방법 논문

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

DOI:

10.3791/54587

⸱

2016년 10월 23일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그 변종 널리 단백질 현지화 및 세포 골격 리모델링 및 살아있는 세포에서 소포 인신 매매 등의 이벤트의 역학을 공부하는 도구를 사용합니다. 키메라 GFP 융합을 사용하여 정량 방법은 많은 응용을 위해 개발되었다; 그러나, GFP는 단백질 분해에 어느 정도 내성 때문에 그 형광은 세포 내 이입 경로에화물 인신 매매의 정량을 방해 할 수있는 리소좀 / 공포에 계속. 이입 및 사후 이입 피킹 이벤트를 정량화하기위한 다른 방법은 superecliptic pHluorin 산성 환경에서 켄칭 GFP의 pH 민감성 변이체를 사용한다. multivesicular 기관 (MVBs)와 리소좀 / 공포 루멘에 전달하기로화물 통합에 따라 형광의 감쇠에 횡단화물 단백질 결과의 세포질 꼬리에 pHluorin의 키메라 융합. 따라서, 액포 형광의 담금질은 quantifi을 용이하게엔도 시토 시스와 세포 내 이입 경로에 이른 사건의 양이온. 이 논문은 형광 현미경을 통해 세포 내 이입의 정량 pHluorin 태그가화물을 사용하는 방법뿐만 아니라 유동 세포 계측법 사용 인구 기반의 분석에 대해 설명합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

소포 피킹은 진핵 세포 내의 소기관 신원 및 기능을 유지하는 데 중요한 역할을하고, 각각의 세포 구획 막 단백질 및 조성물을 조절하기위한 중요한 메커니즘이다. 이입을 통해 생성 소체 후속 재활용 또는 리소좀 타겟팅에 대한 표면으로부터 막 단백질을 제거하는 반면 세포막에서 exocytic 소포 융합은 세포 표면 단백질 및 새로운 막을 제공한다. 따라서, 엔도 시토 시스는 영양 흡수 및 세포 외 환경에 대한 응답 중요하다. 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스는 세포막 표면적을 조절하기 위해, 손상된 단백질의 회전율을 균형있게된다.

효모 및 포유 동물 세포의 연구는 다양한 EN에 응답하여 세포 내 이입에 관련된 단백질의 대량뿐만 아니라 특정화물의 내재화를 촉진 여러 세포 내 이입 경로 또는 행위를 식별 한vironmental 조건. 가장 공부 경로는 클라과 세포질 액세서리 단백질이 초기 세포 내 이입 소포를 안정화 코트 구조로 조립하는 클라 매개 엔도 시토 시스 (CME)입니다. 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에의 실험 역학 및 많은 세포 내 이입 단백질 1-3 모집의 순서로 키 통찰력을 굴복했다. 특히, CME 기계가 매우 진화를 통해 보존되는 효모에서 CME 관련 단백질의 대부분은 인간 orthologs을 가지고; 따라서, 효모 신진 높은 진핵 생물에 보존되어 엔도 시토 시스의 메커니즘을 이해하기위한 중요한 도구가되고있다. 예를 들어, 출아 효모를 사용하는 연구가 추가로 세포 내 이입 액세서리 채용 하였다 CME 구조의 형성과 성숙 (효모 등 피질 액틴 패치 라 함) 클라화물 결합 어댑터 단백질부터 시작하여, 많은 단백질의 연속 채용 관련 결정 단백질,Arp2 / 3 매개 액틴의 중합의 활성화 및 소포 절단 1,2에 관여하는 단백질의 모집. 굴지 패치를 대뇌 피질하기 CME 기계 단백질의 모집은 높은 주문하고 진부한 과정, 많은 단백질 모집의 정확한 순서는 CME 기계의 다른 구성 요소에 대한 설립되었습니다. 중요한 것은, 최근의 연구는 포유 동물 세포 4 클라 코팅 된 구덩이에서 CME의 단백질을 모집 비슷한 순서를 확인했다.

CME 외에도 여러 종류의 세포는 세포막 5-7에서 소포 형성 및 내재화를 촉진하는 다른 메커니즘에 의존하는 하나 이상의 독립적 인 클라 세포 내 이입 (CIE) 경로를 갖는다. 효모, 우리는 최근에 작은는 GTPase Rho1 및 활성화 구아닌 염기 교환 계수 (GEF), ROM1 8,9을 활용하는 CIE 경로를 확인했다. Rho1은 액틴의 중합 (1)를 홍보하기 위해 formin Bni1를 활성화효모 12 클라 독립적 인 세포 내 이입이 양식에 필요한 0,11. 또한, 단백질의 α-아레스 가족은 유비퀴틴 리가 Rsp5은 CME 13-17을 통해화물 유비퀴틴 이후의 국제화를 촉진하고, 또한 CIE (18)에 관여하는 단백질과 가능성 직접적인 상호 작용을 통해 CIE 경로를 통해화물의 국제화를 촉진하기 위해 모집. CIE의 다양한 경로는 또한 Rho1의 ortholog, 9,19-에서 RhoA 의존 클라 독립적 식세포 경로를 포함한 포유 동물 세포에 존재한다. 포유 동물 CIE에서에서 RhoA의 역할은 제대로 이해된다; 따라서, 신진 효모의 연구는 포유류 CIE에 적용 할 수있는 추가 기계적인 통찰력을 제공 할 수있다.

세포 내 이입 사건의 정확한 정량화는 엔도 시토 시스를 조절하는 특정 단백질의 역할에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있으며,화물 내재화 또는 progressio에 돌연변이의 효과를 밝힐 수세포 내 이입 경로를 통해 N. 이를 위하여, 생화학 적 방법은 리간드 흡수를 모니터링하거나 세포 내 이입화물 단백질의 분해 속도를 측정하기 위해 이용 될 수있다. 살아있는 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP)과이자의화물에 그 변종의 융합은화물 운송의 직접 시각화 할 수 있습니다. GFP는 (효모 또는 공포) 리소좀에서 분해에 내성이 있기 때문에, GFP - 태그화물은 엔도 시토 시스의 정량 사용이 제한됩니다. 또한, GFP의 형광은 pH의 변화에 부분적으로 만 구분하며 20, 21 루멘 액포 내에서 검출 남아있다. 그 결과, GFP 태그 형광화물의 나머지가 저하되었으며,화물 강도 전체 셀 기반 정량 인해 액포 장기 GFP 형광에 부정확 할 수 오랜 후에 액포에 계속.

액포의 GFP 형광의 단점을 극복하기 위해, 우리는 이전 superecliptic pH를 사용했다luorin, 중성 pH에서 밝은 형광 있지만, 이러한 20,22,23 리소좀 액포 /의 루멘으로 산성 환경에서 형광을 상실 GFP의 pH에 민감한 변형. 세포 내 이입화물의 세포질 꼬리에 pHluorin 태그를 배치하면 세포막에와 pHluorin 태그가 세포질 (그림 1A)에 노출 된 상태로 유지 초기 엔도 좀,에화물의 시각화를 허용합니다. 초기 엔도 좀은 엔도 좀의 루멘에 꽃 봉오리 소포로 전송 (ESCRT) 기계 패키지 표면 지역화 된화물에 필요한 엔도 좀 정렬 복잡하고, 생성 multivesicular 기관 (MVBs) (24)를 성숙. 내부 MVB 소체에 포함 된화물의 경우, pHluorin 태그 소포 루멘을 향. 내부 MVB 소체는 산성화; 그들은 MVBs (20)에 성숙하여, pHluorin 태그가화물 초기 엔도 좀의 형광을 잃게됩니다. 액포와 MVB의 후속 융합은 MVB의 내강 내용을 제공합니다열화 및 pHluorin 태그는 액포 루멘의 산성 환경에서 급냉 유지.

이 논문은 효모의 세포질 pHluorin 태그로화물을 이용하여 정량적 인 세포 내 이입 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. pHluorin 태깅화물을 발현 균주 특정화물의 특성 및 피킹 동작에 따라, 운동 및 / 또는 엔드 포인트 분석에 사용될 수있다. 또한, 일부 pHluorin 태그가화물은 유동 세포 계측법을 포함하여 높은 처리량 분석 방법, 의무가 있습니다. 중요한 것은, pHluorin 태그는, 살아있는 세포에서 세포 내 이입 이벤트 공부 이입 및 야생형 및 돌연변이 균주에서 세포 내 이입 함수의 비교의 정량을 허용하는 다용도 공구이다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 솔루션 및 미디어

  1. 뒤에 오는 주식, 미디어 및 플레이트를 준비합니다 :
    1. 배 YNB을 준비하기 위해 물 1 L의 아미노산이 부족한 효모 질소 염기 67g을 용해. 0.22 ㎛의 니트로 셀룰로오스 필터를 통해 여과하여 멸균.
    2. 2 (V의 재고 / w 멸균 50 %)에서 % 덱 스트로스와 1X 아미노산 / 영양 혼합물 (10 배 재고에서) 1 배 YNB를 사용하여 YNB 매체를 준비합니다 (100 × 재고에서, 단계 1.1.4 참조). 필요한 플라스미드 선택 개별 아미노산 또는 영양분을 생략합니다. Mup1 발현 유도 추가적으로 아미노산 / 영양 혼합물로부터 메티오닌 생략.
    3. (V의 재고 / w 멸균 50 %에서) (10 배 재고에서) 1 배 YNB를 사용하여 YNB 판, 2 % 덱 스트로스를 준비, 0.7 g / L의 아미노산 / 영양 혼합물 (단계 1.1.5 참조)와 2.5 % 한천. 한천 25 g 및 물 860 ml의 당 아미노산 / 영양 혼합물의 0.7 g을 고온 가압 멸균하여 평판 배지를 준비합니다. ml의 오 혼합물을 100 배 YNB ml의 40을 한 후, 55 ° C로 냉각 추가 할 수 있습니다F 50 % 포도당. 플레이트 (10cm 접시 당 매체의 30 ml)에 붓고 매체가 실온에서 고화하는 것을 허용하고, 가기 판 4 ℃에서.
    4. 탈 이온수 100ml에 다음 용해 (액체 매체 용) 100X 아미노산 / 영양 스톡 용액을 제조 하였다 : 0.1 g의 L-메티오닌 0.3 g L 류신 및 L- 리신 0.2 g L 히스티딘 각각마다 , L- 트립토판, 아데닌 및 우라실이 (특정 균주에 필요한 다른 아미노산 및 영양소가 포함될 수도있다). 용해 필요한 경우 부드러운 열을 사용하여 0.45 μm의 니트로 셀룰로오스 필터를 통해 살균. 빛으로부터 보호 실온에서 보관하십시오. 플라스미드의 선택을 위해 필요에 따라 특정 구성 요소가 결여 원액을 준비한다.
    5. 조합함으로써 아미노산 / (플레이트) 영양 혼합물을 제조 다음 아데닌 0.5 g, L- 루신 4 g, 2 g L 히스티딘, L- 라이신, L- 메티오닌, L- 트립토판 각각 L- 티로신 및 우라실. 박격포와 유 봉으로 갈기, 그리고 프로로 저장빛에서 tection. 플라스미드의 선택을 위해 필요에 따라 특정 구성 요소가없는 이들의 혼합물을 제조하고, 평판 배지 (단계 1.1.3 참조) 리터당 아미노산 혼합물 0.7 g을 사용한다.
  2. 콘 카나 발린의 A (ConA에)와 슬라이드의 표면을 코팅하여 현미경 8 웰 챔버 슬라이드를 준비한다. 챔버 슬라이드의 각 웰에, 물에 용해 2 ㎎ / ㎖ ConA에 25 μl를 추가합니다. 피펫 팁을 사용하여, 웰의 바닥면에 걸쳐 ConA에 확산하고, 적어도 4-8 시간 동안 실온에서 공기 건조에 슬라이드 가능. 이상적으로, ConA에 코팅의 24 시간 내에 챔버 슬라이드를 사용합니다.
  3. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 등 Longtine에 기술 기반 통합 방법을 사용하여 관심의 세포 내 이입화물에 GFP 또는 pHluorin의 프레임 내 융합체와 효모 균주를 생성한다. 그리고 골드 스타와 McCusker 25, 26.
    참고 : pHluorin는 저항 카나마이신에 대한 유전자 (KANMX6) 및 nourseothricin와 카세트 태그를 포함하는 플라스미드 ( NATMX4)는 이전 20 설명했다.
    1. 게놈 통합 20,25의 사이트에 고유의 추가 서열을 포함하는 프라이머와 선택 마커를 포함하는 GFP 또는 pHluorin 카세트를 증폭.
    2. 리튬 아세테이트 방법 (27)를 사용하여 원하는 효모 균주에 생성 된 PCR 생성물을 변형.
    3. 적절한 약물을 함유 YPD 접시에 세포를 성장시켜 카세트의 통합을 선택합니다. 플레이트, 오토 클레이브 10g 효모 추출물 20 g 펩톤 0.1 g 트립토판 및 960 ml의 물에 25g의 한천을 준비합니다. 플레이트 쏟아지는 전에 혼합 후 글루코스 KANMX6 선택 200 ㎍ / ml의 최종 농도 G418하거나, nourseothricin 100 ㎍ / ml의 최종 농도로 40 ml의 50 %를 넣고 55 ℃로 냉각되도록 NATMX4를 선택합니다.
    4. PCR에 의해 개별 식민지에서 GFP 또는 pHluorin 태그의 통합을 확인 및 / 또는 방지 GFP 항체를 사용하여 웨스턴 블로 팅,뿐만 아니라, 형광 현미경 (20)에 의해 태그 된 단백질의 검출에 의해.
      주 : 특정 효모 균주를 본 연구에 사용 된 플라스미드를 각각 표 1 및 표 2에 열거되어있다.

구조적으로 내면화 세포 내 이입화물의 정상 상태 형광 2. 엔드 포인트 분석

  1. (해당하는 경우) 플라스미드 유지 보수에 필요한 아미노산이나 영양소를 부족 YNB 배지 5 ml의 세포 (~ 3 작은 식민지를) 접종. 250 rpm으로는 진탕, 30 ° C에서 궤도 진탕 배양기에서 16 ~ 24 시간 동안 세포를 성장. 또한, 아미노산 또는 플라스미드 선택을위한 영양분을, 부족한 YNB 판 상 세포의 행진 a를 ~ 1-2mm 식민지 30 ° C에서 하룻밤 세포를 성장.
  2. 분광 광도계를 이용하여 각각의 하룻밤 배양 밀도 (OD 600)를 측정한다. 놀이터 용 아미노산 또는 영양분을 부족 YNB 배지에서 0.35-0.4 OD 600 / ㎖에서 5 ml의 희석을 준비합니다SMID의 유지 보수 및 진탕 30 ° C에서 약 3 시간 동안 성장한다. 사용하는 세포가 접시에 줄무늬가있는 경우,이 단계를 건너 뛰고 단계 2.4 (아래 참조)를 진행합니다.
  3. 지금 0.6-1.0 OD 600 / ㎖ 사이 여야 세포의 밀도 (OD 600)를 측정한다. 2 분 동안 8,000 RPM (6,800 XG)에서 1.5의 microfuge 튜브에 문화 ml의, 그리고 펠렛 세포를 전송합니다. 상층 액 1,475 μl를 제거합니다.
  4. 형광 현미경으로 세포를 가져와. 각 샘플을 묘화 전에 남은 배지에서 세포를 재현 탁하여 슬라이드를 제조하고, 커버 슬립에 따라 세포 현탁액 3 μL 마운트. 플라스미드의 선택에 따라 적절하게 YNB 배지를 사용하여 프로토콜 3에서 후술하는 바와 같이 다른 방법으로, 8 웰 챔버 슬라이드를 준비한다. 이상적으로, 100 배, 1.4 이상의 개구 수 (NA) 오일 액침 대물 렌즈, 12 또는 16 비트의 카메라 및 여기 / 발광 필터 화상 세포 GFP 형광에 최적화.
    참고 : 사용하여 셀 (을)를 줄무늬로 성장하는 경우NA 플레이트는 커버 슬립에 신선한 YNB 배지 3 μl를 배치하여 슬라이드를 준비한다. 피펫 팁을 사용하여, 상기 플레이트로부터 세포의 작은 콜로니를 수집 YNB 배지로 세포를 분산하고, 촬상 직전에 유리 슬라이드에 생성 된 현탁액을 탑재.
  5. 화상 실험 내의 모든 화상에 대해 동일한 파라미터 획득 (즉, 필터 세트와 노출 시간)을 이용하여 각각의 조건에 대한 세포의 4-6 랜덤 필드.
    참고 : 각 필드의 시야 또는 DIC 이미지를 수집하는 것은 pHluorin 신호가 MVB와 액포 구획에서 급냉 세포에 대한 도움이 될 수 있습니다.
  6. 각 조건에 대해 적어도 30-50 세포의 형광 강도를 정량화 (프로토콜 5 참조).

규제 엔도 시토 시스를 받아야화물의 엔도 시토 시스의 정량 3. 운동 분석

  1. 메티오닌이 부족 YNB 배지 5ml에 효모 세포 (식민지 당 직경 약 2mm)의 2 ~ 3 콜로니를 접종 및 추가플라스미드 선택을 유지하기위한 itional 아미노산 또는 영양소. 진탕 30 ° C에서 16 ~ 24 시간 동안 문화를 성장.
    참고 :이 논문에서는 규제 세포 내 이입화물 단백질을 연구 프로토콜은 메티오닌 퍼 미아, Mup1의 사용을 만들 것입니다. 조절 된 세포 내 이입을 겪는 다른화물도 pHluorin로 태깅에 적합하다 (예를 들면 우라실의 부재 세포막에 축적하고 Fur4 미아 우라실은 외부 우라실인가에 응답 내면화); 이화물에 대한 미디어 조건은화물에 대한 특정 식, 유도 및 국제화 조건을 반영하기 위해 수정해야합니다.
  2. 약 3 시간 이미징 전에 각 하룻밤 문화의 밀도 (OD 600)를 측정한다. 플라스미드 유지를위한 추가적인 메티오닌 아미노산 또는 영양 결핍 YNB 배지 0.35-0.4 OD 600 / ㎖에서 5 ㎖ 희석액을 제조하고, 진탕하면서 30 ℃에서 성장한다.
  3. 마이크로 사전 평형단계 3.2의 3 시간 배양 동안 30 ° C까지의 환경 챔버 또는 가열 단계 (있는 경우)에 대응.
  4. 전송 2 분 동안 8,000 rpm으로 (6,800 XG)에서 1의 microfuge 튜브에 세포 배양 ml의, 그리고 펠렛 세포. 상층 액 975 μl를 제거합니다.
  5. 영상 (프로토콜 1.2)에 대한 ConA에 처리, 8 잘 유리 바닥 챔버 슬라이드를 준비합니다.
  6. 물론 각 플라스미드 선택에 메티오닌 및 추가 아미노산 또는 영양분을 부족 YNB 배지 200 μl를 추가합니다. 나머지 상층 액을 단계 3.4에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 각 웰의 중앙에 세포 현탁액 250 μl를 드롭. 아래로 피펫 팅에 의해 우물의 표면에서 세포를 분산하고, 세포가 5 ~ 10 분 동안 정착 할 수 있습니다.
  7. 30 ° C (단계 3.3 참조) 평형 거꾸로 형광 현미경에 챔버 슬라이드를 놓습니다. 시야 조명을 사용하여 세포의 필드를 찾습니다.
  8. 100 μg의 / ㎖의 메티오닌을 포함 YNB 배지 50 μl를 추가20 μg의 / ㎖의 최종 메티오닌 농도를 획득하기 위해 상기 웰에 배지 200 μL로 (30 ° C로 미리는 예열). 바닥으로부터 떠로부터 세포를 방지하기 위해, 웰의 배지를 방해하지 마세요.
  9. 세포 이미징을 시작하기 전에 2 분 동안 평형을 허용합니다. 바로 첫 번째 이미지를 캡처하기 전에 원하는 초점면에 현미경을 조정 (일반적으로 적도 초점면이 가장 잘 작동합니다).
  10. , GFP 필터를 사용하여 (예를 들면 시계열 내의 모든 이미지, 100X 1.4 NA 오일 침지 대물 500 밀리 획득 시간을 동일 획득 파라미터를 이용하여, 45 ~ 60 분 동안 100을 5 분 간격으로 GFP 및 브라이트 (또는 DIC) 화상을 취득 밀리 획득 시간 DIC 필터를 사용하여).
    주 : 현미경의 스테이지 및 이미징 소프트웨어 초점 평면 드리프트를 자동 보정을 허용하지 않는 경우, 수동 각 촬상 시각 이전에 포커스를 재조정 할 필요가있다. 또한, 획득 시간은 것때문에 조명 및 필터의 차이에 현미경 사이에서 변화하고, 최적의 조건은 실험을 시작하기 전에 수동으로 결정되어야한다. Mup1 이외 이입화물을 사용하는 경우, 그화물의 내재화 동역학을 반영하기 위해, 획득 시간 및 촬상 간격뿐만 아니라 실험 기간을 수정할 필요가있다.
  11. 각 시점에서 각 셀의 형광 강도를 정량화 (프로토콜 5 참조), 제 1 화상의 초기 강도의 백분율 값을 표현한다.

규제 엔도 시토 시스를 받아야 세포 내 이입화물의 정량 4. 엔드 포인트 분석

  1. 프로토콜 3에 설명 된대로 이미징을위한 세포를 준비 (3.6 통해 3.1 단계).
  2. 이미지 즉시 시야와 GFP 필터 세트를 사용하여, 메티오닌을 추가하기 전에 각 조건에 대한 세포의 4-5 임의의 필드.
  3. 100 μg의 / ㎖의 메티오닌을 포함 YNB 배지 50 μl를 추가 (전쟁 전웰에서 배지 200 μL로) 30 ° C로 20 μg의 메드 / ㎖의 최종 메티오닌 농도를 얻었다. 바닥으로부터 떠로부터 세포를 방지하기 위해, 웰의 배지를 방해하지 마세요.
  4. 0 분 시점 (스텝 4.2)과 동일한 인수 변수를 이용하여 메티오닌을 첨가 한 후 세포의 이미지 4-5 랜덤 필드, 30 분.
  5. 각 시점에 대해 적어도 30-50 세포의 형광 강도를 정량화 (프로토콜 5 참조). 수식을 사용하여 30 분 후 내면화 Mup1-pHluorin의 비율로 명시 적 값 : - X 100 % [0 분에서 평균 강도] / [30 분에서 강도를 평균 0 분에서 강도를 평균].
    주 :. 또한 동시에 각각의 분석의 개시 시각을 엇갈리게하여 여덟 종점 분석법까지 수행 할 수있다 표 3은 여덟 동시 분석을위한 예시적인 흐름을 제공한다.

5. 후 수집 분석

  1. 1 등 수집 소프트웨어에서 이미지 내보내기6 비트 태그 이미지 파일 포맷 (이 .tif 또는 .TIFF 포맷).
    참고 : 다른 파일 형식도 적합 할 수있다, 이상적 무손실 압축 알고리즘을 사용한다. 8 비트 이미지는 일반적으로 정량 목적에 적합하지 않다.
  2. 존재하는 경우 ( '파일'메뉴에서 '열기'옵션에서 자유롭게 사용할 수 ImageJ에 소프트웨어를 (사용하여 파일 열기가. 정량의 형광 이미지를 사용하고, 참고로 시야 / DIC 이미지는 세포의 위치를 ​​확인하고 죽은 세포를 제외 ), DIC가보고 GFP 여기 / 방출 필터로 볼 때 autofluorescent하는 살아있는 세포보다 어둡게 표시되는.
  3. 형광 이미지의 배경 빼기를 수행합니다. 고르지 배경 신호 이미지의 경우, '프로세스 메뉴'에있는 '배경 빼기'알고리즘을 사용합니다. 정량 목적을 위해 일반적으로 충분 기본 설정 (50 픽셀의 볼 반경 롤링)를 사용합니다.
    참고 : 대안 backgro에균일 한 배경 이미지 싶게 감산 방법은 단계 5.3.1.-5.3.2에 설명되어 있습니다; 그러나, 상기 방법은 또한, 균일 한 배경에 대해 작동한다.
    1. 균일 한 배경 이미지 (즉, 배경 강도의 모든 에지에서 상기 이미지의 중심에서 대략 일정하다), 수동 배경 차감을 수행한다. 주 ImageJ에 창에있는 '자유 선택'버튼을 클릭하고, 세포를 포함하지 않는 이미지에서 3-5 임의의 영역을 선택합니다.
    2. 의 '분석'메뉴에있는 '설정 측정'기능을 열고 '평균 회색 값'매개 변수를 선택하고 (또한 '분석'메뉴에 있음) '측정'기능을 사용하여 강도 값을 측정한다. 3-5 측정 지역의 평균 값을 계산하고, 그 이미지의 모든 후속 측정에서 뺍니다.
  4. 운동 분석의 정량 (프로토콜 3)는 TIM을위한 단일 이미지를 생성 누적전자 시리즈. 시간 순서대로 각 시점에서 형광 이미지를 열고 (스택의 하위 메뉴에서 '이미지'메뉴에서 발견) 함수를 '스택 이미지'를를 사용하여 스택을 생성합니다.
  5. 가능한 전지의 외부 전체 셀뿐만 아니라 작은 영역을 포함해야 만드는 자유 선택 도구를 사용하여 셀을 설명합니다.
  6. 다음 매개 변수를 측정 : '지역 통합 밀도'와 '평균 회색 값'. '분석'메뉴에있는 '설정 측정'기능을 사용하여 파라미터를 선택.
    주 : 집적도 선택된 영역 내의 모든 픽셀 세기들의 합에 대응하고, 평균 그레이 값이 셀 크기에 대한 강도 값들을 보정 [집적 밀도 / 영역]에 대응한다.
  7. '도구'하위 메뉴 아래에있는 '분석'메뉴에있는 '투자 수익 (ROI) 관리자'를 엽니 다. 투자 수익 (ROI) 관리자 창에서 강조 레지오를 입력하려면 '추가'버튼을 클릭n은 관심 (ROI)의 새로운 영역으로.
  8. 반복 이미지의 나머지 셀 5.6을 통해 5.4 단계를 반복합니다. 및 이미지의 가장자리에 닿을 모든 세포, 시야 / DIC 및 형광 (그림 2 층을 볼 죽은 세포는 DIC 이미지에서 어두운 표시하고, GFP 여기 / 방출로 볼 autofluorescent 세포질 신호가)에 의해 평가로 죽은 세포를 제외합니다. 의 투자 수익 (ROI) 관리자 '창에서'추가 '버튼을 클릭하여 .zip 파일로 선택한 로아을 저장하고 스프레드 시트 또는 통계 분석 소프트웨어로 모든 측정을 내보낼 수 있습니다.
  9. 운동 분석 정량화 (프로토콜 3)의 경우, 윤곽 및 단계 5.4 및 5.5에 기술 된 바와 같이 초기의 시점에서 전지를 측정한다. 실험의 모든 후속 시점의 측정에 대해 동일한 투자 수익 (ROI)을 사용합니다.
  10. 종점 분석법 (프로토콜 2, 4)은 각 조건에 대해 30 ~ 50 셀의 최소 측정한다. 적어도 2 ~ 3 이미지에 대한 정량화를 수행하고, 각의 모든 셀을 포함분석의 단계 5.8에 설명 된 기준을 충족하는 이미지입니다.
  11. 사후 분석을 위해 Tukey에의 다중 비교 시험 다음 편도 ANOVA를 사용하여 샘플 간의 통계적 유의성을 평가합니다.

유동 세포 계측법에 의해 Mup1 - pHluorin 엔도 시토 시스 6. 인구 분석

  1. 메티오닌 플라스미드의 선택을 유지하는 추가적인 아미노산 또는 영양 결핍 YNB 배지 0.5 ㎖의 효모 세포 (콜로니 당 직경 약 2 ㎜) 2-3 콜로니를 접종한다. 롤러 드럼에 30 ° C에서 16 ~ 24 시간 동안 5 ml의 둥근 바닥 튜브에 세포를 성장.
  2. 플라스미드 유지를위한 추가적인 메티오닌 아미노산 또는 영양 결핍 YNB 배지 1.5 mL를 넣어 롤러 드럼에서 추가 3 시간 동안 30 ℃에서 성장한다.
  3. 이전 두 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브의 각 셀에 1 ㎖. 제 1 튜브 (-Met 조건)에 YNB -Met 매체의 0.25 ML을 추가하고, YNB 배지 0.25 ㎖를 100 μg의를 포함/ ㎖의 제 2 튜브에 메티오닌 20 μg의 / ㎖ (+ 만난 조건) 메티오닌의 최종 농도를 얻었다. 롤러 드럼 상을 45 분 동안 30 ℃에서 세포를 인큐베이션.
  4. 화물 국제화의 척도로 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 필터에서 셀 크기의 측정 및 Mup1-pHluorin 형광 강도로 앞으로 분산 형 (FS)를 선택, 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다.
  5. 사용되는 효모 세포의 크기 범위의 형광 강도에 대한 검출을 최적화 FS 및 FITC 채널의 전압을 조정하기 위해 슬라이더 버튼을 사용하여 (이 실험에 사용되는 설정은 FS 50 V 및 FITC 400 V이었다).
    참고 : 두 채널의 전압이 사용되는 사이토 흐름에 따라 달라집니다. 이 단계는 이전 또는 메티오닌 (단계 6.3)로 45 분 처리시 수행해야합니다.
  6. 높은 유량 설정을 사용하여, 각 조건에서 10,000 세포 FS 및 형광 강도를 측정한다. FLUO에 대한 FS의 산포도를 생성강도를 rescence : '그래프를 추가'를 클릭 FITC (x 축)와 FS (y 축)을 선택하고 그래프 1,000 점 (소프트웨어 만 세포를 측정 하였다에도 불구하고, 1000 셀의 값을 표시합니다).
    주 : 최대 일관성을 위해, 세포에게 메티오닌의 첨가 후 45 ~ 50 분을 분석; 샘플의 다수를 포함하는 실험을 위해, 유동 세포 계측법 분석에 필요한 시간을 수용하기 메티오닌 첨가 비틀.
  7. 제어로 야생형 (WT) 세포 -Met과 + 메트로 조건을 포함합니다. 게이트 함수를 사용하여, 밝은 세포의 약 5 %, 게이트의 우측에 낙하되도록 상기 WT + 메트 조건을 사용하여, 수직 게이트를 할당한다. 실험의 다른 모든 조건이 게이팅을 사용합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

구조적으로 내면화 세포 내 이입화물 단백질 STE3의 정상 상태 파악 및 정량화

살아있는 세포, STE3, 효모의 A-요인 페로몬 수용체의 세포질 C 말단 꼬리 키메라 GFP 및 pHluorin 융합의 현지화에 pHluorin 태그가화물은 엔도 시토 시스의 정량에 이용 될 수 있다는 것을 보여주기 위해 비교 하였다. STE3는 구성 적 열화 28 액포로 원형질막으로 수송 내면화 및 타겟팅 된 G 단백질 - 결합 수용체 (GPCR)이다. STE3-GFP (도 2A)를 발현하는 야생형 (WT) 세포에서 본 따라서, 정상 상태 조건 하에서 STE3 대다수는 액포 루멘에 편재. 한편, 네 클라 결합 어댑터 단백질 ENT1, Ent2, Yap1801 및 Yap1802을 (암호화하는 유전자를...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

효모 세포에서의 세포 내 이입 이벤트 정량 pHluorin의 적용은 태그 형광 단백질 (도 1a)의 세포질 테일에 융합 된 트랜스화물을 사용한다. pHluorin 태그가 중립적 인 환경에 노출되지는 않지만 pHluorin 태그가 산성 조건을 발견 한 경우 급냉 될 때 여기에 설명 된 분석의 경우,화물 밝은 형광이다. 따라서, 태그가 이입 pHluorin화물 용이 세포막의 세포질 표면에 초기 엔도 좀에서 검출되지만 내강 MVB 소체로 액포 또는 루멘의 배송에 혼입 될 때 "어둡게"된다. 일반적으로, 새로 합성 된 세포 내 이입화물 가능성 소포체 (ER)을 남겨 GFP 및 그의 변이체의 대부분은 충분히 성숙되기 전에 세포막에 도달; 따라서, ER 또는 골지 종료가 나는 경우를 제외하고 탐지 남아 아직 예측 세포 표면에 도달하지 않은화물을 pHluorin는-태그mpaired.

이러한 STE3 및 Mup1 같은 pHluorin 태그가 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서 시약을 생성하는 데 사용된 pHluorin cDNA를 공유해 주신 Gero Miesenböck과 Tim Ryan, 탁월한 기술 지원을 해주신 Nathan Wright, Joanna Poprawski, Lydia Nyasae님, 유익한 토론을 해주신 Wendland 연구실 구성원님, 현미경 및 유세포 분석에 대한 조언과 지원을 해주신 통합 이미징 센터(Johns Hopkins)의 Michael McCaffery와 Erin Pryce에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, B.W., GM60979)과 국립과학재단(National Science Foundation, B.W., MCB 1024818)의 보조금으로 지원되었습니다. K.W.는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32-GM007231)의 교육 보조금으로 부분적으로 지원을 받았습니다. A.F.O.는 Duquesne University의 생물과학부와 National Science Foundation CAREER 보조금 553143의 개발 기금으로 지원되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아데닌시그마A8626-25G아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용
Bacto-agarFisherBP1423-2플레이트 매체 준비에 사용
BD Difco 효모 질소 염기 (아미노산 제외)BD291920액체 및 플레이트 매체 준비에 사용
Concanavalin ASigmaC5275-5MG챔버 코팅에 사용 슬라이드
포도당 피셔BP350-1액체 및 플레이트 매체 준비에 사용
L-히스티딘피셔BP382-100아미노산 혼합물 및 원액
L-류신아크로스125121000아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용
L-라이신피셔BP386-100아미노산 혼합물 및 원액 L
-메티오닌FisherBP388-100아미노산 혼합물 및 원액 제조에 사용
L-트립토판FisherBP395-100아미노산 혼합물 및 원액
L-TyrosineAcros140641000아미노산 혼합물 제조에 사용
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-well)Thermo Scientific155411Mup1-pHluorin 내재화의 동역학 및 종말점 분석에 사용
UracilSigmaU0750-100G아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용
Axiovert 200 도립 현미경Carl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion 대물 렌즈Carl Zeiss대물렌즈는 100X여야 합니다., 1.4NA 이상
SensicamCooke Corporation카메라는 12비트 이상의 다이나믹 레인지를 가져야 합니다
X-Cite 120PC Q 조명 소스Excelitas Technologies
Slidebook 5 소프트웨어Intelligent Imaging Innovations
ImageJ 소프트웨어National Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
  3. Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).
  5. Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
  6. Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
  7. Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
  8. Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
  9. Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
  10. Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
  11. Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
  12. Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
  13. Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
  14. Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
  15. Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
  16. O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
  17. O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
  18. Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
  19. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
  20. Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
  21. Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  24. Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
  25. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  26. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
  27. Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
  28. Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
  29. Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
  30. Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
  31. Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
  32. Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
  33. Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
  34. Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
  35. Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
  36. Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
  37. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
  38. Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
  39. Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
  40. Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
  41. Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
  42. Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
  43. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
  44. Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

pHluorinEndocytosisFluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

관련 논문