이너리 이미지'에 모두 설명되어 분석 라인의 위치를 ​​확인합니다.
    14. CFL 폭의 시간적 변화를 얻기 위해 '계산'을 클릭합니다. CLICK '내보내기 .CSV'는 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보낼 수 있습니다.

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결과

생체 내에서 CFL의 시각화 동물의 수술 준비에 크게 의존한다. 과도한 혈액 손실 또는 확장 수술 시간은 충격과 혈류 수차 동물 대상이된다. 가열 패드뿐만 아니라 수술 실험 기간 동안 맞춤형 플랫폼을 사용하는 조직의 유지 온도는 래트의 생리적 조건을 유지하기위한 중요하다. 현미경 시스템에서, 100 W 할로겐 램프를 사용하여 식별 할 수있는 조직 손상도 실험의 끝에서 관찰되지 않았다.

도 2a는 CFL의 RBC 코어와 내부 용기 벽 (도 2c) 사이에 관찰 될 수 래트 cremaster 근육에서 분지 세동맥을 통한 전형적인 RBC 흐름을 나타낸다. 실험 기간 동안 이들 구성 요소 사이의 적절한 콘트라스트 CFL 폭 측정의 정확성을 보장하기위한 중요하다. 이미지 분석의 초기 단계가 포함내부 용기 벽의 검출. 용기에 수직 분석 라인을 따라 광 강도 프로파일을 취득하여, 위치는 다크 행 천이 개의 화소 <...

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토론

CFL 폭의 측정은 미세 순환의 혈류 역학의 이해에 필수적이다. 특히, CFL 폭의 측정은 장간막 6에서 수행되어, 24, 25 microcirculations 대뇌를 spinotrapezius. 생체 CFL 폭의 측정은 종래의 녹화 된 비디오 프레임의 수동 검사 추정치로 제한 하였다. 수동 측정은 시각 RBC 코어 및 용기의 벽 (15, 16)의 경계를 식별하기 전에 몇 개의 연속적인 비디오 프레임의 평균화가 필요했다. 또 다른 연구에서, 형광 염료 (FITC)가 적혈구 -labelled 및 로다 B의 isothiocynate은 (RITC) 표지 된 플라즈마는 고양이 대뇌 미세 혈관 (25)의 평균 CFL 폭을 결정하는 데 사용 하였다. 이러한 이전의 측정 방법은 매우 시간 소모적이며, CFL 위스콘신의 공간 및 시간 해상도를 제한하는 형광 표식에 대한 추가 단계가 필요DTH 측정. 대조적으로, 효과적인 이미지 ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 NMRC(National Medical Research Council)/CBRG(Cooperative Basic Research Grant)/0078/2014의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생체 내 현미경올림푸스BX51WI장비
고속 카메라Photron1024PCI장비
블루 필터HOYAB390장비
압력 센서 및 바이오팩 시스템Biopac 시스템TSD104A, MP100장비
온도 조절기ShimadenSR 1장비
플라즈마 라이트 ABaxterNDC : 0338-022137 °에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
식염수 0.9%Braun
Heparin (5,000 IU/ml)LEO
PE-10 폴리에틸렌 튜브Becton Dickinson427400.024" OD x .011" ID 
PE-50 폴리에틸렌 튜브Becton Dickinson427411.038" OD x .023" ID
PE-205 폴리에틸렌 튜브Becton Dickinson427446.082" OD x .062" ID
2-0 비흡수성 실크 봉합사Deknatel113-S
5-0 비흡수성 실크 봉합사Deknatel106-S
물 순환 가열 패드Gaymar
수조Fisher ScientificIsotemp 205장비
멸균 면 거즈 Fisher Scientific22-415-468
면봉 애플리케이터Fisher Scientific23-400-124
Dumont 집게Kent ScientificINS14188수술 기구
마이크로 해부 겸자Kent ScientificINS15915수술 기구
아이리스 집게 1 x 2 치아Kent ScientificINS15917수술 악기
혈관 캐뉼레이션 겸자Kent ScientificINS500377수술 기구
마이크로 가위Kent ScientificINS14177수술 기구
아이리스 가위 KentScientificINS14225 수술 기구
혈관 클립Kent ScientificINS14120수술 기구
쌍둥이 자리 소작 시스템Braintree ScientificGEM 5917수술 기구

참고문헌

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