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방법 논문

나무 형성 및 보조 스템 개발에 관여하는 유전자 및 발기인 유학을위한 유도 체세포 업종 분석 (ISSA)의 사용

8.2K 조회수

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DOI:

10.3791/54553

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2016년 10월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

이 논문에서

요약

여기에서는 비교적 짧은 시간 내에 나무 2차 줄기 조직에서 유전자 및 프로모터 구조의 중간에서 높은 처리량의 기능적 특성화를 용이하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 효율적이고 사용하기 쉬우며 다양한 나무 종에 널리 적용할 수 있습니다.

초록

나무 차 줄기 성장과 관련된 나무 형성은 생물학적 및 상업 관점에서 모두 중요하다. 그러나, 상대적으로 작은 자신의 개발에 적용되는 분자 제어에 대한 알려져있다. 이는 종종 이차 성장 과정의 연구와 관련된 물리적 자원 및 시간 제한 부분이다. 생체 외 다수의 기술 우디 비 목본 식물 종 둘 중 식물의 일부 또는 전부를 식물 시스템을 포함하는 데 사용되어왔다. 그러나, 보조 줄기 성장 과정의 연구에 대한 적용 가능성에 대한 질문은, 특정 종과 노동 강도의 반항은 높은 처리량 응용 프로그램에 대한 매체들은 금지합니다. 차 줄기 개발 및 나무 형성을 볼 때 또한, 조사에서 각 특성은 성장의 몇 년 후 늦게 나무의 라이프 사이클에서 측정 될 수 있습니다. 생체 내 페이지에서 이러한 문제의 대안을 해결에서rotocols 직접 식물의 보조 줄기 형질 전환 체세포 조직 섹터들의 생성을 포함하는 유도 된 체세포 분석 분야라는 개발되었다. 이 프로토콜의 목적은 나무 종의 범위로 사용될 수있다 유전자 프로모터와 기능적 특성화 형질 보조 식물 조직을 생성하는 효율적인 쉽고 비교적 빠른 수단을 제공하는 것이다. 여기에 제시된 결과 보조 보조의 프로모터 발현 패턴뿐만 아니라 수종 그 나무 형태 학적 특성의 다양한 줄기 형질 전환 보조 줄기 섹터 용이 높은 중간을 용이하게 평가할 수있다 줄기 모든 살아있는 조직 및 세포 유형에서 생성 될 수 있음을 보여준다 처리량 기능적 특성.

서론

나무는 행성 바이오 매스의 상당한 양을 포함하고, 거대한, 생물, 문화, 상업 중요하다 유래한다. 보조은 많은 다른 생명체에 대한 리소스와 쉼터를 제공함으로써 서식지를 만들 유래한다. 그들은 서식과 목재, 펄프 및 종이 및 기타 목재 및 비 목재 제품의 생산을위한 재생 가능한 자원의 역할 생태계에 많은 다른 서비스를 제공합니다. 보조 줄기 개발 및보다 구체적 우드 형성을 특정 세포 유형의 발달을 조절하는 분자 착물 시스템에 의해 관리되고, 생화학 세포벽의 조성 및 방법은 이들은 조직 및 기관을 형성하기 위해 배열된다. 차 줄기 개발 및 나무 형성의 분자 기초를 해부하는 내부와 줄기 사이에, 긴 세대 시간, 밖으로 교차 결합 시스템, 높은 이형, 높은 유전로드, 계절 휴면 긴 나무 줄기 속성의 변화 등 많은 요인에 의해 혼동된다 성숙한특성 설립 기간과 성숙한 나무의 얇은 실제 크기. 그 결과, 식물 발달의 분자 제어 대부분의 다른 양태의 상세한 지식 보조 줄기 개발 상대적인 이해 아직 초기 단계에있다.

시험관 수많은 기술 연구, 특히 목재와 이차 세포벽 형성 보조 줄기 현상을 이해하는 데 사용되어왔다. 이러한 프로토콜은 형질 전환 식물체 중 생성되는 또는 특정 보조 세포 나 조직은 목재 및 / 또는 보조 줄기 개발 하나의 특정 측면의 연구를 위해 변환되는 전체 식물 또는 식물 파트 시스템의 사용을 포함한다. 형질 전환 식물체는 식물 조직 및 세포 유형의 다양한 포스트 유전자 변형을 복구 할 수 있으나, 진행은 느리다 특히 길기 때문에, 재생에 목섬유 특성을 분석하고 (10 세의 순서) 성숙 배 줄기 때 높은 기술적 노동 demanDS, 낮은 후보 유전자의 처리량뿐만 아니라 일부 우디 식물 종을 전파 어려움. 유사 기술들은 성공적 이러한 한계 중 일부를 극복 애기 비 목질 모델 시스템에서 개발 되었으나, 이들에 존재하지 않는 모든 보조 줄기 세포 유형의 줄기와 계절이나 수명에 관한 특성은 종이 연구 될 수 없다. 대안 적으로, Pinu의 라디 캘러스 배양 3과 식물 일부 시스템은 관련 시간대를 줄일 수 있습니다. 이 방법은 그러나 개별 세포 유형의 연구로 제한하고 시험 관내 실험에 언급 한 바와 같이 유사한 제약 조건을 고통된다. 마찬가지로, 전체 줄기 외식을 포함 혀끝의 줄기 문화 (4)는 약속을 보여 주었다하지만 아직 특정 유전자 또는 관심의 발기인의 연구에 적용되지 않았다. 최근 모상근 배양을 포함한 다른 프로토콜 유칼립투스 개발되었으며 성공적이었다줄기는 단일 수종으로 제한됩니다 날짜보다 5 그러나,이 방법은 여전히 체외 배양이 필요합니다 적용, 오히려 보조 뿌리를 포함한다.

여기에 기술 된 바와 같이 유도 된 체세포 섹터 분석 (ISSA)는, 목재의 형성 및 보조 줄기 조직 개발 의심 역할과 유전자 프로모터 높은 처리량 기능성 스크리닝 도구 매체를 제공하는 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. ISSA 노동을 극복하면서 그대로 보조 줄기 형질 전환 세포 및 조직을 생산하기 위해 걸리는 시간을 줄이기 위해 개발 된 생체 전환 및 스크리닝 시스템 일상적 기술적 처리량 제한 관내 방법에 사용되는. 이차 g없이 수종 및 관심 조직에서 단시간 줄기에 기재되어있는 프로토콜에 독립적 변형 티슈 섹터 수백 개의 셀의 동시 생성을 허용비교적 짧은 시간 프레임과 낮은 노동 비용 내에서 enetic 및 / 또는 환경 변화. ISSA 생체 기술은 제 cambial 분화에 관여하는 유전자 및 / 또는 발기인의 연구를 통해 보조 줄기 조직에 정제 된 이후 차 줄기 6 버드 (7) 조직에 대한 설명과이되었다은 다음과 같습니다 튜 불린 (TUB) 8 fasciclin 같은 아라 비노 갈 락탄을 ( FLA) 9, 셀룰로오스 합성 효소 (CESA) (10), 이차 전지 벽 관련 NAC 도메인 (SND2) 11 ARBORKNOX (ARK1) 12 정말 흥미로운 새로운 유전자 (RING) H2 단백질 13. 이차 실시 하였다 이들 연구 포플러 유칼립투스 식물 세포 형태, 셀 벽 화학 유전자 발현에 제공 통계 줄기.

여기에 설명 된 프로토콜은 경험 a를 소집하기위한 것입니다차에 대한 지식이 지난 10 년간 출판 및 출판되지 않은 연구의 범위에서 ISSA의 개발 및 응용 프로그램을 통해 얻었다. 그들은 차 줄기 조직 (6)의 생체 내 변화에 초점을 은백양 'pyramidalis'복제, 유칼립투스뿐만 아니라 11 유칼리 나무 globulus의 X의 camaldulensis 클론을 포함하는 연구에 집중. 이 문서는 식물과 박테리아, 줄기 조직의 성장과 조직의 수확, 형질 전환 세포와 조직의 식별, 수집 및 데이터 분석을위한 표현형 평가 및 방법에 대한 준비 변환의 재배에서 프로토콜을 통해 연구자합니다. 기술이 성공적으로 인해 공간 제한도 9,11를 세포벽 단당류 조성물을 측정하기 위하여 적용되었지만, 본 문서는 보조 일에서의 유전자 발현 패턴을 세포와 조직 형태를 측정하고 이해하기 위해 사용되는 기술에 집중EMS 만. 따라서, 설명 된대로 프로토콜은 높은 처리량 방법에 저렴한 비용, 기술적으로 쉽고, 매체를 이용하여 줄기 차에 연결된 유전자의 역할 및 / 또는 표현에 더 통찰력을 얻기 위해 찾는 사람들에게 적합하다.

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프로토콜

식물 소재 1. 준비

  1. 이전 실험에, 씨 또는 절단에서 선호하는 수종의 새로운 모종을 높이고 실험 대상 지역에서 줄기의 직경은 직경 약 1cm 때까지 나무 / s의 성장.
    참고 : 식물의 성장 속도 따라서이 단계에 대한 세 9 개월 사이에 허용으로 인해 달라질 수 있습니다 필요한 시간.

2. 이진 벡터 생성

  1. 실험실 또는 아그로 박테 리움을 처리 할 수있는 온실 및 실험실에 대한 처방이 적절한 개인 보호 장비 (7)이 섹션에서 작업을 수행하는 데 사용됩니다.
  2. 관심 녹다운 또는 과잉 발현 카세트 및 β 글루 쿠로니다 아제 (GUS) 리포터 유전자 카세트의 유전자 또는 조사의 유형에 따라 GUS 유전자에 융합 관심 프로모터를 함유하는 벡터를 제조 이진.
    참고 : 이진 벡터 혈중 알코올 농도의 숫자가 있습니다이진 벡터로 유전자와 관심의 발기인을 삽입 할 수 연구 네트워크뿐만 아니라 다양한 기술을 통해 상업적으로 또는 공급 될 수 kbones. 이 프로토콜의 문맥에서 이진 벡터를 생성하는 방법에 대한 결정을 할 수있는 실험에 달려있다.
  3. A.의 무장 해제 변형에 이진 벡터 변환 전기 또는 열 충격 (14)를 사용하여 실험을 위해 필요할 때까지 적절하게 저장 시언.
  4. 긍정적 및 / 또는 음성 대조군 단계를 반복 2.2.
    참고 : 음성 대조군 관심 연구의 유전자이자 연구의 프로모터에 대한 promoterless의 GUS에 대한 관심의 어떤 유전자를 포함하지 않는 이진 벡터를 포함해야한다. 관심 연구의 프로모터에 대한 긍정적 인 컨트롤은 GUS 기자에 융합 된 꽃 양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (CaMV35s)를 포함한다.

A. 3. 준비 예방 접종을위한 투메 파시 엔스

  1. EXPER에 적어도 일주일 전에imentation, A. 소량 (약 1 μl를) 수행 박테리아 선택을위한 적절한 항생제를 포함하는 14 판을 단계 2.2 및 2.3 동안 준비 한천과 별도의 LB 매체에 얇게 퍼져 리움 튜머 파시 엔스. 작은 식민지를 형성하는 인큐베이터에서 28 ° C에서 성장 후 4에서 보관 필요할 때까지 C를 °.
  2. 48시간 이전에 실험에, A의 한 식민지를 전송 별도의 50 ㎖로 각 플레이트에서 박테 리움 사전 예열 (28 ° C) LB 매체 (14) 박테리아 선택을위한 적절한 항생제를 함유 때까지 28 ° C에서 약 48 시간 동안 진탕 배양기에서 200 rpm으로 교반 5 ㎖를 포함하는 상부 튜브 나사 혼합물은 매우 흐린입니다.
  3. 4 ~ 6 시간이 식물의 접종 이전에 줄기 사이 (섹션 4) LB / A. 1 ㎖를 추가 신선한 50 ㎖로 박테 리움 혼합물에 대한 적절한 항생제로 위에 신선한 따뜻한 (28 °에 C)의 19 ㎖ (1시 20분 희석)를 포함하는 튜브 LB 미디어 나사세균보세요. 600 나노 미터 (분광법으로 측정 한 OD 600)에서의 광학 밀도 (OD)가 0.1 이상이면이 달성 될 때까지 따뜻한 LB 더욱 희석.
  4. 희석 LB / A. 배치 OD 600까지 박테 리움 혼합물 다시 진탕 배양기에 흔들어 동일한 조건 (200 rpm으로, 28 ° C)는 0.4-0.6 제거 사이입니다.
  5. 원심 분리기 LB / A. 1,000 XG에 15 분, 4 ° C에 대한 박테 리움 혼합물.
  6. 액체 가만히 따르다 즉시 A를 재현 탁 박테 리움 펠렛 1 ml의 MS 미디어 (15)를 냉각로, 2 ml의 마이크로 튜브로 전송하고 접종 (4 절)에 필요한까지 얼음에 저장합니다. 이 용액을 접종 매체로 지칭된다.

공장 4. 예방 접종 A로 줄기 박테 리움

  1. 늦은 봄 또는 적극적이고 빠르게 성장 형성층이 섹션 1에서 만든 식물을 사용하여 초여름 동안 실험을 시작합니다. 위한 좋은 진단활성 급성장 형성층은 체관부 쉽게 목부로부터 박리 될 수 있다는 것이다.
  2. 식물의 기지 근처 줄기의 명확한 직선 섹션을 찾아 모든 나뭇잎과 나뭇 가지를 제거합니다.
  3. 날카로운 메스 (바람직 번호 11) 또는 면도날을 사용하여, 길이 20mm 한 5mm의 체관부 통해 분리 후 두 수직 평행 절개를 도입하여 줄기 투명한 부분에 1cm 2 'cambial 창'을 만들 자신의 기부에 두 개의 수직 인하를 연결하는 수평으로 잘라.
  4. 껍질 절개 위쪽으로 개발 목부 조직을 노출하고 피펫 (일반적으로 5 ~ 10 μL)를 사용하여 노출 개발 목부의 표면을 젖은 단계 3.6에서 충분한 예방 접종 미디어를 추가하여 만든 체관부 스트립. 즉시 체관부 스트립을 삽입합니다.
  5. 단단히 파라 필름과 줄기에 체관부 스트립을 결합한다.
  6. 반복 관심이를 만드는 유전자 (들) 또는 프로모터 (들)에 대한 추가 cambial 윈도우 4.5에 4.2 단계적어도 뉴욕 새 cambial 창 위 또는 다른 cambial 창 아래 오프셋 90 °에서 1cm.
  7. 완료 단계 각 벡터는 실험에 사용 된 각각의 식물의 줄기 같은 추가한다고 보장 양성 및 음성 대조군 벡터 (스텝 2.4)에 대한 4.5-4.2.
  8. GUS 분석을위한 줄기 직경 주기적으로 성장과 수확 적어도 5mm의 반경 성장이 줄기에서 관찰되었다 (섹션 5)를 모니터링합니다.
    주 : 필요한 방사상 성장의 양은 하류 분석에 필요한 조직의 양에 의존한다.

GUS 조직 학적 분석 5. 수확

  1. 소비세 어떤 티슈 cambial 창 내에서 새로운 성장의 일부를 제거 줄기에서 'cambial 창'.
    1. 물관과 체관 세포 / 조직 형태를 성숙에 관한 연구를 들면, 목질부에서 체관부 껍질.
    2. cambial 영역은 그대로 또는 프로모터 발현 패턴을 유지하기 위해 요구되는 시험을 위해 평가되어야한다에드는, 횡 방향으로 두께가 0.5 내지 1mm의 디스크에 면도날 등 날카로운 칼날을 사용하여 cambial 창을 슬라이스.
  2. 14 라운드 ml의 바닥 튜브에서 처리 cambial 창 조직을 배치하고 pH를 7 ~ 14에서 0.1 M 인산 버퍼에 두 번 씻어. 적어도 5 분 동안 용액에 남아있는 모든 여분의 용액의 끝에서 제거하고, 조직이 완전히 침수되어 있는지 확인합니다 두 번째 린스.
  3. GUS 시약 (0.5 mM의 X-gluc (5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 - β-D-글루 쿠 론산), 10 mM의 EDTA, 0.5 % 트리톤 X-100 V / V, 0.5 mM의 칼륨 5 mL를 추가 . 참조 호킨스 등 16) 각각의 튜브에, 페리시 아나이드는 (III) 0.05 mM의 페로 시안화 칼륨 (II), 0.1 mM의 포스페이트 완충액 pH 7의 최종 부피로 만들었다. 조직이 완전히 잠겨 있지 않으면, GUS 추가적인 시약을 추가한다.
  4. 어둠 속에서 55 ° C에서 10 분 동안 튜브를 품어.
  5. 어둠 속에서 37 ℃에서 진탕 배양기에 추가로 12 ~ 16 시간 동안 튜브를 품어(rpm으로 30 내지 60) 부드러운 교반을 사용하는 혼합을 허용합니다.
  6. 진탕 배양기에서 제거하면 무작위로 pH 범위 0-7으로 리트머스 종이를 사용하여 튜브의 작은 부분 집합에 GUS 시약의 pH를 확인합니다.
    1. 튜브의 6 이하의 pH가있는 경우 다음을 레이블을 붙입니다. 산도를 확인하고 pH가 아래 6 경우 레이블 튜브의 나머지 부분을 확인하기 위해 계속합니다.
      참고 : 6 이하의 pH가 샘플 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. 이들 샘플은 추가적인 분석에서 제외한다.
  7. GUS 시약을 가만히 따르다 조직을 커버하기에 충분한 70 % 에탄올로 대체합니다.
  8. 4 ° C에서 보관이 필요할 때까지.

형질 전환 된 조직을 식별 6.

  1. 집게를 사용하여 미세한 시각화 수 있도록 작은 트레이 또는 배양 접시에 튜브와 장소에서 모든 cambial 창 조직을 꺼내.
  2. 1X 및 4X의 배율 사이 해부 현미경을 사용하여 확인하고 세포 또는 조직의 개수를 집계그 밝은 푸른 염색이있다. 블루 염색 된 세포 또는 조직은 이후 시점에서 섹터 라 칭한다. 다음과 같은 방법을 집계.
    1. 체관부 (단계 5.1.1) 제거 된 샘플은, 현상 목부 (cambial 섹터도 1a)의 표면 상에 발견 cambial 조직 내의 섹터들의 수를 계산.
    2. 디스크 (단계 5.1.2)로 절단 된 샘플의 경우, 다른 세포 또는 조직 유형에서 찾을 수 부문 (그림 1B, 1C, 1D)를 계산합니다. 분야는 다음과 같은 조직 유형에서 찾을 수 있습니다 다음 주피 (주피 부문, 그림 1E), 사부 (체관부 부문, 그림 1 층), cambial 조직 (Cambial 부문, 그림 1g, 1H, 1I), 상처 실질 (상처 실질 분야, 그림 1J)와 tyloses에서 (TYLOSE 부문, 그림 1K).
      1. 현미경 중디스크의 양쪽 볼되었는지와 숫자가 과대 평가되지 않도록 두 개의 디스크에서 발생하는 분야가 일치하는지 확인 ssessment.
  3. 필요할 때까지 70 % 에탄올 및 저장을 포함하는 튜브에 다시 만 조직 포함 된 섹터를 놓습니다.
  4. 양 및 / 또는 음성 대조군을 포함한 추가 cambial Windows 용 6.3 단계를 반복합니다 6.1.
  5. 형성층 cm 2 당 변형 이벤트의 평균 수를 도출 1 cm 2 cambial 윈도우의 총 개수가 섹터의 총 수를 분할하여 개별적으로 각 유전자 또는 관심 프로모터 및 대조군에 대한 각 섹터 유형에 대한 평균 변환 효율을 계산 접종 (ATScm -2).
  6. 프로모터 발현 패턴의 분석을 위해 7.2 및 8 단계 및 기술 cambial 조직에서 세포와 조직 형태를 평가하기위한 7.1, 7.2 또는 7.3 단계로 진행합니다.

7. 분석Cambial 조직의 세포 및 조직 형태학

참고 : 아래 ISSA의 분석을 위해 성공적으로 사용 된 기술의 선택은 샘플을 산출했다.

  1. 주사 전자 현미경 (SEM)하여 목부 셀 영역 루멘 영역, 셀 벽 두께 및 셀 벽 영역의 분석.
    참고 :이 프로토콜은 최소한의 샘플 준비가 필요하고 요약 된 형태 학적 특성에 관한 부문 분석의 상대적으로 높은 처리량을 할 수 있습니다.
    1. 이 단계에서 이후 실험실 코트, 눈 보호를 보장하고 우디 조직이 처리되고 처리되는 때마다 장갑을 사용하십시오.
    2. 분석을위한 cambial 분야를 확인하고 절개 디스크 (그림 2a)을 만들 하나의 에지 면도날을 사용하여 양쪽에 약 0.5 mm를 확인합니다.
    3. 섹터의 접선 방향면에 목질부 조직의 약 1mm 떠나는 초과 목질부 조직을 낸다 (도 2B).
    4. 꼼꼼한LY 신선한 양날 면도날 (도 2C)를 이용하여 상기 섹터의 중심을 횡으로 자른다.
    5. 형질 전환 조직 (그림 2D)를 구별하기 위해 횡단면 어느 분야의 측면에 두 개의 추가 얕은 반경 방향 절개를합니다. GUS 염색이 조직에 깊이 침투하지 않습니다 같이 cambial 표면에서 발견 스테인드 조직의 양쪽에 셀의 반경 파일을 따라 따릅니다.
    6. 주사 전자 현미경 핀 스텁의 단계까지 준비 cambial 부문의 얼굴을 연결하는 SEM 도전 테이프 (그림 2E)를 사용하여 마운트 SEM의 시각화를 위해 필요할 때까지 데시 케이 터에 보관하십시오.
    7. 반복 음성 대조군에서 포함하여 추가 섹터 7.1.6에 7.1.2 단계를 반복합니다.
    8. 저 진공 모드에서 SEM을 사용하여 (에너지 5 kV로는 3.0 nm의 점) 시각화 섹터 내의 세포 / 조직 사진뿐만 아니라, 세포 / 조직에 직접 인접 섹터 (도 2F)을 가지고. 배율의 양관심의 기능에 따라 달라집니다. 목부 섬유, 2,000X 적합 (도 2G)이다.
    9. cambial 분야는 시각과 사진이 적절한 배율로 촬영 한 후에, 이미지 측정 소프트웨어를 사용하여 관심의 목부 세포 / 조직 형태 학적 특성을 측정한다.
    10. 통계적인 분석을 위해, 트랜스 제닉 섹터 및 P를 결정하기 위해 각각의 섹터 (섹터 에지로부터 0.5 mm에서 측정), 인접 비 - 트랜스 제닉 대조군 세포 / 조직에서 측정 학적 차이를 비교하기 위해 짝 t-테스트를 ​​사용하여 여러 쌍으로 분석 수행 -값.
    11. 음성 대조군 단계를 반복 7.1.10.
      1. 양성 대조군 낮은 p- 값 (α <0.05)을 나타낸다 경우, 형태 학적 특성에 대한 유전자와 인접한 비 - 형질 전환 세포 / 조직의 차이를 계산한다. negat으로 목적 유전자의 효과를 비교하기 위해 짝 t 검정이 '차분 값'을 사용의 p의 값을 결정하는 제어 필자.
  2. 광학 현미경을 이용하여 줄기 세포 / 조직에서 cambial 세포 / 조직 형태 또는 프로모터 발현 패턴의 조직 화학적 분석.
    참고 : 더 많은 시간이 소요되지만,이 방법은 cambial 역학, 예를 들어, cambial 폭뿐만 아니라 프로모터 발현 패턴의 측면을 포함하여 자세한 분석 옵션을 할 수 있습니다. 또한, SEM에 액세스 할 수없는 경우,이 프로토콜은 단계 7.1에 대한 대안으로서 사용될 수있다.
    1. 소비세의 면도날을 사용하여 관심 분야, 4 ° C에서 최소 2 일 동안 스크류 캡과 샘플 유리 병에 1-3 ml의 100 % 에탄올에 직접 일부 주변의 작은 블록으로 조직 (더 이상 1mm 3) 및 장소 쉐이커에. 마이크로톰에 의해 액세스 할 수 있도록 관심의 표면을 허용하는 방식으로 작은 블록을 준비합니다.
    2. 음성 대조군에서 포함하여 추가 부문에 대해 반복합니다.
    3. 액체 제거하고 2로 교체5 % 에탄올 : 조건을 유지하는 2 일간 75 % LR 흰색 혼합물.
    4. 50 % 에탄올로 단계를 반복 7.2.3 : 50 % LR 흰색, 25 % 에탄올 : 100 % LR 화이트와 마지막으로 두 번 다음 흰색과 75 %의 LR.
    5. 짧은 끝에 정렬 관심의 표면과 금형을 포함하기에 작은 블록을 놓고 조심스럽게 신선한 LR 흰색으로 커버 제조업체 지침에 따라 중합.
    6. 회전식 마이크로톰에 관심의 표면으로부터 5 μm의 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 탑재합니다. 세포벽 및 / 또는 다른 특징을 시각화 Safranin O (0.01 %) 염색을 사용합니다.
    7. 설치, 미디어를 추가 커버 슬립을 배치하고 밤새 설정할 수 있습니다.
    8. 100X와 600X 확대 및 캡처 이미지 사이의 빛 현미경보기.
    9. 화상 측정 소프트웨어를 이용하여 영상의 형태 적 특성을 캡처.
      1. 양적 형태 학적 특성의 통계 분석을 위해, 단계 7.1.10에서에 따릅니다.
      2. 형태 학적 특성의 정성 분석의 경우,비교하고 유전자 또는 관심의 발기인과 음극 및 / 또는 양성 대조군에서 관찰 패턴을 설명합니다.
  3. 광학 현미경을 사용하여 침연 (macerated) 섬유의 마이크로 피 브릴 각도 (MFA)의 분석.
    1. 섹터에서뿐 아니라 인접 비 형질 전환 조직에서 직접 소비세 형질 전환 목부 조직을 별도의 1.5 ml의 튜브와 장소 (0.5 mm,도 2 시간 이내). 음성 대조군에서 포함하여 추가 부문에 대해 반복합니다.
    2. 전체 단계는 흄 후드에서 7.3.5 7.3.3.
    3. 과산화수소의 250 ㎕를 각각의 튜브에 빙초산 250 μl를 추가합니다.
    4. 흄 후드에서 2 시간 동안 90 ° C에서 열 블록에 튜브를 놓습니다.
    5. 튜브에서 조직을 제거하고 조심스럽게 두 배 이상 증류수로 헹군다.
    6. 수용성 실장 용지를 사용하여 유리 슬라이드에 조직을 탑재하고, 커버 슬립을 부착하기 전에 예리한 포셉 떨어져 애타게.
    7. 전망400X보다 큰 배율로 개별 섬유 광학 현미경 캡처 이미지에서.
    8. 마이크로 피 브릴 섬유의 각도를 결정하기 위해 피트 개구 및 / 또는 세포벽 줄무늬 화상 측정 소프트웨어를 이용하여 섬유 (도 2I)의 장축 사이의 각도를 측정한다.
    9. 통계 분석을 위해, 단계 7.1.10에서에 따릅니다.

8. 분석 프로모터의 발현 패턴

  1. 차 줄기 조직의 발기인 식 패턴의 분석.
    1. 단계 6.2.2에 명시된 바와 같이 관심있는 프로모터뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군에 대한 각 섹터 유형의 빈도를 집계.
    2. P 값을 설정 카이 스퀘어 테스트를 사용하여 양성 대조군으로 관심의 프로모터에 대해 상이한 섹터 유형의 주파수를 비교한다. 세포 / 조직 특이 추가 분석이 요구되는 단계 7.2를 사용하여 수행 될 수있다.
      1. 하나 이상의 촉진제 만약관심의 다음 관심의 모든 발기인 및 양성 대조군 사이의 분석 만들기 비교를 반복 조사되고있다.
      2. 분야 또는 청색 염색은 음성 대조군에서 관찰되는 경우 분석이 추가 또는 정도에 따라 또는 내인성 착색이 의심되는 경우 (토론 참조) 포기.
  2. Cambial 파생 상품 개발 및 차별화하는 동안 발기인 식 패턴의 분석.
    1. 해부 현미경을 사용하여 단계 6.2에서 식별 된 모든 cambial 부문 (그림 1g, 1H, 1I)을 시각화하고 형성층에서 파생 된 세 가지 조직 유형에 푸른 염색의 존재 / 부재를 결정; 체관부 (P)은 목부 (X1) 또는 개발 목질부 조직 (X2)을 현상 (도 3a 참조).
    2. 단계 8.1.2에 따라, INT의 프로모터의 P, X1 및 X2 영역에 GUS 염색의 존재 / 부재의 주파수를 비교P 값을 설정 카이 스퀘어 테스트를 사용하여 양성 대조군으로 erest. 세포 / 조직 특이 추가 분석이 요구되는 단계 7.2를 사용하여 수행 될 수있다.
      1. 추가 고려 사항에 대한 단계 8.1.2.1 및 8.1.2.2를 참조하십시오.

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결과

모든 라이브 차 줄기 세포 및 조직 유형이 표시되고이 프로토콜을 사용하면 A에 감염 될 수 있습니다 변환 시언 및 초기 형질 세포 유형에 따라 섹터 유형과 후속 발달 성장 패턴으로 정의되었다. 섹터 유형은 주피, 체관부, cambial, 상처 실질과 TYLOSE (그림 1B, 1C, 1D)를 포함하고 일관된 위치이 단락의 나머지 부분에서 설명에서 찾을 수 있습니다. 주피 분야는 체관부 (그림 1E)로 연장 독점적으로 주피에서 결코 발견 된 형질 전환 세포의 그룹으로 구성되어 있습니다. 체관부 섹터는 결코 이들 주변 조직 (도 1F)로 연장되지 그러나 기동 층과 주피 사이의 다양한 위치에서 확인할 수있다. cambial 부문은 트란에서 파생 된 형질 전환 목부 / 형성층 / 체관부 조직으로...

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토론

ISSA 프로토콜은 유전자와 나무에 관련된 관심의 발기인의 분석을 위해 몇 개월의 공간에 나무 종의 형질 전환 줄기 조직의 생성을위한 비교적 간단하고 효율적인 방법이며 형성 줄기. 살아있는 식물을 유지 넘어 약간의 노력은 광범위한 배양이 조직이나 식물, 목재 생산 년까지 걸릴 수 있습니다 시작하거나 어디 진정한를 유지하기 위해 필요한 시험 관내 방법으로 대조를 이룬다 접종 다음 형질 전환 줄기 조직을 성장하는 데 필요한 차 줄기는 1 작성되지 않습니다. 거의 모든 경우에, 최적화가 요구된다 여기서 ISSA 또한 사시 나무속, 유칼립투스 Pinus 6 속에서의 종뿐만 아니라 아카시아와 Corymbia 비롯한 수종의 광범위한 적용 (데이터 미도시)로 도시 된 유전자 변형 조직을 유도. 이 방법을 사용하면, O를 수를 조사하는 것이 가능하다F 유전자 또는 관심의 대부분의 종에 대한 관심의 발기인. ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 Linkage Grants LP0776563(GB, AS) 및 LP0211919(GB) 및 업계 파트너인 Sappi 및 Mondi, 호주 연구 위원회(Australian Research Council)의 Australian Postgraduate Award(EM)와 Australian Department of Agriculture(LT)를 통한 Young Innovators and Scientist Award를 통해 작업의 측면에 대한 자금 지원을 받은 것에 대해 감사의 뜻을 표합니다. 또한, 이 프로토콜의 개발 과정에서 많은 논의와 아이디어를 제시해 준 Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan 및 Simon Southerton에게 감사드리며, 실험실 관련 작업에 도움을 준 Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel 및 Noemie Defaix에게도 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
식물NANA필요에 따라 식물에 대해 지역 종묘장 공급업체에 문의하십시오
Agrobacterium 균주NANAAgrobactrium 균주를 얻을 수 있는 많은 방법이 있습니다. 해당 국가 및 지역에서 박테리아를 얻는 데 제한이 있을 수 있으므로 지역 연구 커뮤니티 내에서 후속 조치를 취하는 것이 좋습니다.
이진 벡터(유전자 및 프로모터)NANAGateway Recombinase 시스템을 사용하여 ISSA 프로토콜에 적합한 다양한 벡터를 개발했습니다. 여기에는 변형된 pCAMBIA 벡터를 기반으로 하는 과발현, RNAi knockout 및 promoter fusion 벡터가 포함되며 필요에 따라 기꺼이 제공됩니다. 또한 연구 커뮤니티에서 사용할 수 있는 많은 벡터가 있습니다.
LB mediaSigmaL3022동일한 제품은 다른 회사에서 공급될 수 있습니다
SigmaL2897이 있는 LB 배지A와 유사한 제품은 다른 회사에서 공급될 수 있습니다
AntibioticsSigmaNA카탈로그 번호는 binary vector에서 박테리아 선택에 다양한 항생제가 사용되므로 필요한 항생제에 따라 달라집니다. 이 제품은 다음에서 출처를 찾을 수 있습니다. 회사 범위
50 ml 스크류 탑 튜브Fisher Scientific14-432-22동일한 제품은 다른 회사에서 소싱 할 수 있습니다
2 ml MicrotubeWatson Bio Lab132-620C동일한 제품은 다른 회사에서 소싱 할 수 있습니다
MS MediaSigmaM9274동일한 제품은 다른 회사에서 소싱 할 수 있습니다
Scalpel blade no. 11SigmaS2771동일한 제품은 다른 회사에서 가져올 수 있습니다
. Parafilm "M"BemisPM996이것은 생성 후 형성층 창을 바인딩하는 데 사용하는 가장 좋은 제품입니다 
14 ml 라운드 바텀 튜브Thermo Scientific150268동일한 제품을 다른 회사
EDTASigmaE6758. 동일한 제품을 다른 회사
TritonSigmaX100. 동일한 제품을 다른 회사
X-GlucX-GLUC에서 직접공급할 수 있습니다.주문하려면 웹사이트로 이동해야 합니다 -
http://www.x-gluc.com/index.html Potassium Ferricyanide(III)Sigma244023동일한 제품을 다른 회사에서 공급받을 수
Potassium Ferrocyanide(II)SigmaP9387동일한 제품을 다른 회사에서 공급할 수 있습니다
Litmus paperSigmaWHA10360300동일한 제품을 다른 회사에서 공급할 수 있습니다
단일 가장자리 면도날ProSciTechL055동일한 제품을 다른 회사에서 공급할 수 있습니다
양면 면도날ProSciTechL056동일한 제품을 다른 회사에서 공급할 수
SEM 핀 스텁ProSciTechGTP16111동일한 제품을 다른 회사에서 공급할 수 있습니다
나사 캡이 있는 샘플 바이알ProSciTechL6204동일한 제품은 다른 회사에서 공급 될 수 있습니다
에탄올시그마E7023동일한 제품은 다른 회사에서 공급 될 수 있습니다
LR 흰색ProSciTechC025동일한 제품은 다른 회사에서 공급 될 수 있습니다
임베딩 몰ProSciTechRL090우리는이 다양성을 권장하지만 사용 가능한 옵션이 많이
물 Soulable 장착 매체ProSciTechIA019사용할 수 있는 마운팅 미디어의 한 가지 예이지만 다른 옵션이 존재하고 탐색할 수 있습니다.
과산화수소시그마216763A 유사 제품은 다른 회사에서 공급 될 수 있습니다
빙하 아세트산시그마A9967유사 제품은 다른 회사에서 공급 될 수 있습니다
Safranin OProSciTechC138유사 제품은 다른 회사에서 공급 될 수 있습니다
Quanta Environmental Scanning Electron MicroscopeFEI이것은 이 연구의 일부에서 사용된 기기이지만 저진공 모드가 있는 다른 SEM을 사용할 수 있습니다.
ImageJ 이미징 소프트웨어는다음 URL에서 가져올 수 있습니다 http://rsbweb.nih.gov/ij/
한천 에서 공급받을 수 있습니다에서 공급할 수 있습니다 있습니다 . 있습니다 드 있습니다 :

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