분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

요약

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

체액 면역의 특징은 합성과 같은 병원체 항원은 (Ag), 특정 복근을 분비하고, 숙주 방어를 위해 사용되는 기능의 ASC를 생성하는 것이다. 개별의 체액 성 면역 반응의 기능적 상태의 정량, 혈청 복근 순환의 ASC는 모두 공통 기능 판독으로서 측정된다. 인간 말초 혈액 호스트 B 세포에 의해 유도 체액 성 면역 반응의 측정에 사용할 수있는 가장 편리하고 용이하게 접근 샘플이다. 의 ASC를 포함하여 고유 한 B 세포 하위 집합은, 유동 세포 계측법으로 정렬 혈통 특정 AB-접합 마이크로 비드 또는 셀을 통해 선택을 통해 말초 혈액에서 직접 분리 할 수있다. 또한, 정제 순진한 및 메모리 B 세포 활성화와 문화의 ASC로 분화 될 수있다. 구간 분비에 기여할의 ASC의 기능적 활동을 집광 효소 분석법 인 ELISPOT에 의해 정량화 될 수있다-linked immunoabsorbance 분석 (ELISA)과 웨스턴 블로 팅 기술은 단일 세포 수준에서 개인의 ASC의 열거를 활성화합니다. 실제로, ELISPOT 분석 점점 때문에 혈액 샘플을 다수의 취급 용이성 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 말초 혈에서 인간 B 세포를 분리하는 방법은 시험관 내에서의 ASC로 B 세포의 분화, 총 IgM-과의 IgG-의 ASC의 정량 ELISPOT 고용 여기에 설명 될 것이다.

서론

B 세포는 체액 면역의 발달에서 중요한 역할을한다. 그들은 초기 골수에서 개발 발전 용 나이브 비장으로서 림프 조직으로 이전 할 수 B 세포, 림프절, 및 편도로 혈류를 입력한다. 의 Ag 조우되면 어떤 나이브 B 세포는 배 중심 B 세포는 기억 B 세포 plasmablasts (PBS) / 혈장 세포 (PCS)로 분화 할 수 림프 여포로 이동한다. 대부분 PB들 / PC는 혈류로 송신하는 동안 거의 결국 장수의 PC ^(1)로 단말 분화를 거치도록 골수에 존재. 순환 B 세포는 이종이며, 정상 상태에서, PB들 / PC는 말초 혈액 ² 드물다. 계통 특정 표면 마커의 사용 가능성의 결과로, 유동 세포 계측법 말초 혈액 내의 B 세포의 서브 세트의 식별 및 특성화를위한 대중적인 방법이되었다. 흐름 cytometr의 확장 응용 프로그램Y는 고순도의 분리 및 B 세포의 서브 세트 각각의 분리를 허용하는 셀 소터 기능의 추가이다. 인간 순환 B 세포는 일반적으로 세 가지 주요 부분 집단으로 분류 다양한 발달 단계에있는 특정 표면 수용체의 발현에 근거 : 기억 세포 (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-) 나이브 B 세포 ^{(- -} CD38 CD19 ⁺ CD27) 및 PB들 / PC를 (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (그림 1). 본래 순진한 B 세포는 Ag로 발생하지 않았습니다. 그러나, 그들은 ⁺ CD27 ⁺ IgM의 기억 세포로 분화 될 수있다. 나이브 B 세포는 B 세포 항원 수용체 (BCR) -associated 분자 (예를 들어, CD19, CD20 및 CD22) 그들의 면역 레퍼토리 ⁵ 이질적 표현에서 균일하지만. CD27 ⁺ 기억 세포의 대부분은 CD27로 분화 될 수있다+ / 하이 CD38 ⁺ PB들 / PC를 ^6. 또한, 기억 세포 PBS를 / PC는 폴리 클로 날이고 발달 및 기능 ^{4-7 이질성을} 나타낸다. 순환 PB들 / PC는 일반적으로 수명이 짧은하고 CD138을 표현하지 않지만, 골수에 정착 만든 사람들은 말기 차별화하고 수명이 긴 될 것입니다. 말기 차별화 된 PC는 CD138을 표현하고 그 표면 ⁸ CD27 분자를 하향 조절한다. PB들과 PC 모두 복근을 분비 할 수 있기 때문에, 많은 경우에 그들은 집합의 ASC로 표시된다. 대조적으로, 항원에 노출 된 적이없는 B 세포 나 기억 세포도 복근 ^9-10의 상당한 양을 생산할 수있다. 적절한 배양 조건 ^{(6), 11-15에} 위치 할 때 십일 - 절연 경우 역시, 양쪽 나이브 메모리 B 세포는 3의 ASC로 분화 될 수있다. 사실,의 ASC는 그 직접 고립 된 프랑스와 CD27과 CD38의 체외 분화 공유 유사한 표면 표현에서 파생 된톰 말초 혈액 ^(6). 또한, 시험관 내에서 분화의 ASC는 PB들 / ⁶ PC의 ^순환 유사한 표면 CD20의 낮은 레벨을 표현한다. 문화 유래의 ASC 모든 수명이 짧은 있지만, 그들은 기능적 능력과 체액 성 면역에 기여 할 수 있음을 나타냅니다 복근을 분비 할 수 있습니다.

지금까지와 가장 일반적으로 적용되는 방법은 체액 성 면역 반응에 대한 기능 정보를 획득하여 ELISA 및 ELISPOT 모두이다. ELISA 96 웰 플레이트 기반 분석이며, 자주 혈청 AG-특정 복근 및 기타 분석 (예, 사이토 카인)의 역가를 측정하는데 사용된다. 그것은 편리하고 확장 가능합니다. ELISA는 액체 시료 ^(16)에, 절대치 또는 혈청과 같은 다른 물질의 존재를 검출하기 위해 고상 효소 분석을 사용하도록 설계된다. 혈청의 ELISA를 판독 널리 신체의 면역 반응을 나타내는 데 사용되었다. 재 취득에 필요한 도구ELISA 분석에서 adouts는 분광 마이크로 플레이트 리더입니다. 독자는 일반적으로 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) - 컨쥬 게이트 검출 복근 특정 기판 ^(17)의 반응으로부터 생성 된 최종 생성물의 광학 밀도 (OD)를 결정할 수있다. 체액 성 면역 반응을보고와 관련하여, ELISA에 의해 결정 혈청 구간 레벨은 본문에서의 ASC의 집단했지만 개별없는 성능을 나타낸다. 또한, ELISA 계정으로 복근을 분비하지 않는 메모리 B 세포에 의해 참여를 취할 수 없습니다.

ELISA와 마찬가지로, ELISPOT은 검출 및 말초 혈액 샘플 ^{17 ~ 18에서} 면역 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법이다. ELISPOT는 샌드위치 ELISA에 관한 기술이다. 그것에서, 세포는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 단기 배양 용 96 웰 마이크로 플레이트의 막 역행 웰에 배치된다. ELISPOT 분석은 마이크로 및 developin에 웨스턴 블로 팅을 수행하는 유사g 각 웰의 PVDF 막에있는 관광 명소입니다. 자동화 ELISPOT 리더 시스템 또는 수동 계산을위한 실체 현미경이 필요합니다. 면역 반응을 검출 ELISPOT에서의 가장 큰 장점의 ASC 및 사이토 카인을 분비하는 세포의 정량화는 뛰어난 감도이다. 그것은 각각 체액 성 및 세포 성 면역에 기능적 활동을보고합니다. 체액 성 면역 기능의 측정에는, ELISA 및 ELISPOT 열거의 ASC의 수에 의해 결정 혈청 구간 레벨들은 상관되어 있지만, 이들 두 분석으로부터의 데이터 판독 기능은 영향 ^19-20에서 약간의 차이가있다. ELISPOT의 가장 큰 장점은 방법의 감도입니다. 복근의 적절한 이소 타입의 알려진 양이 참조 용으로 포함되고 ELISA에 의해보고 된 혈청 구간 역가 수준 농도 판독으로 더 정량적으로 상대 구간 레벨을 나타내는, OD 판독으로 반 정량적으로 제시하거나한다. 반대로, ELISPOT의 결과이다 presente관심의 세포 풀의 ASC의 절대 수와 D (예를 들어, 분획 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 한 PBMC로부터 정제 된 B 세포). ELISPOT은 하나의 ASC를 감지 할 수 있지만, ELISA 전에 측정에 최적화 된 분석에 의존하는 농도에 도달의 ASC에서 Ab의 금액이 필요합니다. 따라서, ELISPOT은 정량 감도 ELISA에 분명 우수하다. 또한, ELISPOT은 활성화 기억 세포의 체외 분화의 ASC 정량화에 적합하다. 메모리 B 세포는 복근을 분비하지 않지만 활성화시의 ASC로 분화 할 수 있습니다; 그들은 따라서 ELISA에 의해 검출 된 혈청 복근에 기여가 없습니다. 따라서, ELISPOT 배양에서 활성화 후 기억 세포 순환의 면역 반응의 측정에있어서 선택의 방법이다. 이는 장기 체액 면역의 유지의 모니터링을 허용한다.

프로토콜

인간의 말초 혈액은 동의서에서 건강한 기증자로부터 얻을 수 있어야하며, 혈액 샘플의 사용은 개별 기관 생명 윤리위원회에 의해 설립 승인 가이드 라인을 준수해야합니다. 본 연구에서는 프로토콜은 국립 대만 대학 병원의 내부 검토위원회 (프로토콜 번호 201307019RINB)에 의해 승인되었다 유동 세포 계측법 (그림 1)과 ELISPOT 분석 (그림 3)의 결과의 데모 인간의 혈액을 사용합니다.

1. 분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화

1. K ₂ EDTA (1.5-2.0 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 15 ML의 튜브로 (팔꿈치에 cubital 포사 앞쪽에) 중간 cubital 정맥에서 혈액 ~ 10 ㎖를 그리고 즉시 튜브를 응고를 방지하기 위해 여러 번 반전 형성.
2. 적혈구가 (RBC)의 버퍼 (150 mM의 NH ₄ CL, 10 mM의 KHCO _3, 1 mM의 EDTA를 용해 (121 ° C, 15 분) 오토 클레이브의 35 mL를 넣고, 페이지신선한 혈액 샘플 (≥ 3 함유 튜브 H 7.4) : 1 부피 / 부피)을 더 이상 5 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다.
   주 : 튜브를 통해 빛의 전송의 모양은 RBC 용해의 완료를 나타냅니다.
3. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 펠렛 색 흰색 있는지 확인하십시오.
4. 10 멸균 된 인산 완충 식염수 mL로 펠렛을 재현 탁 (PBS, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.47 mM의 KH ₂ PO _4, 산도 7.4) 단계 1.3에서와 같이 원심 분리기.
5. 상등액을 버리고 ㎖의 RPMI 1640 배지 (첨가제 : 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 2 mM L- 글루타민) 10 펠렛을 재현 탁 다음과는 판형 10 cm 배양 접시에 세포 (접시 당 혈액 10 ㎖). 30 분 동안 5 % CO _2와 37 °의 C 배양기에서 접시를 놓습니다.
6. 조심스럽게 배양 접시를 몇 번 소용돌이 및 배치15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 배지 (서스펜션 세포). 배양 접시에 부착 세포 (주로 대 식세포)를 폐기하십시오.
7. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
8. RPMI 1640 배지 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 혈구 또는 자동 셀 카운터 셀 수를 계산합니다.
   주 : 절연 백혈구의 생존 정상적으로 트리 판 블루 배제에 의해 90 %보다 크다.
9. 단계 1.7에서와 같이 원심 분리기 (5)의 농도로 차가운 PBS 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA)의 ~ 200 μL의 세포를 재현 탁 - 10 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖.
10. ¹⁰⁶ 세포 당 (B 세포를 음성 선별 용) 혈액 세포에 특정 비오틴 화 항 - 인간 구간 칵테일 5 μL를 넣고, 30 분 ²¹ 얼음 위에서 배양한다.
    참고 : 항 - 인간 Ab의 칵테일은 적어도 CD2 (또는 CD3), CD14 및 CD16 특정 애비를 포함해야합니다.
11. 10 배를 초과하는 볼륨 추가멸균 PBS의 세포를 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리하고, 상등액을 폐기한다.
12. 동일 스트렙 타비 딘 - 복합 마이크로 비드의 양 펠릿에 (10 ⁶ 세포 당 5 μL)을 추가하고 철저하게 섞는다.
13. 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에서 30 분 동안 얼음에 품어.
14. 튜브에 PBS 버퍼 2 ML을 추가합니다.
15. 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 8 분 동안 실온에서 품어. 갈색 마이크로 비드 서서히 옆의 자석 ^(22)에 튜브 벽에 부착된다.
16. 자기 스탠드에 남아있는 관으로, 조심스럽게 새로운 멸균 15 ML의 튜브 ^(22)에 뜨는을 전송합니다.
17. 반복 1.16-1.14 단계를하고, 손길이 닿지 않은 B 세포를 포함하는 두 개의 상층 액을 결합한다. 마이크로 비드를 폐기하십시오.
18. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
19. 하류 실험 RPMI 1640 배지에 펠렛을 재현 탁.
    참고 : 일반적으로 1-5 × 10 ⁵ B 세포의 지혜HA 말초 혈액 10 mL의 95 % 이상의 순도가 ^23을 분리 할 수있다.

격리 된 B 세포 2. 정제 및 메모리의 분리 및 나이브 B 세포

1. 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정한다.
2. 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리 및 RT 후 차가운 PBS 완충액 100 μL의 세포를 재현 탁.
3. 추가 1 - 10 ⁶ 세포 당 바이오틴 CD27 단클론 항체 μg의 2를 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
4. 5 분 동안 600 XG에 튜브와 원심 분리기에 PBS 버퍼의 10 ML을 추가합니다.
5. 뜨는을 취소하고 PBS 버퍼 50 μL의 세포를 재현 탁.
6. 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 세포 - (2 μg의 / 10 ⁶ 세포 1) 스트렙 타비 딘 자기 마이크로 비즈의 동일한 금액을 추가합니다.
7. 부드럽게 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
8. 튜브에 PBS 버퍼의 3 mL의 - (2)를 추가합니다.
9. 놓고자기 스탠드에 관하고 갈색 마이크로 비드를 자석에 가까운 측에 부착 할 수 있도록 8 분 동안 RT에서 배양한다.
10. 자기 받침대의 관을 조심스럽게 새로운 멸균 튜브로 상청액 분획을 전송. 순진한 B 세포 ^-이 부분은 풍부한 CD27가 포함되어 있습니다.
11. 마이크로 비드를 포함하는 튜브에 5 mL를 추가하고 부드럽게 마이크로 비드를 재현 탁 (즉, CD27 ⁺ 메모리 B 세포의 농축 비율) ^{24 ~ 25.}
12. 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 하류 실험 RPMI 1640 배지와 펠렛을 재현 탁.
    주 : 일반적으로, ~ 30 - B 세포의 60 %는 건강한 공여체 ^{(7), 25-26의} 한 PBMC로부터의 CD27 ^{+ 메모리} 셀들로 정제 할 수있다.

나이브 B 세포, 메모리 B 세포 및 PB들 /의 PC의 컬렉션에 대한 정렬 3. 셀

1. 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하는 hemocytome를 이용하여 세포 수를 결정터 또는 자동 세포 계수기.
2. 5 mL의 폴리스티렌 튜브에서 ¹⁰⁷ mL 당 농도에 차가운 PBS 완충액으로 세포를 재현 탁.
3. 1 추가 - 10 ⁶ 셀 당 인간 IgG의 2 μg의 및은 FC 블록 10 분 동안 얼음에 품어.
4. 1 μg의 각 추가 항 CD19를-APC (클론 : HIB19), 항 CD27-eFluor450 (클론 : O323), 및 항 CD38-PE (클론 : HIT2) 10 ⁶ 세포 당; 잘 혼합하고 30 분 ^{4, 27} 얼음에 품어.
5. 단계 3.4의 마지막 5 분에서, 상업 7 aminoactinomycin의 D (7-AAD)의 5 μL를 추가합니다.
6. 5 분 동안 600 XG에 튜브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 PBS의 2 ML을 추가합니다.
7. 15 ㎖의 튜브 용액 당 5 × ¹⁰⁷ 세포 - 1의 농도 (2 % BSA, 2 mM의 EDTA로 멸균 PBS) 정렬 버퍼에 세포를 재현 탁.
8. 세포 덩어리를 제거하기 위해 나일론 메쉬 셀 스트레이너 (40 ㎛의 공극 크기)를 통해 세포를 필터.
9. 유동 세포 계측 정렬하여 세포를 분리바이올렛 (405 ㎚), 청색 (488 nm의)과 빨간색 (640 ㎚) : 어 세 가지 레이저를 장착.
   참고 : 3 색이 세포 계측법 ^27-28 흐름을 위해 혼자 블루 레이저 충분하다.
10. 정렬 세 나이브 B 세포의 동시 수집을 위해 (5 ㎖ RPMI 매질 포함) 15-㎖의 튜브 (CD19 ⁺ CD27 ^-)로 세포, 기억 세포 (CD19 ⁺ CD27 ⁺⁾ 및 PB들 / PC를 (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / 하이} CD38의 ^{+) 3-4, 28.}
    주의 : 단계 4에 기재된 바와 같이 분류 및 나이브 기억 B 세포를 배양 할 수있다.

나이브 B 세포 ^- 고립 ^된 인간의 CD19 ⁺ B 세포, CD19 ⁺ CD27 ⁺ 메모리 B 세포와 CD19 ⁺ CD27의 체외 분화 4.

1. 단계 1.19, 2.10, 2.11 및 3.10로 정제하여 세포를 이용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 결정한다.
2. RPMI 1640 배지로 세포를 재현 탁1의 농도에서 -는 ml 당 10 × ^105은 12 웰 플레이트로 나누어지는.
3. / mL의 ^{18, 29} 5 μg의 / 10 ⁶ 세포에서의 CpG (ODN 2006)를 추가합니다.
4. 배양 5 일간 5 % CO _2, 37 ° C의 배양기에서 세포.
5. 물론 각각의 세포를 수확 15 ML의 튜브에 개별적으로 배치, 각 튜브에 PBS의 5 mL를 넣어 5 분 동안 600 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기.
6. 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. RPMI 1640 배지로 용액에 10 × ¹⁰⁵ - (1)의 농도로 세포를 재현 탁.

5. ELISPOT 분석

1. 30 초 동안 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 증류수 35 % 에탄올의 30 μL를 추가한다.
   참고 : 피펫 팅 할 때, 항상 우물에서 막를 만지지 마십시오.
2. 에탄올을 제거하기 위해 ELISPOT 판을 반전.
3. 각 웰에 150 μL 멸균 DDH ₂ O의 넣고 배양5 분간 RT에서 그들을 잔류 에탄올을 세척하는 단계; 3 분 동안 실온에서 멸균 PBS의 세척에 따릅니다.
   참고 : 5.3-5.1이 판의 제조에 따라 선택 될 수있다 단계.
4. 넣어 5 μg의 / mL의 클론 F (AB ') 항 - 인간 IG (IgG의 + IgM의 +의 IgA)의 ₂ 조각 50 μL 4 ° C에서 하룻밤을 품어 (PBS로) ELISPOT 플레이트의 각 웰에와 (선호) 또는 2 시간 ¹¹ 37 ° C를.
   참고 : 사용할 때까지 파라 필름과 판의 가장자리를 밀봉합니다.
5. 3 분마다 RT에서 두 번, 언 바운드 복근을 제거 각 웰에 PBS 200 μL를 추가하고,이를 배양 접시를 반전.
6. 잘 차단 각각 5 % BSA (또는 RPMI 1640 배지)를 PBS 200 μL를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 이들을 배양한다.
7. 차단 버퍼를 제거하기 위해 번호판을 반전. 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오.
8. 각 웰에 RPMI 1640 배지 100 μL를 추가하고 37 ° C에서 그들을 품어.
9. 준비된 세포를 시드하는 경우, RPMI 1640 배지를 제거하기 위해 반전 플레이트.
10. 종자 100 μL (5 × ¹⁰⁴⁾ 50 μL (2.5 × ^104)과의 웰에 25 μL의 셀 (1.25 × ¹⁰⁴⁾ (단계 1.19, 2.10, 2.11, 3.10에서 4.6) ELISPOT 판. RPMI 1640 배지로, / 잘 150 μL에 볼륨을 가지고.
    참고 : 세포를 도금 하나 또는 두 개의 2 배 연속 희석의 최소 권장합니다.
11. 14 시간 ^18-8 5 % CO _2와 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어. 배양 중에 플레이트를 이동하지 마십시오.
12. 세포 및 RPMI 1640 배지를 제거하는 번호판을 반전.
13. 3 분 동안 실온에서 때마다 5 회 (0.05 % 트윈 20과 PBS) 200 μL / 잘 PBS-T의를 추가하고 그들에게 품어. 5 회 세척 각 사이의 세척 완충액을 제거하기 위해 판을 전환.
14. 염소 항 - 인간 IgG-알칼리성 포스파타제 (AP), Fcγ 특정 애비를 추가 (IgG를 감지, 1 : 5,000 PBS-T에서) 또는 염소 항 - 인간 IgM의-AP, Fcμ 단편 특정 애비 (IgM의 검출, 1 : PBS-T 5,000) 지정된 우물에와 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
15. 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오.
16. 50 μL / 웰의 bromochloroindolyl 인산 니트로 블루 테트라 졸륨 (BCIP / NBT) 기질 용액을 추가합니다. 15 분 - 퍼플 색의 반점은 보통 5에 나타납니다.
17. 관광 명소의 과도한 개발을 방지하기 위해 100 μL / 잘 DDH ₂ O를 추가합니다.
18. 모든 지점의 전체 개발 후 수돗물을 실행하는 접시를 씻어.
19. 판의 암거를 제거하고 어둠 속에서 공기 건조 할 수 있습니다.
20. 이미지 획득 / 분석 부 (예를 들면, 자동 또는 수동으로 스캐너 해부 현미경을 통해)로 자동 플레이트 판독기를 사용하여 스폿을 카운트.
    주 : 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 저장하고 나중에 분석 될 수있다.

결과

PBMC를이 적혈구 및 부착 세포 (1.7-1.2 단계)의 고갈되었다. 세포의 분취 량 (2 × ^106)의 말초 혈 (도 1)의 B 나이브 세포, 메모리 B 세포, PBS를 / PC를 모집단을 설명하기 위해 유세포 분석을 행 하였다. 이 공여자의 PBMC를, 상기 림프구의 약 10 %가 CD19 ⁺ B 세포이다. ㄴ 세포 구획에서 CD19 ⁺ CD27의 비율 ^- 나이브 B 세포는 약 50 %였다. 한편, CD19 ⁺ B 세포의 약 50 ^{%가 25 ~ 26는} CD27 ⁺ B 세포의 메모리 ^(7)였다. 참고로, CD27 ⁺ B의 메모리 셀은 상기 IgD의 ^(4)를 포함하여 분리 될 수있다. ^{2, 30 ~ 31} ...

토론

분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화

일반적으로 적혈구 효율적으로 파열 및 용해 버퍼 (단계 1.2)에 의해 삭제 될 수 있습니다. 세포 생존율은 염화 암모늄에 의해 영향을받을 수 있습니다로는 5 분 이상 더 이상 RBC 용해 버퍼 PBMC를 품어하지 않는 것이 중요합니다. 대안 적으로, 적혈구 및 혈소판 동시에 다음의 프로토콜에 의해 제거 될 수있다.

산 스트로스 구연산 (ACD) 완충액으로 신선한 전혈 믹스 (39 mM의 시트르산, 75 mM의 시트르산 나트륨, 135 mM의 덱 스트로스하여 pH 7.4) 9 부피비 : 1, 혈액에 버퍼. 실온에서 10 분 동안 250 XG에 원심 분리기. 분리를 나타내는 층의 형성에주의를 기울이십시오. 기음과 혈소판 및 혈소판이 풍부한 혈장 (노란색)를 포함하는 상위 계층을 버린다. PBMC를 포함 된 인터페이스에 얇은 중간 층을 제거 (전합니다 .e., 버피 코트를)....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 mL 튜브
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	내독소가 없는
트리판 블루 0.5% 용액	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B 림프구 농축 세트	BD Biosciences	558007
Biotinylated CD27 mAb	Biolegend	302804	클론 O323
Streptavidin 자기 마이크로 비즈	BD Biosciences	9000810
15 mL 팔콘 튜브	BD 팔콘	352196
블루 나일론 메쉬 셀 스트레이너, 40 μ m	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	클론 HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	클론 O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	클론 HIT2
안티 휴먼 CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	클론 HIT2
안티 휴먼 CD45-FITC	Biolegend	304006	클론 HI30
안티 휴먼 CD45-FITC	BD Biosciences	555482	클론 HI30
안티 마우스 / 마우스 / 인간 CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	클론 LG.3A10
안티 휴먼 CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	클론 L128
안티 휴먼 CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	클론 LT19
항인간 CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	클론 LT19
안티휴먼 CD20-FITC	BD Biosciences	555622	클론 2H7
비오틴화 항인간 CD27	Biolegend	302804	클론 O323
비오틴화 항인간 CD27	eBioscience	13-0279-80	클론 O323
7-아미노악티노마이신 D (7-AAD)	BD 생명과학	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	B형 CpG
재조합 인간 IL-2	PeproTech	200-02
재조합 인간 IL-10	PeproTech	200-10
재조합 인간 IL-21	PeproTech	200-21
재조합 인간 sCD40L	PeproTech	310-02
단백질 A of S. aureus Cowan(SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen 필터 플레이트, 0.45 µ m 기공 크기	Merck Millipore	MSIPS4510	소수성 PVDF 멤브레인이 있는 멸균 투명 96웰 필터 플레이트
BCIP/NBT 용액	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT 단일 시약, 알칼리성 인산가수분해효소 기질	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 염소 항인간 Ig (IgG + IgM + IgA)의 단편	ImmunoResearch	109-006-127
염소 항인간 IgG-알칼리성 인산가수분해효소, Fcγ 단편 특이적	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
염소 항인간 IgM-알칼리성 인산가수분해효소, Fcµ 단편 특이적	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
염소 항-인간 IgG-과산화효소, Fcγ 단편 특이적	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
염소 항-인간 IgM-과산화효소, Fcµ 단편 특이적	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC 기판 키트	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot 분석기	씨티엘