CD4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포

요약

우리는 쉬고 강글리오사이드 활성화 인간 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 세포막 발현 및 위치 파악을 결정 현미경에 사용하기위한 표준 항체 염색 프로토콜을 설명한다. 또한 실시간 PCR 실험은 <추가 낮은 입력 RNA 키트를 필요로하지 않는 40,000 세포를 사용하는 기술.

초록

서스펜션의 순진한 CD4 ⁺ T 세포의 활성화를 위해 본원에 기술 된 방법 및 공 초점 현미경 분석 된 커버에서의 준수는 실험을 프로파일 링하는 보수 표현 유동 세포 계측법 등의 CD4 ⁺ T 세포 활성화에 관여하는 강글리오사이드의 공간 현지화 및 시각화를 허용, 서부 블 롯팅 또는 실시간 PCR. 유동 세포 계측법 및 현미경을 통해 세포 지역화 통해 강글리오사이드 발현의 정량화는 높은 친화력과 특이성 안티 - 강글리오사이드 항체의 사용에 의해 얻을 수있다. 그럼에도 불구하고, 현탁액 중의 세포의 적절한 처리가 형광 또는 초점 현미경 취득 요구 필요한 접착 성을 촉진하는 배양 플레이트의 치료를 포함한다. 이 작품에서 우리는 순진한 CD4 ⁺ T 세포 활성화하는 동안 GD3 및 GD2 강글 리오 시드의 표현과 TCR와 colocalization을 결정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 리얼 t<40,000 세포를 사용 IME PCR 실험은 세포의 낮은 숫자 및 추가 저 입력 RNA 키트의 필요없이 수행 될 수있는 유전자 분석 실험을 보여주는 상기 GD3 및 GM2 / GD2 합성 효소 유전자의 결정을 위해 설명된다.

서론

CD4 ⁺ T 세포는 항원 제시 세포에 의해 활성화 ^한 후 자신의 이펙터 기능을 통해 면역 반응을 조율. 활성화 과정에서 변조 된 세포 메커니즘 연구는 면역 기능의 기본 과정에 대한 통찰력을 할 수 있습니다. 그들이 주변 ^혈액이 세포의 매우 작은 모집단을 대표하기 때문에, 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 연구는 복잡해질 수있다.

형광 현미경을 통해 여러보고 CD4 ⁺ T 세포 활성화에 관여하는 다른 분자 플라즈마 막 ^(3)에 주로 연관 단백질의 위치 파악을 연구 하였다. 강글리오사이드는 시알 산 함유 글리 고스되어 있으며 광범위가 같은 면역 세포로서 풍부한 다른 세포 인 신경 세포 연구되었지만 또한 생물학적으로 중요한 기능과 ^4,5- 강글리오사이드를 표현한다. 우리는 이전에 그쪽을보고ST8Sia 1 (GD3 합성 효소)과 GM2 / GD2 합성 효소 시알 산 전이 효소 α2,8의 상향 조절이 인간의 순진한 CD4 ⁺ T 세포의 활성화 동안 t, 즉 GD2의 중요한 표면 neoexpression 및 GD3의 강글 리오 시드 ^(6)의 상향 조절을 유도한다. 면역 세포 GD....

프로토콜

건강한 남성 기증자로부터 말초 혈액 동의하고 센트로 드 Investigaciòn 엔 DINAMICA Celular- 대학교 자치시 델 에스 타도 데 모렐 로스의 생명 윤리위원회의 승인을 얻었다.

1. 분리 및 인간 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 활성화

1. 동의서를 통해 건강한 인간 기증자로부터 유래 말초 혈액 2 ㎖를 수집하고 멸균 PBS-EDTA 2 ㎖로 희석 (1 배 인산염 완충 식염수 (PBS), 2 mM의 EDTA, pH를 7.4). 이전 ⁸ 설명한 바와 같이 1.077 밀도 자당 용액 3 ㎖의 상단에 천천히 희석 혈액을 추가합니다.
   주 : 밀도 차이에 의한 원심 분리시 차등 마이그레이션 적혈구 침강 완전히 발생할 덜 조밀 한 단핵 세포의 층 위에 형성된다. 말초 혈액 2 ㎖를 purificati 후 약 0.5 × ¹⁰⁶ 나이브 CD4 ⁺ T 세포를 렌더링단계에.
2. 더 휴식 21 ° C (30mm의 고정 된 각도 둥근 바닥 튜브를 사용 로터) 250 XG에 원심 분리기 30 분 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 기울기를 생성합니다. 원심 분리 후, PBMC를 명확히 백색 링으로서 관찰 될 수있다. 피펫으로 P....

결과

이 논문에 기술 된 프로토콜은 배양의 좋은 품질과 접착 휴식 및 활성화 인간의 순진한 CD4 ⁺ T 세포 (그림 1) 렌더링합니다. 활성화 된 CD4 ⁺ T 세포는 휴면 상태 (도 1A)와 비교하여 특징적인 증식 프로파일 (도 1B)를 도시한다. CD25 늦은 활성화 마커 공 초점 현미경 (그림 1C)에 의해 관찰 72 시간의 효율적인 활성화를 평가하는 데 유용합니다. CD69 마커는 유동 세포 계측법 또는 현재 현미경 조기 활성화 마커로서 사용된다. 폴리 -L- 라이신으로 코팅 된 커버 슬립에 휴식의 준수 및 활성화 순진한 CD4 ⁺ T 세포는 안티 GD3 및 안티 TCR 항체 (그림 2)와 이중 라벨로 보여 GD3 및 TCR의 발현 및 현지화를 연구하는데 유.......

토론

기술 된 프로토콜은 CD4 ⁺ T 세포 또는 세포의 수가 적은부터 다른 면역 세포 (예 PMBCs,도 5)의 세포 현탁액 갱글 또는 단백질 지역화하는데 사용될 수있다. 때문에 T 세포 비 접착 특성의 작은 크기의 불량 정보 또는 낮은 품질의 형광 현미경 사진의 결과를 취득 셀이 올바르게 부착되지 않은 경우.

이 선도, 치료 중 강글리오사이드의 공간 지역화 및 역학 (예를 들면, T 세포 활성화)를 보여준다 때문에 양질 초점 현미경 분석과 결합이 프로토콜은 강글리오사이드의 검출을 위해 박층 크로마토 그래피와 같은 기술의 사용에 비해 중요한 장점 생물학적으로 관련 데이터 ^11,12,13의 취득. 또한,이 프로토콜은 갱글 표현의 평가가 CD4 ⁺ T 세포의 소수 (2 × ^104부터 허용) 그 복제 또는 상이한 검정 ^(6)의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고급 RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	3% FBS
마우스 anti human CD3 항체	eBioscience	16-0037-81	OKT3 클론
마우스 anti human CD28 항체	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 클론
마우스 anti human GD3  항체	Abcam	ab11779	R24 클론
마우스 anti human GD2 항체	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a 클론
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 항체	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡ tific	A-21131
IgG2a 항체
Alexa Fluor 647 공액 안티마우스	Thermo Fisher Scieni¡ tific	A-21241
IgG2a 항체
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol 시약	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T 세포 분리 키트 II, 인간	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		분류
Nunc Lab-tek 챔버 슬라이드 시스템	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 레이저 컨포칼 현미경 (Olympus)	올림푸스		업라이트 BX61WI 및 IX81
순방향 서열 프라이머 GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		참조 7
역 서열 프라이머 GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		참조 7
순방향 서열 프라이머 GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		참조 7
역 서열 프라이머 GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		참조 7