그만큼 초파리 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

요약

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

Drosophila melanogaster는 전체 유기체의 맥락에서 종양 발달 및 진행에 대한 기능적 및 기계론적 연구를 위한 강력한 실험 시스템으로 부상했습니다. 유전자 모자이크를 생성하는 정교한 기술은 정상 조직으로 둘러싸인 시각적으로 표시되고 유전적으로 정의된 클론의 유도를 용이하게 합니다. 클론은 다양한 분자, 세포 및 오믹스 접근 방식을 통해 분석할 수 있습니다. 이 연구는 MARCM(Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker) 기술을 사용하여 초파리 유충의 눈/더듬이 상상 디스크(EAD)에서 다양한 악성 종양의 형광 표지된 클론 종양을 생성하는 방법을 설명합니다. 유충에서 모자이크 EAD 및 뇌를 회수하는 방법과 형광 형질전환 리포터의 동시 이미징 및 항체 염색을 위해 처리하는 방법을 설명합니다. 모자이크 조직의 분자 특성화를 용이하게 하기 위해 EAD에서 전체 RNA를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 해부 절차는 모든 유충 단계에서 EAD와 뇌를 회복하는 데 적합합니다. 상상 디스크에 대한 고정 및 염색 프로토콜은 초파리 단백질을 인식하는 여러 형질전환 리포터 및 항체와 함께 작동합니다. RNA 분리를 위한 프로토콜은 다양한 유충 기관, 전체 유충 및 성충 파리에 적용할 수 있습니다. Total RNA는 후보 물질 또는 게놈 전체 접근법을 사용하여 유전자 발현 변화를 프로파일링하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 클론 종양의 침습성을 정량화하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 사용이 제한되어 있지만 기본 개념은 인지 편향을 피해야 하는 다른 정량적 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

서론

암 발생률과 사망률을 극적으로 전 세계적으로, 특히 노인들 사이에서 증가하고 질병의 가장 유 전적으로 이질적인 그룹 중 하나를 나타냅니다. 암은 고유의 종양 억제 메커니즘을 탈출하고 통제 분할하는 종양 시작 세포에서 클론 적 기인한다. 죽음과 분화를 억제하면서 협력 적 성장, 증식과 운동성을 촉진 유전자 병변의 점진적 축적은 매우 악성 전이성 치명적인 종양으로 초기 양성과 성장을 변환합니다. 이것은 유전 적 변형에 더하여, 종양 진행이 미세 환경에서 복수 종양 세포 유형 (예를 들어, 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 사이의 주변의 스트로마 및 크로스 토크의 변화를 필요로한다는 증거가되고있다. 종양 기질 상호 작용을 포함하여 악성 변환을 기본 분자 원리를 이해하는 것은 예방하기 개발에 매우 ​​중요하다기 및 조기 검진 전략뿐만 아니라 새롭고 효과적인 치료법은 암 전이 및 약물 내성을 방지한다.

과일 초파리 비행은 빠른 생성 시간 때문에 암 연구 ^1-4위한 매력적인 시스템이되었다, 파리와 인간의 거의 모든 유전자의 조작을 용이하게 고급 유전자 도구의 제한으로 유전자 중복과 부 사이의 노드 신호의 놀라운 보존 일시적으로 공간적으로 제한 방법. 다양한 악성 종양 유전자 정의 재현성 MARCM....

프로토콜

참고 :이 작업은 eyFLP1을 활용; 행동> Y ^+> GAL4, UAS-GFP; FRT82B, 욕조 - Gal80 MARCM 82B 그린 테스터 라인 ^(11). 같은 w 같은 계통의 남성에 MARCM 82B 그린 테스터 처녀를 넘어; UAS-A; ^{UAS-B의 RNAi,} FRT82B C의 ^{MUT 유전자형은} 유사 분열 재조합이 3 ^번째 상동 염색체의 오른쪽 팔 사이에 발생하는 자손을 얻을 것입니다. 이러한 방식으로, FRT82B 사이트 원위 위치 유전자 C의 클론 동형 접합 돌연변이는 EAD 뇌 neuroepithelium 내에서 발생한다. 이 클론 유전자 B (그림 1A)에 대한 GFP, 유전자 A와 dsRNA를 표현합니다. 는 X, 2L, 2R, 3L 및 3R에 재결합을위한 다양한 eyFLP-MARCM 테스터 라인을 설립하고, 비행 지역 사회 내에서 사용할 수있다.

1. 플라이 처리, 십자가, 및 준비

1. 여러 보을 채워 실온에서 해당 MARCM 테스터 재고를 확장동시에 ttles. 충분한 처녀가 후속 십자가 수집 할 수 있도록 2-3 ....

결과

초파리 EAD에 정의 된 유전자형 GFP 마크 패치를 생성하는 eyFLP-MARCM 기술의 가능성을 증명하기 위해, 클론의 세 가지 유형이 유도되었다 : 경우 1 제어 발현 GFP (2) 악성 종양이 작고의 종양 형태를 나타내는 종양 억제 유전자 낙서의 동형 접합 손실 (scrib ^1)의 배경에서 G 단백질 라스 (라스 ^V12), (3) overgrowing하지만 비 침습적 라스 ^V12 scrib ¹ JNK ^{DN 클론의} 6월-N 말단 키나제 (JNK)이 지배적 음성 형태 (그림 4, 유전자형 표 1)의 발현에 의해 불 활성화되었다. 라스 ^V12의 scrib ¹ 클론 종양의 침입이 JNK 신호 전.......

토론

기술은 초파리의 유전 모자이크 분석 및 유전자 기능 ^(33)를 조작하기위한 가장 정교한 도구들이다 생성합니다. 그것은 눈이없는 증강 활성 ^9,18 인 조직에서, 즉, 공간적으로 제한된 방식으로 시각적으로 표시, 유 전적으로 정의 된 클론의 유도를 할 수 있습니다대로 eyFLP - MARCM 시스템은 강력하고 강력한 입증되었습니다. 여러 유전 적 병변이 동일한 셀에 결합 될 때 특히 중요하다. EAD 뇌 neuroepithelia로 제한 할 때이 매우 비정상적인 패치가 애벌레 개발을 허용하는 동안 열 충격 제어 FLP (hsFLP) 클론의 경우에서와 같이 애벌레 몸 전체에 흩어져 때, 그들은 치사의 원인이 될 수 있습니다. 중요한 것은, 플라이 EAD 상피 세포에서 클론의 유도 된 종양 유전자는 종양 억제의 손실과 결합 일부 인간 암의 출현과 고체 상피 종양의 진행을 되풀이되었습니다 활성화. 호Wever에게, 시스템은 간단하게 설명한다 한계를.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천	Gewü rzmü hle Brecht, Eggenstein, Germany	00262-0500	플라이 푸드 레시피: 한천 20g, 효모 360g, 콩가루 200g, 노란 옥수수 가루 200kg, 맥아 추출물 1.6kg, 가벼운 옥수수 시럽 300ml, 프로피온산 130ml, 15% 니파진 200ml로 플라이 푸드 200L를 준비합니다. 플라이 푸드는 85 에서 1시간 동안 조리해야 합니다. °C입니다.
옥수수 시럽	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany	01939
Propionic acid	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany	4010155063948
맥아 추출물	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany	728985
Soy flour	Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany	1000246441010
Yeast	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany	210099K
메틸-4-벤조에이트/ 니파진	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	H5501	70%
EtOH Drosophila fly food vials	Kisker Biotech, Steinfurt, Germany	789008
Vial plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002
Drosophila fly food bottles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, 독일	960177
Bottle plugs	K-TK e.K., Retzstadt, Germany	1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	81381	장착 매체 레시피: 6 g 폴리(비닐 알코올) 4-88을 39  ml 밀리포어 H2O, 6ml 1M 트리스(pH 8.5) 및 12.5ml 글리세롤. 50 에서 밤새 저어줍니다. &데그; C 및 원심분리기 20  5,000rpm에서 최소. DABCO를 상등액에 첨가하여 최종 농도 2.5%를 얻습니다. 부분 표본을 -20 에 저장하십시오. °C입니다.
1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, 독일	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, 독일	9002-93-1
인산염 완충 식염수/ PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 및 1.8 mM KH2PO4, Millipore H2O
PBST			0.1% Triton X-100에서 PBS
파라포름알데히드/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	158127	4% PFA 고정 레시피: 용해 4  80 ml Millipore H2O에 있는 g PFA를 55 로 가열된 자석 교반기 플레이트에 올려 놓음; °C. 모든 PFA 입자가 용해될 때까지 1M NaOH를 적가합니다. 10 ml의 10x PBS를 추가하고 1 M HCl을 가진 7.4에 pH를 조정하십시오. 100 µ에 있는 섞으십시오; l 트리톤 X-100은 Millipore H2O를 100ml까지 채웁니다. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오. 반복적인 해동을 피하십시오. (주의: PFA는 독성이 강합니다. 흄 후드에 PFA 정착제를 준비합니다. 자급식 호흡 장치, 장갑 및 의복을 착용하십시오. 피부, 눈 또는 점막과의 접촉을 피하십시오.)
소 혈청 알부민 / BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	A3059	차단 용액 레시피 : 0.3 % BSA를 PBST
형광 표지 팔로이딘	Invitrogen, Karlsruhe, Germany, 분자 프로브	A12379, A22283, A22284	팔로이딘 원액 : 1.5ml 메탄올에 분말 (300U)을 용해시킵니다. -20 °C에서 보관하십시오. 염색의 경우 PBST에서 1:250(A12379, A22283) 및 1:100(A22284)을 희석하여 사용합니다.
4',6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335	DAPI 염색 용액: Millipore H2O에 5mg/ml의 원액을 준비하고 4°C에서 부분 표본을 보관합니다. PBST에서 1:1,000 희석에 사용됩니다.
마우스 anti-H2 항체	Kurucz et al., 2003		희석 1:500에 사용
	ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	차단 용액에서 희석 1:500에 사용
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11295-10
유리 배아 접시 (30  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	E90
텅스텐 바늘	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	10130-20
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	26018-17
Microscope slides	VWR, Darmstadt, Germany	631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)	VWR, 다름슈타트, 독일	631-1336
커버슬립 24 x 50 mm (0.13-0.16  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	06-677-70
Dissecting stereomicroscope	Olympus, Hamburg, Germany	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
형광 실체현미경	Olympus, Hamburg, Germany	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera	GFP의 여기용 좁은 청색 대역통과 필터 세트, 다른 청색 흥분성 형광 색소(여기 필터 BP460-480 nm, 배리어 필터 BA495-540 nm) 및 RFP 및 기타 녹색 흥분성 형광 색소용 좁은 녹색 여기 및 장역 통과 배리어 필터(여기 필터 BP530-550, 배리어 필터 BA575IF). 소프트웨어: 올림푸스 cellSens Standard 1.11.
컨포칼 현미경	Olympus, 함부르크, 독일	FV1000	도립 IX81 현미경 장착. 목적: 20× UPlan S-Apo (NA 0.85), 40× UPlanFL (NA 1.30) 및 60× UPlanApo(NA 1.35). 레이저: UV 레이저 다이오드 LD405 (50  mW), 아르곤 레이저, 다중 라인 457/(476)/ 488/515 (40  mW), 노란색/녹색 레이저 다이오드 LD560 (15  mW) 및 적색 레이저 다이오드 635(20  mW)입니다. 소프트웨어: Fluoview 2.1c 소프트웨어
초파리 냉각 인큐베이터	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany	Sanyo MIR553
Squirt bottle	VWR, 다름슈타트, 독일	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, 다름슈타트, 독일	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, 다름슈타트, 독일	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, 다름슈타트, 독일	2302700	이 프로토콜은 다른 TRIzol 기반 시약, e.e., Sigma의 TRIreagent(Cat. Nr.T9424), Thermofisher의 TRIzol 시약(Cat. Nr. 15596).
디에틸 피로카보네이트/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany	D5758	Millipore H2O에 DEPC 1:1,000을 희석하고 밤새 저어주고 오토클레이브합니다.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15593-031
클로로포름	Merck, 다름슈타트, 독일	102445
TURBO DNase (2 U/µ l)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany	10-814-010
Sodium acetate trihydrate	VWR, Darmstadt, Germany	27652.232	DEPC-H2O로 3M 아세트산 나트륨 용액을 준비하고 pH를 5.2로 조정합니다.
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Germany
Ethanol	Merck, 독일 다름슈타트	100983	DEPC-H2O로 75% EtOH 희석액을 준비합니다.
UV/Vis-Spectrophotometer NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	ND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일	7007103
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일	7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		Prepare 100 µ M 재고 솔루션은 DEPC-H2O에 보관하고 -20°C에 보관합니다. C
dNTP Mixture	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France	4030	25 µ의 매장 분취량; -20°에서 l; C
CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Germany	170-8882
하드 쉘 PCR 플레이트 96-well, 얇은 벽	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, 독일	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, 루벤, 벨기에		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 리버스 프라이머	통합 DNA 기술, 루벤, 벨기에		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'