Method Article

그만큼 초파리 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

DOI:

10.3791/54585

⸱

October 6th, 2016

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

Abstract

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Drosophila melanogaster는 전체 유기체의 맥락에서 종양 발달 및 진행에 대한 기능적 및 기계론적 연구를 위한 강력한 실험 시스템으로 부상했습니다. 유전자 모자이크를 생성하는 정교한 기술은 정상 조직으로 둘러싸인 시각적으로 표시되고 유전적으로 정의된 클론의 유도를 용이하게 합니다. 클론은 다양한 분자, 세포 및 오믹스 접근 방식을 통해 분석할 수 있습니다. 이 연구는 MARCM(Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker) 기술을 사용하여 초파리 유충의 눈/더듬이 상상 디스크(EAD)에서 다양한 악성 종양의 형광 표지된 클론 종양을 생성하는 방법을 설명합니다. 유충에서 모자이크 EAD 및 뇌를 회수하는 방법과 형광 형질전환 리포터의 동시 이미징 및 항체 염색을 위해 처리하는 방법을 설명합니다. 모자이크 조직의 분자 특성화를 용이하게 하기 위해 EAD에서 전체 RNA를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 해부 절차는 모든 유충 단계에서 EAD와 뇌를 회복하는 데 적합합니다. 상상 디스크에 대한 고정 및 염색 프로토콜은 초파리 단백질을 인식하는 여러 형질전환 리포터 및 항체와 함께 작동합니다. RNA 분리를 위한 프로토콜은 다양한 유충 기관, 전체 유충 및 성충 파리에 적용할 수 있습니다. Total RNA는 후보 물질 또는 게놈 전체 접근법을 사용하여 유전자 발현 변화를 프로파일링하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 클론 종양의 침습성을 정량화하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 사용이 제한되어 있지만 기본 개념은 인지 편향을 피해야 하는 다른 정량적 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

Introduction

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암 발생률과 사망률을 극적으로 전 세계적으로, 특히 노인들 사이에서 증가하고 질병의 가장 유 전적으로 이질적인 그룹 중 하나를 나타냅니다. 암은 고유의 종양 억제 메커니즘을 탈출하고 통제 분할하는 종양 시작 세포에서 클론 적 기인한다. 죽음과 분화를 억제하면서 협력 적 성장, 증식과 운동성을 촉진 유전자 병변의 점진적 축적은 매우 악성 전이성 치명적인 종양으로 초기 양성과 성장을 변환합니다. 이것은 유전 적 변형에 더하여, 종양 진행이 미세 환경에서 복수 종양 세포 유형 (예를 들어, 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 사이의 주변의 스트로마 및 크로스 토크의 변화를 필요로한다는 증거가되고있다. 종양 기질 상호 작용을 포함하여 악성 변환을 기본 분자 원리를 이해하는 것은 예방하기 개발에 매우 ​​중요하다기 및 조기 검진 전략뿐만 아니라 새롭고 효과적인 치료법은 암 전이 및 약물 내성을 방지한다.

과일 초파리 비행은 빠른 생성 시간 때문에 암 연구 1-4위한 매력적인 시스템이되었다, 파리와 인간의 거의 모든 유전자의 조작을 용이하게 고급 유전자 도구의 제한으로 유전자 중복과 부 사이의 노드 신호의 놀라운 보존 일시적으로 공간적으로 제한 방법. 다양한 악성 종양 유전자 정의 재현성 MARCM 기술 5를 사용 달리 야생형 조직에서 전구 세포의 서브 세트에 이득 - 및 기능 상실 돌연변이를 도입함으로써 초파리 설계 될 수있다. MARCM 도구는 FLP / FRT는 (FLP 재조합 효소 / FLP 인식 대상이) FLP 아웃 7 GAL4 / UAS (업스트림 활성화 시퀀스) 8 표적 유전자와 유사 분열 재조합 (6) - 중재 결합발현 시스템 구. dsRNA를 유도 유전자 침묵에 대한 종양 유전자 또는 형광 단백질 cDNA를 또는 반전 DNA의 반복을 포함한 모든 UAS 기반 유전자의이 방법의 표현으로, 특정 유전자 궤적과 재결합으로 인해 GAL4 리프레을 잃은 세포의 복제에 제한됩니다 (도 1A). 클론 패치가 녹색 형광 (GFP) 또는 적색 형광 단백질로 표시 (예를 들어, RFP,을 DsRed, mCherry)는 쉽게 개발, 격리 및 분석을 통해 추적 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이들 동작은 직접 인접하는 야생형 조직과 비교 될 수있다. 따라서, 질문은 유전 적 병변의 자율이 아닌 자율적 인 효과를 편리하게 공부하실 수 있습니다 세포 관련의. 포유 동물과 마찬가지로, 만 클론은 여러 종양 병변은 초파리에서 악성되고 포유 동물의 암의 주요 특징을 요점을 되풀이 결합된다. 그들은 세포 사멸을 회피 염증을 유발, 불멸과 INVA되고, overproliferate시브는 궁극적으로 호스트 10-17를 죽이는.

여기, 우리는 프로토콜이 MARCM 기술을 사용하여 초파리 유충의 눈 / 더듬이와 뇌 조직에서 유전자 정의 클론 종양을 생성하기 위해 설명합니다. 이 방법은 눈이없는 인핸서 (eyFLP) (18, 19)의 제어하에 효모 FLP 재조합 효소를 발현하는 MARCM 테스터 재고에 의존한다. 이러한 방식으로, GFP 표지 클론 peripodial 및 주상 EAD의 상피 세포 및 배아와 애벌레 단계 (그림 1A, B 및 기준 20)을 통해 뇌의 neuroepithelium 모두에서 생성됩니다. neuroepithelium는 차별화 된 광학 로브 뉴런을 생성 neuroblasts에 상승을 제공하면서 EAD가 성인 눈, 안테나와 머리 캡슐로 개발로 클론 쉽게 성인이 될 때까지 올 수 있습니다.

우리 드 모자이크 조직의 광범위한 분자 기능 및 표현형 특성을 용이하게하기 위해,서기관 세 번째 령 유충에서 EAD과 뇌의 해부에 대한 프로토콜은 세 가지 다른 응용 프로그램을 처리하는 방법을 간략하게 설명합니다 : (ⅰ) 형질 전환 형광 기자와 면역 검출, 종양 침입 및 (ⅲ) 분석 (II) 정량 유전자 발현은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR) 또는 높은 처리량의 mRNA 서열 (mRNA의 서열 -) (도 1C)을 이용하여 변경한다.

면역 염색 프로토콜은 특정 항체와 관심있는 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 형질 전환 형광 전사 기자는 특정 신호 전달 경로의 활동에 편리하고 정확한 시공간 정보를 제공합니다. 세포 계보 특정 기자 한편, 모세 조직 내의 별개의 유전자형 간의 종양 세포 집단에 정량적 변화를 반영한다. 침략 행동의 정량은 유전자형 사이의 종양 악성 종양의 비교를 용이하게에스. 마지막으로, RNA 분리에 대한 모자이크 EAD의 수집 및 처리를 설명하는 프로토콜은 각각 QRT-PCR 및 게놈 전체의 mRNA-SEQ, 다음 역전사 등 모두 크고 작은 규모의 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다. 이 분석에서 얻어진 정성 및 정량 데이터는 클론 종양의 사회적 행동에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, 그들은 개인의 유전자, 유전자 네트워크와 다른 단계의 종양 미세 환경과 종양의 측면의 역할에 대한 기능 연구를위한 견고한 기초를 생산하고 있습니다.

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Protocol

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참고 :이 작업은 eyFLP1을 활용; 행동> Y +> GAL4, UAS-GFP; FRT82B, 욕조 - Gal80 MARCM 82B 그린 테스터 라인 (11). 같은 w 같은 계통의 남성에 MARCM 82B 그린 테스터 처녀를 넘어; UAS-A; UAS-B의 RNAi, FRT82B C의 MUT 유전자형은 유사 분열 재조합이 3 번째 상동 염색체의 오른쪽 팔 사이에 발생하는 자손을 얻을 것입니다. 이러한 방식으로, FRT82B 사이트 원위 위치 유전자 C의 클론 동형 접합 돌연변이는 EAD 뇌 neuroepithelium 내에서 발생한다. 이 클론 유전자 B (그림 1A)에 대한 GFP, 유전자 A와 dsRNA를 표현합니다. 는 X, 2L, 2R, 3L 및 3R에 재결합을위한 다양한 eyFLP-MARCM 테스터 라인을 설립하고, 비행 지역 사회 내에서 사용할 수있다.

1. 플라이 처리, 십자가, 및 준비

  1. 여러 보을 채워 실온에서 해당 MARCM 테스터 재고를 확장동시에 ttles. 충분한 처녀가 후속 십자가 수집 할 수 있도록 2-3 일마다 신선한 병으로 성인 플립.
    참고 : 처녀를 수집 할 때,이 여성의 생식력을 타협으로 2 CO하는 장기간 노출을 피하십시오.
  2. 실험의 규모에 따라 최소 10 MARCM 테스터 처녀와 (예를 들어, 형광 기자와 면역 염색의 영상의 경우) 또는 최소 30 처녀과 10 명의 남성 (예를 들어, 용 병 4 명의 남성을 사용하여 유리 병에 비행 십자가를 설정 RNA 분리 및 침입의 정량).
  3. 긴 하루를 16 시간 / 8 시간의 명암 사이클에서 25 ° C에서 자손을 올립니다. 유충의 재현 할 준비를 촉진하고 혼잡을 방지하기 위해 새로운 병 / 병에 매 24 시간을 부모 플립.
    참고 : 달걀 누워 (AEL) 후 6 일에 시작, 후반 세번째 령 제어 애벌레 정지 공급은 방황 시작하고 pupariation를 입력합니다. 대조적으로, 유충 번데기 - 전이의 개시는 해제 될 수있다누워 또는 EAD가 증식 또는 악성 클론 종양 베어링과 애벌레의 존재.

2. 세 번째 탈피 애벌레를 수집

  1. 면역 염색의 경우, 약 20 후반 세번째 령 유충 (벽에 방황하고 음식에서 비슷한 신체 사이즈들)를 수집합니다. 부드럽게 유리 병 또는 병에서 애벌레를 선택하고 인산염 완충 식염수 (PBS) 가득 배아 유리 접시에 그들을 전송하는 집게를 사용합니다.
    1. RNA 분리 및 침입의 정량화를 들어, 적어도 80 후반 세번째 령 유충 (벽에 방황하고 음식에서 비슷한 신체 사이즈들)를 수집합니다. 표면이 덮여 때까지 유충을 포함하는 비행 병에 PBS를 분출하기 위해 물총 병을 사용합니다.
    2. 주걱 음식의 상단 층을 연화 페트리 접시에 유충을 포함하는 식품 매쉬 붓는다. 집게를 사용하여 부드럽게 애벌레를 선택하고 PBS로 가득 배아의 유리 접시로 전송합니다.
  2. PBS의 UNT와 유충을 씻으십시오위원장 모든 잔여 음식이 제거됩니다. 애벌레 몸 전체 랜덤 GFP 양성 반점 (그림 2A, 2B 및 참조 토론 섹션)을 수행하는 모든 "표범 애벌레를"폐기 16X 배율로 8 형광 실체 현미경 아래의 유충을 검사합니다.
    참고 : RNA 분리를 들어 1 분 동안 70 %의 EtOH의 끝에서 두 번째 세척 단계를 포함한다.
  3. 해부 때까지 얼음에 PBS에서 선택한 애벌레가 들어있는 접시를 놓습니다. 30 분 내에 처리 유충은 추위와 굶주림의 부작용을 방지 할 수 있습니다.

애벌레 3. 해부

  1. 실체 현미경 하에서 EAD를 해부하기 위해 부드럽게 유리 접시 바닥에 대한 유충의 중간 부분을 눌러 포셉 한 쌍을 사용합니다. 두 번째 집게로, 애벌레 입 후크를 잡아 멀리 신체 (그림 2C)에서 그들을 잡아 당깁니다.
    참고 : 당기는 힘은 EAD 파이를 연결하는 광섬유 줄기를 중단하는 것이 충분하다뇌 로브에 대한 연구. 뇌 또는 부품 EAD 부착 유지하고 그들의 존재는 상기 애플리케이션에 바람직하지 않은 경우, 겸자 두 쌍의 도움으로 광섬유 줄기 잘랐다. (예를 들어, RAS의 V12의 scrib 1) EAD 뇌 로브 사이의 연결이 점점 overgrowing와 클론 세포를 마이그레이션하여 시간에 가려된다 침습적 종양하십시오.
    1. 온전한 복부 신경 코드 (VNC) (그림 2D)과 EAD / 뇌의 복잡한을 준비하려면 몸의 중앙에 유충을 잘라 집게를 사용합니다. 후방 절반을 폐기하십시오.
    2. 한 집게의 끝 사이의 애벌레 몸의 앞쪽 절반을 잡고, 두 번째 집게의 끝 입 후크에 눌러 첫 번째 집게 쌍과 그 위에 표피를 압연하여 애벌레 내부 아웃 플립.
  2. 조심스럽게 EAD 쌍을 남기면서 모든 외부 조직 (예를 들어, 침샘, 지방 본문 및 창자)을 제거하거나 집게를 사용하여입 후크에 연결된 EAD / 뇌 복잡한. 위에있는 표피에서 입 후크를 풀다. 몸의 근육과 표피 (도 1B, 2C, 2D)에 연장 축삭 돌기를 절단하여 VNC를 무료로 제공됩니다.
    참고 : 입 고리가 집게로 조직의 안전 조작이 가능하고 세척하는 동안 조직을보다 효율적으로 침몰하고 쉽게 인식을 용이하게한다. PBS에 고정되지 않은 유지하면 상대적으로 빠른 EAD 변화 형태를 해부. 20 ~ 30 분에 해부 시간을 제한합니다.
  3. 조직을 전송하려면, 코트 나머지 몸을 피펫 팅하여 P20의 마이크로 피펫 팁은 위아래로 여러 번 전기자. 큰 EAD / 두뇌 단지를 전송하려면, 가위로 P20의 마이크로 피펫 팁을 잘라.
    주 : 코팅 절차는 전송 중에 점착 및 해부 조직의 손실을 방지하기 위해 중요하다. P20 마이크로 피펫을 사용하면 원치 않는 한계 희석, 정착액 PBS 용액으로의 전달을 최소화한다.
    1. 면역 염색의 경우, 전송400 ㎕를 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 고정액으로 가득 0.5 ML 튜브로 EAD를 해부. 큰 EAD 1 ml의 PFA 1.5 ML 튜브를 사용하여 / 뇌 단지는 침입의 득점에 대한 의미.
      주의 : PFA는 매우 독성이다. 보호 장갑과 복을 착용 할 것. 피부, 눈 또는 점막과의 접촉을 피하십시오.
    2. RNA 분리를 들어 차가운 PBS로 가득 찬 새로운 유리 접시에 해부 EAD를 전송합니다. 샘플 오염을 최소화하기 위해, 링과 림프 땀샘에서 EAD를 청소 집게를 사용합니다.
    3. 집게 (도 2E)을 사용하여 상기 안테나 디스크 입 후크 사이의 접속을 절단하여 후크 입에서 EAD를 분리. RNA 분해 및 유전자 발현 유물을 방지하기 위해, 30 분에 해부 시간을 제한 할 수 있습니다. 7 단계로 진행합니다.
      참고 : 숙련 된 연구자가 애벌레 수집 및 세척에 필요한 30 분을 제외한 시간에 약 60 유충을 해부 할 수 있습니다. 총 RNA 수익률은 유전자형과 developmenta 사이에 다릅니다 EAD 크기에 따라 달라집니다리터 단계. 후반 세번째 령 유충 80-100 제어 EAD 쌍 해부 5-8 μg의 총 RNA를 생성한다.

4. 고정, 면역 염색 및 장착

  1. 실온에서 하향 경사하면서 25 분 동안 PFA의 정착액에 샘플을 수정합니다. 정착 시간은 조직 형태학 및 단백질의 항원 성 변화없이 60 분까지 연장 될 수있다.
  2. nutator를 사용하여 10 분 동안 세 번 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS) PBST로 정착 및 세척 샘플을 제거합니다. 각 세척 단계 (400 μL / 0.5 ML 튜브)에 대한 PBST의 충분한 양을 사용합니다.
    참고 : 고정 EAD / 뇌 복합체는 면역 염색을 필요로하지 않는 침입의 득점에 대한 의미. GFP 신호가 고정 된 후에도 계속 표시됩니다. 최종 해부를 위해 4.4 단계로 진행합니다.
    1. 면역 염색을 위해, 실온에서 교반과 함께 20 분 동안 (0.3 % BSA와 PBST) 블로킹 용액 200 μL의 블록 조직.
      1. 꼼꼼한으로 품어가볍게 흔들어 섞으면 진 항체를 4 ℃에서 밤새 블로킹 용액 100 ㎕로 희석 하였다. 권장 항체 희석 차 항체 데이터 시트 또는 게시 된 문헌을 참조하십시오.
        참고 : 차 항체 희석 최적화해야 할 수 있습니다.
      2. 부드럽게 어두운 4 ℃에서 하룻밤 동안 실온에서 2 시간 동안 진탕하면서 또는 PBST에서 5 ~ 10 분간 세척 이후, 형광 이차 항체로 염색 된 조직을 차단 용액으로 희석 하였다.
      3. 워시 샘플을 세 번 PBST에서 10 분.
  3. DAPI 염색 용액 500 μL와 PBST를 교체합니다. F - 굴지 레이블을 지정하려면, DAPI 염색 용액에 형광 염료를 결합 팔로이 딘을 추가합니다. 어둠 속에서 15 분 장동 후, PBST 10 분 동안 한 번 조직을 씻으십시오.
    주 : F 액틴 라벨링 DAPI 염색과 독립적으로 수행 될 수있다.
  4. 최종 해부 단계를 들면, 1 ml의 파이를 사용하여 PBS 채워진 유리 접시에 다시 조직을 전송pette. 입 후크를 클립 집게의 두 쌍을 사용.
    1. 분석을 방해 할 수 있습니다 자란 EAD로 광학 줄기를 절단하여 EAD에서 침입의 정량에 사용되는 뇌를 분리합니다.
  5. 객관적인 슬라이드에 장착 매체의 드롭 (A 22mm X 22mm의 coverslip에 15 μl를) 놓습니다. 집게 팁의 도움으로, 얇은 층으로 매체를 배포 할 수 있습니다. P20의 마이크로 피펫으로 장착 매체에 EAD, 뇌 또는 EAD / 두뇌 단지를 전송합니다.
  6. 조직을 배포하고 슬라이드에 VNC를 곧게 포셉의 조언, 텅스텐 막대를 사용합니다.
  7. 설치하는 동안 거품, 첫 번째 터치 한 설치 매체에 커버 슬립의 가장자리와 집게의 도움으로 장착 매체에 천천히 이하의 형성을 방지 할 수 있습니다. 커버 슬립의 가장자리 주위 초과 장착 매체를 흡수 닦아 필터 종이 또는 조직의 작은 조각을 사용합니다.
    참고 : DABCO / 폴리 (비닐 알코올) 4-88 설치 매체 굳어시간 내에서 4 ° C에서. 슬라이드는 4 ℃에서 달 동안 저장 될 수있다.

5. 공 촛점 이미징

  1. 20X, 40X 및 60X 오일 목표에 장착 된 공 초점 현미경을 사용하여 단일 공 촛점 섹션과 스택을 획득.
  2. 픽셀 포화를 방지합니다. 오프셋 화상 해상도, 레이저 입력 전력, 이득 프레임 평균화하는 Z 시리즈의 스텝 크기를 포함하여 동일한 이미지 포착 파라미터를 사용하여 상이한 유전자형 (21, 22) 사이의 픽셀 세기들의 비교를 허용하는 모든 유전자형에 대한 위치 설정을 유지한다.
    참고 : EAD / 두뇌 단지의 시각화를 들어, 최대 돌기를 생성하고 각각의 이웃 이미지 만들기. 최종 이미지 준비, 패널 조립 후 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 밝기와 대비를 조정합니다.

종양 침윤 6. 정량

  1. 종양 invasivenes의 다른 수준을 특성화하는 채점 시스템을 정의침윤의 공간적 패턴과 뇌 VNC에 확산 GFP 양성 세포의 양을 고려이야. 문서 (그림 3A)에 대한 평가 시트를 준비합니다.
  2. 마운트는 적어도 80 24mm X 50mm의 coverslip에 따라 장착 매체의 40 μl를 사용하여 하나의 슬라이드에 각각의 유전자형에 대한 손상 머리를 고정.
    1. 편견 득점을 허용하려면, 채점 절차는 편견되도록, 슬라이드를 익명화하는 중립적 인 파티를 부탁드립니다. 독립적으로 두 실험실 구성원 익명 처리 슬라이드를 평가합니다. 계산이 완료된 후에 만 ​​유전자형이 개시되어있다.
  3. GFP 필터 세트가 장착 된 형광 실체 현미경 아래에 장착 뇌의 블라인드 점수에 의해 악성 종양의 정도를 평가합니다. 이미 이중 계산 (그림 3B)를 방지하기 위해 본 한 두뇌에 라벨 마커를 사용합니다.
  4. 유전자형에 따라 정의 된 침습성 각 범주에 떨어지는 두뇌의 비율을 계산합니다. 통계들 결정ignificance 카이 제곱 테스트 (그림 3C)를 사용하여.

7. RNA 분리, DNase의 치료 및 품질 검사

참고 : 다음 단계에 사용 된 모든 시약 (솔루션, plasticware은)의 RNase 활동이 없어야합니다. 항상 장갑을 착용 및 유기 용제 작업 화학 후드를 사용합니다.

  1. 1.5 ml의 튜브에 코팅 된 P20의 마이크로 피펫 팁과 깨끗한 EAD를 전송합니다.
  2. 튜브의 바닥 조직 싱크하자, 조심스럽게 PBS를 제거하고 100 μl의 RNA 용해 시약 (최대 140 EAD에 대한 충분한)로 교체합니다.
  3. 텍싱에 의해를 Lyse 조직. 이 시점에서, 샘플을 액체 질소에 냉동 깊은 -80 ℃에서 보관하거나 직접 표준 RNA 분리 프로토콜을 사용하여 처리 될 수있다.
    참고 : 여러 해부 라운드에서 유사한 유전자형의 샘플 RNA 용해 시약에 한 번 풀 수 있습니다.
  4. RNA 용해 시약 0.9 ml의에 샘플 볼륨을 입력합니다. 클로로포름의 0.2 ML을 추가하고 vigoro 샘플을 혼합15 ~ 20 초 동안 usly.
  5. 실온에서 2 내지 3 분 인큐베이션 후, 4 ℃에서 15 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리.
  6. 상간을 방해하지 않고 새로운 튜브로 무색 위 수성 상을 포함하는 RNA를 전송합니다. 이 단백질과 게놈 DNA가 들어 있으므로 멀리 계면에서 그대로.
    주 : 회수 볼륨 균질화 사용 RNA 용해 시약의 부피의 약 60 %이어야한다.
  7. 이소 프로필 알코올 0.5ml를 첨가하여 RNA를 침전. 볼텍스하고 실온에서 10 분 동안 샘플을 배양한다.
  8. 4 ℃에서 15 분 동안 10,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
  9. 뜨는을 취소하고 75 % 에탄올 600 μL로 한 번 RNA 펠렛을 씻는다. 짧은 소용돌이와 원심 분리 (4 ℃에서 7 분간 10,000 XG) 후 모두 에탄올을 취소하고 5 ~ 10 분 깨끗한 조직 닦아에게에 오픈 튜브를 배치하기위한 RNA 펠릿 공기가 건조 할 수 있습니다.
    참고 : RNA 펠렛은 작은 불투명 / 화이트 성으로 볼 수 있습니다튜브 또는 눈에 보이지 않는 하단의 잘 익은. 나머지 에탄올 방울 신중 P10의 마이크로 피펫 팁으로 제거 할 수 있습니다.
  10. 피펫 팁을 몇 번 텍싱 또는 솔루션을 전달하여 DEPC 처리 된 물 50 μL의 RNA를 녹여.
  11. 게놈 DNA의 오염을 최소화하기 위해, DNase의 1 μL (2 U / μL) 및 DEPC 처리 된 물에 10 배의 DNase 완충액 10 μl를 함유하는 혼합물 50 μl를 첨가하여 전체 RNA의 DNase로 치료. 소용돌이와 스핀 다운.
  12. 수조 또는 30 내지 40 분 동안 가열 블럭에서 37 ℃에서 샘플을 인큐베이션. 배양 후, 각 샘플에 DEPC 처리 된 물 100 μl를 추가합니다.
  13. , DNase의에서 효소 활동하고 깨끗한 RNA를 비활성화 페놀의 200 μl를 추가하려면 : 4 ° C에서 7 분 동안 10,000 XG에서 1 분 원심 분리기에 대한 샘플 솔루션, 소용돌이 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (1 ~ 25 : 24).
  14. 조심스럽게 새로운 튜브에 RNA를 함유하는 상부 수 성상을 전송. 동일한 볼륨을 추가 (200 μL)클로로포름, 혼합 위에서 원심 분리 단계를 반복합니다.
  15. 신중 상부 상 모아서 3 M 아세트산 나트륨 1/10 부피를 첨가하여 RNA를 침전, pH가 5.2 100 % 에탄올 DEPC H 2 O 2.5 권으로 제조. 텍싱에 의해 철저하게 섞는다.
    참고 : 침전 믹스 0.5 μL 글리코겐 (20 μg의 / μl를) 추가는 RNA 펠렛을 시각화하는 데 도움이됩니다. 실리콘이 낮은 바인딩 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 사용하여, RNA의 손실을 최소화한다.
  16. 적어도 1 시간 동안 -20 ℃에서 RNA를 침전.
    참고 : 배양 밤새 수행 할 수 있습니다. 샘플뿐만 아니라 -80 ° C에 배치 될 수있다.
  17. 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 RNA. 세척하고 7.9의 기술에 다음과 같은 건조 펠렛.
  18. DEPC 처리 된 물 10 ~ 15 μL에서 RNA를 녹인다. -80 ° C에서 보관 RNA.
  19. 230 nm의, 260 nm의 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서 OD를 측정하여 RNA의 양과 순도를 결정합니다. RNA 공동 계산협약을 적용하여 ncentration 40 μg의 / ㎖ RNA와 동일한 nm의 260에서 1 OD 그.
    참고 :하는 A 230분의 260 비율은 2.0-2.2의 범위에 있어야하는 동안 "순수한"RNA의 280 분의 260 비율은 2.0 같습니다. 1.7와 2.0 사이는 A 260/280 비율 RNA 샘플은 cDNA 합성 등의 하류 어플리케이션에 적합하다. mRNA의 서열 - 라이브러리의 제조를위한 RNA의 질과 양을 자동 전기 시스템을 이용하여 확인한다. 28S / 18S 비율은 1.8 이상이어야합니다.

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Results

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초파리 EAD에 정의 된 유전자형 GFP 마크 패치를 생성하는 eyFLP-MARCM 기술의 가능성을 증명하기 위해, 클론의 세 가지 유형이 유도되었다 : 경우 1 제어 발현 GFP (2) 악성 종양이 작고의 종양 형태를 나타내는 종양 억제 유전자 낙서의 동형 접합 손실 (scrib 1)의 배경에서 G 단백질 라스 (라스 V12), (3) overgrowing하지만 비 침습적 라스 V12 scrib 1 JNK DN 클론의 6월-N 말단 키나제 (JNK)이 지배적 음성 형태 (그림 4, 유전자형 표 1)의 발현에 의해 불 활성화되었다. 라스 V12의 scrib 1 클론 종양의 침입이 JNK 신호 전...

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Discussion

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기술은 초파리의 유전 모자이크 분석 및 유전자 기능 (33)를 조작하기위한 가장 정교한 도구들이다 생성합니다. 그것은 눈이없는 증강 활성 9,18 인 조직에서, 즉, 공간적으로 제한된 방식으로 시각적으로 표시, 유 전적으로 정의 된 클론의 유도를 할 수 있습니다대로 eyFLP - MARCM 시스템은 강력하고 강력한 입증되었습니다. 여러 유전 적 병변이 동일한 셀에 결합 될 때 특히 중요하다. EAD 뇌 neuroepithelia로 제한 할 때이 매우 비정상적인 패치가 애벌레 개발을 허용하는 동안 열 충격 제어 FLP (hsFLP) 클론의 경우에서와 같이 애벌레 몸 전체에 흩어져 때, 그들은 치사의 원인이 될 수 있습니다. 중요한 것은, 플라이 EAD 상피 세포에서 클론의 유도 된 종양 유전자는 종양 억제의 손실과 결합 일부 인간 암의 출현과 고체 상피 종양의 진행을 되풀이되었습니다 활성화. 호Wever에게, 시스템은 간단하게 설명한다 한계를...

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Disclosures

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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우리는 블루밍턴 스톡 센터(미국 블루밍턴), 더크 보만(Dirk Bohmann), 카티야 브뤼크너(Katja Brückner), 이스트반 안도(Istvan Ando)에게 플라이 스톡과 항체에 대해 감사를 표합니다. 원고에 대한 의견을 제시해 주신 Marek Jindra와 Colin Donohoe에게 감사드립니다. 이 연구는 알렉산더 폰 훔볼트 재단(Alexander von Humboldt Foundation)이 수여하는 Sofja Kovalevskaja Award to M.U.와 독일 연구 재단(German Research Foundation)이 수여하는 DFG 프로젝트 UH243/1-1 to M.U.의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
한천Gewü rzmü hle Brecht, Eggenstein, Germany00262-0500플라이 푸드 레시피: 한천 20g, 효모 360g, 콩가루 200g, 노란 옥수수 가루 200kg, 맥아 추출물 1.6kg, 가벼운 옥수수 시럽 300ml, 프로피온산 130ml, 15% 니파진 200ml로 플라이 푸드 200L를 준비합니다. 플라이 푸드는 85 에서 1시간 동안 조리해야 합니다. °C입니다.
옥수수 시럽Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany01939
Propionic acidCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany6026.1
CornmealReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany4010155063948
맥아 추출물CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany728985
Soy flourStockmeier Food GmbH, Herford, Germany1000246441010
YeastWerner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany210099K
메틸-4-벤조에이트/ 니파진Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyH550170%
EtOH Drosophila fly food vialsKisker Biotech, Steinfurt, Germany789008
Vial plugsK-TK e.K., Retzstadt, Germany1002
Drosophila fly food bottlesGreiner Bio-One, Frickenhausen, 독일960177
Bottle plugsK-TK e.K., Retzstadt, Germany1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]nSigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany81381장착 매체 레시피: 6 g 폴리(비닐 알코올) 4-88을 39  ml 밀리포어 H2O, 6ml 1M 트리스(pH 8.5) 및 12.5ml 글리세롤. 50 에서 밤새 저어줍니다. &데그; C 및 원심분리기 20  5,000rpm에서 최소. DABCO를 상등액에 첨가하여 최종 농도 2.5%를 얻습니다. 부분 표본을 -20 에 저장하십시오. °C입니다.
1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄/ DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen, 독일D2522
Triton X-100Sigma-Aldrich, Deisenhofen, 독일9002-93-1
인산염 완충 식염수/ PBS137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 및 1.8 mM KH2PO4, Millipore H2O
PBST0.1% Triton X-100에서 PBS
파라포름알데히드/ PFASigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany1581274% PFA 고정 레시피: 용해 4  80 ml Millipore H2O에 있는 g PFA를 55 로 가열된 자석 교반기 플레이트에 올려 놓음; °C. 모든 PFA 입자가 용해될 때까지 1M NaOH를 적가합니다. 10 ml의 10x PBS를 추가하고 1 M HCl을 가진 7.4에 pH를 조정하십시오. 100 µ에 있는 섞으십시오; l 트리톤 X-100은 Millipore H2O를 100ml까지 채웁니다. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오. 반복적인 해동을 피하십시오. (주의: PFA는 독성이 강합니다. 흄 후드에 PFA 정착제를 준비합니다. 자급식 호흡 장치, 장갑 및 의복을 착용하십시오. 피부, 눈 또는 점막과의 접촉을 피하십시오.)
소 혈청 알부민 / BSASigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyA3059차단 용액 레시피 : 0.3 % BSA를 PBST
형광 표지 팔로이딘Invitrogen, Karlsruhe, Germany, 분자 프로브A12379, A22283, A22284팔로이딘 원액 : 1.5ml 메탄올에 분말 (300U)을 용해시킵니다. -20 °C에서 보관하십시오. 염색의 경우 PBST에서 1:250(A12379, A22283) 및 1:100(A22284)을 희석하여 사용합니다.
4',6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPICarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany6335DAPI 염색 용액: Millipore H2O에 5mg/ml의 원액을 준비하고 4°C에서 부분 표본을 보관합니다. PBST에서 1:1,000 희석에 사용됩니다.
마우스 anti-H2 항체Kurucz et al., 2003희석 1:500에 사용
ImmunoResearch, Suffolk, UK715-175-151차단 용액에서 희석 1:500에 사용
Dumont #5 forcepsFine Science Tools, Heidelberg, Germany11295-10
유리 배아 접시 (30  mm)Thermo Scientific, Schwerte, GermanyE90
텅스텐 바늘Fine Science Tools, Heidelberg, Germany10130-20
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools, Heidelberg, Germany26018-17
Microscope slidesVWR, Darmstadt, Germany631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)VWR, 다름슈타트, 독일631-1336
커버슬립 24 x 50 mm (0.13-0.16  mm)Thermo Scientific, Schwerte, Germany1076371
Kimtech Science Precision WipesThermo Scientific, Schwerte, Germany06-677-70
Dissecting stereomicroscopeOlympus, Hamburg, GermanySZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
형광 실체현미경Olympus, Hamburg, GermanySZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD cameraGFP의 여기용 좁은 청색 대역통과 필터 세트, 다른 청색 흥분성 형광 색소(여기 필터 BP460-480 nm, 배리어 필터 BA495-540 nm) 및 RFP 및 기타 녹색 흥분성 형광 색소용 좁은 녹색 여기 및 장역 통과 배리어 필터(여기 필터 BP530-550, 배리어 필터 BA575IF). 소프트웨어: 올림푸스 cellSens Standard 1.11.
컨포칼 현미경Olympus, 함부르크, 독일FV1000도립 IX81 현미경 장착. 목적: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) 및 60× UPlanApo(NA 1.35). 레이저: UV 레이저 다이오드 LD405 (50  mW), 아르곤 레이저, 다중 라인 457/(476)/ 488/515 (40  mW), 노란색/녹색 레이저 다이오드 LD560 (15  mW) 및 적색 레이저 다이오드 635(20  mW)입니다. 소프트웨어: Fluoview 2.1c 소프트웨어
초파리 냉각 인큐베이터Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany  Sanyo MIR553
Squirt bottleVWR, 다름슈타트, 독일215-8105
BD Clay Adams Nutator MixerVWR, 다름슈타트, 독일15172-203
ELMI Digital Rocking ShakerVWR, 다름슈타트, 독일DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis ReagentVWR, 다름슈타트, 독일2302700이 프로토콜은 다른 TRIzol 기반 시약, e.e., Sigma의 TRIreagent(Cat. Nr.T9424), Thermofisher의 TRIzol 시약(Cat. Nr. 15596).
디에틸 피로카보네이트/ DEPCSigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyD5758Millipore H2O에 DEPC 1:1,000을 희석하고 밤새 저어주고 오토클레이브합니다.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany15593-031
클로로포름Merck, 다름슈타트, 독일102445
TURBO DNase (2 U/µ l)Thermo Scientific, Schwerte, GermanyAM2238
Invitrogen UltraPure GlycogenThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany10-814-010
Sodium acetate trihydrateVWR, Darmstadt, Germany27652.232DEPC-H2O로 3M 아세트산 나트륨 용액을 준비하고 pH를 5.2로 조정합니다.
2-PropanolMerck, Darmstadt, Germany
EthanolMerck, 독일 다름슈타트100983DEPC-H2O로 75% EtOH 희석액을 준비합니다.
UV/Vis-Spectrophotometer NanoDrop ND-8000Thermo Scientific, Schwerte, GermanyND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)Thermo Scientific, Schwerte, Germany5417R
Experion RNA StdSens Analysis KitBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일7007103
Experion Automated Electrophoresis StationBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일7007010
SuperScript III Reverse TranscriptaseThermo Scientific, Schwerte, Germany18080044
Oligo d(T) PrimerIntegrated DNA Technologies, Leuven, BelgiumPrepare 100 µ M 재고 솔루션은 DEPC-H2O에 보관하고 -20°C에 보관합니다. C
dNTP MixtureTakara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France403025 µ의 매장 분취량; -20°에서 l; C
CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일1855195
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germany170-8882
하드 쉘 PCR 플레이트 96-well, 얇은 벽Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일HSP9601
Microseal 'B' FilmBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일MSB1001
rp49 Forward primerIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgium5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Reverse primerIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgium5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Forward primerIntegrated DNA Technologies, 루벤, 벨기에5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 리버스 프라이머통합 DNA 기술, 루벤, 벨기에5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'
차단 용액 Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)에서 Jackson 109634

References

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