소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그 변종 널리 단백질 현지화 및 세포 골격 리모델링 및 살아있는 세포에서 소포 인신 매매 등의 이벤트의 역학을 공부하는 도구를 사용합니다. 키메라 GFP 융합을 사용하여 정량 방법은 많은 응용을 위해 개발되었다; 그러나, GFP는 단백질 분해에 어느 정도 내성 때문에 그 형광은 세포 내 이입 경로에화물 인신 매매의 정량을 방해 할 수있는 리소좀 / 공포에 계속. 이입 및 사후 이입 피킹 이벤트를 정량화하기위한 다른 방법은 superecliptic pHluorin 산성 환경에서 켄칭 GFP의 pH 민감성 변이체를 사용한다. multivesicular 기관 (MVBs)와 리소좀 / 공포 루멘에 전달하기로화물 통합에 따라 형광의 감쇠에 횡단화물 단백질 결과의 세포질 꼬리에 pHluorin의 키메라 융합. 따라서, 액포 형광의 담금질은 quantifi을 용이하게엔도 시토 시스와 세포 내 이입 경로에 이른 사건의 양이온. 이 논문은 형광 현미경을 통해 세포 내 이입의 정량 pHluorin 태그가화물을 사용하는 방법뿐만 아니라 유동 세포 계측법 사용 인구 기반의 분석에 대해 설명합니다.
서론
소포 피킹은 진핵 세포 내의 소기관 신원 및 기능을 유지하는 데 중요한 역할을하고, 각각의 세포 구획 막 단백질 및 조성물을 조절하기위한 중요한 메커니즘이다. 이입을 통해 생성 소체 후속 재활용 또는 리소좀 타겟팅에 대한 표면으로부터 막 단백질을 제거하는 반면 세포막에서 exocytic 소포 융합은 세포 표면 단백질 및 새로운 막을 제공한다. 따라서, 엔도 시토 시스는 영양 흡수 및 세포 외 환경에 대한 응답 중요하다. 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스는 세포막 표면적을 조절하기 위해, 손상된 단백질의 회전율을 균형있게된다.
효모 및 포유 동물 세포의 연구는 다양한 EN에 응답하여 세포 내 이입에 관련된 단백질의 대량뿐만 아니라 특정화물의 내재화를 촉진 여러 세포 내 이입 경로 또는 행위를 식별 한vironmental 조건. 가장 공부 경로는 클라과 세포질 액세서리 단백질이 초기 세포 내 이입 소포를 안정화 코트 구조로 조립하는 클라 매개 엔도 시토 시스 (CME)입니다. 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에의 실험 역학 및 많은 세포 내 이입 단백질 1-3 모집의 순서로 키 통찰력을 굴복했다. 특히, CME 기계가 매우 진화를 통해 보존되는 효모에서 CME 관련 단백질의 대부분은 인간 ortholo....
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프로토콜
1. 솔루션 및 미디어
- 뒤에 오는 주식, 미디어 및 플레이트를 준비합니다 :
- 배 YNB을 준비하기 위해 물 1 L의 아미노산이 부족한 효모 질소 염기 67g을 용해. 0.22 ㎛의 니트로 셀룰로오스 필터를 통해 여과하여 멸균.
- 2 (V의 재고 / w 멸균 50 %)에서 % 덱 스트로스와 1X 아미노산 / 영양 혼합물 (10 배 재고에서) 1 배 YNB를 사용하여 YNB 매체를 준비합니다 (100 × 재고에서, 단계 1.1.4 참조). 필요한 플라스미드 선택 개별 아미노산 또는 영양분을 생략합니다. Mup1 발현 유도 추가적으로 아미노산 / 영양 혼합물로부터 메티오닌 생략.
- (V의 재고 / w 멸균 50 %에서) (10 배 재고에서) 1 배 YNB를 사용하여 YNB 판, 2 % 덱 스트로스를 준비, 0.7 g / L의 아미노산 / 영양 혼합물 (단계 1.1.5 참조)와 2.5 % 한천. 한천 25 g 및 물 860 ml의 당 아미노산 / 영양 혼합물의 0.7 g을 고온 가압 멸균하여 평판 배지를 준비합니다. ml의 오 혼합물을 100 배 YNB ml의 40을 한 후, 55 ° C로 냉각 추가 할 수 있습니다F 50 % 포도당. 플레이트 (10cm 접시 당 매체의 30 ml)에 붓고 매체가 실온에서 고화하는 것을 허용하고,....
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결과
구조적으로 내면화 세포 내 이입화물 단백질 STE3의 정상 상태 파악 및 정량화
살아있는 세포, STE3, 효모의 A-요인 페로몬 수용체의 세포질 C 말단 꼬리 키메라 GFP 및 pHluorin 융합의 현지화에 pHluorin 태그가화물은 엔도 시토 시스의 정량에 이용 될 수 있다는 것을 보여주기 위해 비교 하였다. STE3는 구성 적 열화 28 액포로 원형질막으로 수송 내면화 및 타겟팅 된 G 단백질 - 결합 수용체 (GPCR)이다. STE3-GFP (도 2A)를 발현하는 야생형 (WT) 세포에서 본 따라서, 정상 상태 조건 하에서 STE3 대다수는 액포 루멘에 편재. 한편, 네 클라 결합 어댑터 단백질 ENT1, Ent2, Yap1801 및 Yap1802을 (암호화하는 유전자를.......
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토론
효모 세포에서의 세포 내 이입 이벤트 정량 pHluorin의 적용은 태그 형광 단백질 (도 1a)의 세포질 테일에 융합 된 트랜스화물을 사용한다. pHluorin 태그가 중립적 인 환경에 노출되지는 않지만 pHluorin 태그가 산성 조건을 발견 한 경우 급냉 될 때 여기에 설명 된 분석의 경우,화물 밝은 형광이다. 따라서, 태그가 이입 pHluorin화물 용이 세포막의 세포질 표면에 초기 엔도 좀에서 검출되지만 내강 MVB 소체로 액포 또는 루멘의 배송에 혼입 될 때 "어둡게"된다. 일반적으로, 새로 합성 된 세포 내 이입화물 가능성 소포체 (ER)을 남겨 GFP 및 그의 변이체의 대부분은 충분히 성숙되기 전에 세포막에 도달; 따라서, ER 또는 골지 종료가 나는 경우를 제외하고 탐지 남아 아직 예측 세포 표면에 도달하지 않은화물을 pHluorin는-태그mpaired.
이러한 STE3 및 Mup1 같은 pHluorin 태그가 .......
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공개 사항
저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구에서 시약을 생성하는 데 사용된 pHluorin cDNA를 공유해 주신 Gero Miesenböck과 Tim Ryan, 탁월한 기술 지원을 해주신 Nathan Wright, Joanna Poprawski, Lydia Nyasae님, 유익한 토론을 해주신 Wendland 연구실 구성원님, 현미경 및 유세포 분석에 대한 조언과 지원을 해주신 통합 이미징 센터(Johns Hopkins)의 Michael McCaffery와 Erin Pryce에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, B.W., GM60979)과 국립과학재단(National Science Foundation, B.W., MCB 1024818)의 보조금으로 지원되었습니다. K.W.는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32-GM007231)의 교육 보조금으로 부분적으로 지원을 받았습니다. A.F.O.는 Duquesne University의 생물과학부와 National Science Foundation CAREER 보조금 553143의 개발 기금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아데닌 | 시그마 | A8626-25G | 아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용 |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | 플레이트 매체 준비에 사용 |
| BD Difco 효모 질소 염기 (아미노산 제외) | BD | 291920 | 액체 및 플레이트 매체 준비에 사용 |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | 챔버 코팅에 사용 슬라이드 |
| 포도당 피 | 셔 | BP350-1 | 액체 및 플레이트 매체 준비에 사용 |
| L-히스티딘 | 피셔 | BP382-100 | 아미노산 혼합물 및 원액 |
| L-류신 | 아크로스 | 125121000 | 아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용 |
| L-라이신 | 피셔 | BP386-100 | 아미노산 혼합물 및 원액 L |
| -메티오닌 | Fisher | BP388-100 | 아미노산 혼합물 및 원액 제조에 사용 |
| L-트립토판 | Fisher | BP395-100 | 아미노산 혼합물 및 원액 |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | 아미노산 혼합물 제조에 사용 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Mup1-pHluorin 내재화의 동역학 및 종말점 분석에 사용 |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | 아미노산 혼합물 및 원액 준비에 사용 |
| Axiovert 200 도립 현미경 | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion 대물 렌즈 | Carl Zeiss | 대물렌즈는 100X여야 합니다., 1.4NA 이상 | |
| Sensicam | Cooke Corporation | 카메라는 12비트 이상의 다이나믹 레인지를 가져야 합니다 | |
| X-Cite 120PC Q 조명 소스 | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 소프트웨어 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ 소프트웨어 | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
참고문헌
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endo....
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