방법 논문

핵산 폴리아닐린 계 센서

DOI:

10.3791/54590

⸱

2016년 11월 1일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

이 논문에서

요약

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핵산은 생물학적 시스템을 평가하기 위한 일반적인 분석물입니다. 그러나 효소 조작으로 인한 편향은 우려를 야기할 수 있습니다. 여기에서는 폴리아닐린을 사용하여 핵산을 표지 없이 검출하는 방법에 대해 설명합니다. 이 민감하고 비용 효율적인 센서 기술은 분자 간의 단일 뉴클레오티드 차이를 구별할 수 있습니다.

초록

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핵산 검출은 연구 및 클리닉에서 사용되는 진단 기술의 중심에 있습니다. 이러한 기술에 사용되는 표준 접근 방식은 편향과 아티팩트를 도입할 수 있는 효소 변형에 의존합니다. 차세대 검출 플랫폼의 중요한 요소는 직접 분자 감지가 될 것이며, 이를 통해 증폭 또는 라벨링의 필요성을 피할 수 있습니다. 첨단 나노 물질은 무표지 센서를 실현하기 위해 적절한 화학적 방식을 제공할 수 있습니다. 공액 폴리머는 생물학적 감지에 이상적이며 생체 분자와 호환되는 특성을 가지고 있으며 국부적인 환경 변화에 높은 민감도를 나타냅니다. 이 기사에서는 전기 전도성 고분자 폴리아닐린을 사용하여 핵산을 검출하는 방법을 제시합니다. 표적 핵산을 보완하는 간단한 DNA "프로브" 올리고뉴클레오티드가 폴리머에 정전기적으로 부착되어 표적 분자의 단일 뉴클레오티드 차이를 구별할 수 있는 센서 시스템을 만듭니다. 이 기술의 구체적이고 편향되지 않은 특성을 제외하면 매우 비용 효율적입니다.

서론

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Conjugated polymers는 분자 센서에 대한 많은 옵션을 제공합니다. 여기에는 형광, 전자 및 비색 반응이 포함됩니다1. 핵산 센서에 공액 폴리머를 통합하기 위한 많은 노력이 있었습니다. 그러나 대부분의 시스템에는 2차 감지가 필요하므로 감지 옵션이 제한됩니다2. 최근에 우리는 폴리아닐린(PANI)을 기반으로 하는 공액 폴리머 기반 센서 플랫폼이 이 폴리머의 특성을 활용하여 무표지 시스템을 만든다고 보고했습니다3. PANI는 생물학적 시스템4를 측정하는 데 적합한 형광 및 저항과 같은 특성을 가진 광범위하게 결합된 전기 활성 폴리머입니다. 구조 내의 엑시톤은 국소화되지 않아 단량체 소단위 사이의 양전하의 이동성으로 이어집니다. 이것은 DNA5,6의 음전하를 띤 골격과 상호 작용할 수 있는 양전하의 유연한 골격을 제공합니다. 중요한 것은 정전기로 부착된 DNA가 질소 염기가 염기 쌍에 참여할 수 있도록 배향되어 있다는 것입니다. DNA와의 결합은 PANI의 전자적 특성을 변화시키며, 이러한 효과는 UV 조사에 의해 향상될 수 있습니다(그림 1)3. 이 시스템을 사용하면 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 PANI에 고정할 수 있습니다. 여러 연구에 따르면 혼성화 시 정전기로 흡착된 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA 구조로의 전환으로 인한 구조적 변화로 인해 PANI 또는 기타 양이온 매트릭스에서 해리됩니다3,5,7.

프로브 부착이 접합 폴리머 특성을 조절하는 센서 시스템에서, 혼성화 이벤트는 프로브 또는 표적 핵산의 표지 또는 효소 변형 없이 transduction될 수 있습니다. 복합 폴리머는 검출 방법에서 뛰어난 유연성을 제공하며, 그 중 하나는 형광입니다. PANI 형광 모니터링을 통해 10-11M(10pM)의 낮은 표적 핵산 농도를 검출할 수 있습니다3. 검출은 혼성화 후 15분 이내에 빠르게 발생하며, 표적 분자의 단일 불일치를 구별할 수 있는 특정 위치에 있습니다3.

PANI 센서의 제작은 간단합니다. 아닐린 단량체, 계면활성제 및 산화제의 제어된 첨가를 포함하는 표준 합성 절차를 사용하여 물에 잘 분산된 고분자량 PANI를 생성할 수 있습니다. 수율은 매우 높을 수 있으며 물로 세척하여 미반응 산화제를 제거하여 더 이상의 PANI 성장을 보장할 수 없습니다. PANI-프로브 결합은 혼합 시 자발적으로 발생하며, 가벼운 UV 노출에 의해 복합체 형성이 향상됩니다. 혼성화는 즉시 수행할 수 있으며 짧은 배양 후 PANI 형광의 변화를 분석할 수 있습니다. 이 기술의 단순성으로 인해 많은 실험실에서 쉽게 접근할 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 처리 가능한 PANI 합성

  1. 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 클로로 폼 60㎖를 완전히 (1 ㎖, 11 밀리몰) 아닐린을 녹인다. 600 5 분 동안 회전과 얼음 0-5 ° C까지 시원한에서 저어. 이것은 일반적으로 15 ~ 20 분 (그림 2A)를합니다.
  2. 600 rpm으로 교반하면서 둥근 바닥 플라스크 내의 아닐린 용액에 소듐 도데 실 벤젠 설포 네이트 (NaDBS) (7.44 g, 21 밀리몰)을 추가한다.
  3. 20 ml의 물에 황산 암모늄 (APS) (3.072 g, 13.5 밀리몰)을 용해하고 모든 드롭 현명한 30 분 이상 반응의 과열을 방지하기 위해 추가 할 수 있습니다.
  4. 24 시간 동안 0 내지 5 ℃에서 반응을 수행하고, 또 다른 24 시간 동안 실온에 도달 할 수있다.
  5. 반응 혼합물은 초기에 15 분 후에 유백색 차례 관찰, 2 시간 후에, 최종적으로 24 시간 (도 2B-F) 후 진한 녹색 다음 암갈색.
  6. 흐너 깔때기로 PANI-NaDBS 용액 필터. 같은 80 ml의 클로로포름 120 ml의 물과 혼합eparation 깔때기 (그림 2G).
  7. 수성 상청액과 반응 NaDBS APS두고, 실온에서 24 시간 동안 용액을 인큐베이션하고, 분리 깔때기에서 어두운 녹색 PANI 수집.

2. PANI 프로브 혼합 UV 조사

  1. 클로로포름 - 물 PANI 용액을 10 배 희석 (1 : 3 v / v)로 및 미세 원심 분리 튜브에서 15 분 동안 부드럽게 흔들하여 프로브 DNA 올리고 뉴클레오티드 6.4 μmol 희석 PANI 200 μL를 혼합한다.
  2. 2 분 동안 가교제의 UV 1,200 μJ / ㎠로 PANI-DNA 용액을 조사한다. 자외선 노출이 표시된 양을 제한하는 것이 중요합니다. UV에 노출 확장은 PANI 및 DNA의 공유 가교에 의한 가능성 PANI의 형광 변화를 타협.
  3. 6 분 동안 17,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 단지 및 인산염 완충 식염수 (PBS)으로 씻는다. 다시 펠렛 및 PBS에 다시 일시 중지합니다.

3. HPANI 프로브의 ybridization

  1. PANI 프로브 단지의 200 μL에 핵산을 100 μM 보완 DNA 올리고 뉴클레오타이드의 8 μl를 추가 또는 대상.
  2. 40에서 15 분 동안 혼합 용액을 흔들어 하이브리드를 수행 기음.
  3. 6 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리하여 PANI 단지 펠렛. PBS로 세척하고 물에 다시 일시 중지합니다.

4. 배출 정상 상태 형광 측정

  1. 250 nm에서 여기로 96 웰 마이크로 플레이트에 다른 치료에서 PANI를 추가하고 270-850 nm의 범위에서 방출 형광을 측정한다. PANI위한 발광 피크가 500 nm의 주위를 관찰해야한다.

하이브리드 이중 5. 형광 현미경 측정

  1. 48 시간 40 ° C에서 붕규산 유리 커버 슬립 건조에 코트 PANI를 삭제합니다.
  2. 건조 PANI 필름에 프로브 (100 μM의 8 μl를) 추가하고 자외선 (1,200 μJ / ㎠로 조사 ) 2 분.
  3. 48 시간 동안 40 ° C에서 PANI-프로브 PBS 필름을 건조 씻으십시오.
  4. 표적 핵산을 첨가하여 15 분 동안 혼성화를 수행한다. 이는 생물학적 샘플 또는 제어 표적 올리고 뉴클레오타이드 (100 μM 8 μL) 일 수있다. PBS의 세척에 따릅니다.
  5. 500 nm의 긴 패스 필터, 40X 배율에서 형광 이미지를 얻습니다.

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결과

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도 2a는 APS 부가 전 중합 공정, 즉 개시시 반응 셋업을 캡처한다. 미셀 형성은 미셀 계면 프로세스 PANI 합성이 발생하는 반응의 초기 단계이다.도 2b는 5 분 후에 유백색 용액을 나타낸다. APS 반응 첨가 후 30 분 약간 갈색으로 변.도 2c는 올리고머의 형성과 연관된 색상 변화를 보여준다.도 2D가 함께 일관성 단쇄 PANI의 높은 농도를 나타내는, 4 시간 후에 진한 갈색을 나타낸다 매우 느린 반응. 마지막으로, 클로로포름 - 물 (도 2E)에 분산 된 고 분자량 PANI의 암녹색 용액을 관찰 할 수 48 시간 후.도 2F는 상분리와 분리 깔때기에서 잘 분산되어, 균일 한 PANI 용액을 나타낸다.

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토론

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핵산의 PANI 기반 센서는 DNA 및 RNA와 상호 작용하기 위해서 물에 대한 중합체의 용해를 필요로한다. 물 PANI의 분산 이전 8보고 미셀을 형성하는 계면 활성제를 사용하여 달성된다. 4- sulfophthalic 산 도데 실 에스테르와 같은 다른 음이온 성 계면 활성제 여기서 사용 NaDBS 이외에도, 노닐 페놀에 톡실 레이트, 또는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드와 같은 양이온 성 계면 활성제 등의 비이 온성 계면 활성제는 또한 가공성 PANI 9,10의 합성에 사용될 수있다. 1 몰비 : 여기에 기술 된 합성 2에 아닐린 단량체를 첨가 음이온 계면 활성제 NaDBS의 고정 된 비율로 시작된다. 계면 활성제 NaDBS 높은 친수성 - 친 유성 균형 (HLB)이 고분자 미셀 유적 및 물로 균형을 확립하여, 클로로포름 - 물에 유화 아닐린 단량체의 중합 수있다. GR의 미셀을 생성하기 위해 1.5 몰비 산화제 APS는 1로 첨가내부 코어는 핵제로서 작용 PANI를 인하여. 이것은 ...

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공개 사항

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이 작업은 University of Southern Mississippi College of Science and Technology와 Mississippi College of Science and Technology 및 Mississippi INBRE 프로그램(국립 일반 의학 연구소에서 수상 번호 P204M103476)의 지원을 받았습니다.

감사의 글

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저자는 공개할 것이 없습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아닐린 피셔 사이언티픽 A7401-500 ACS, 액체, 냉장
과산화황산암모늄Fisher Scientific A682-500 ACS, 결정질
나트륨 도데 실 벤젠 설포 네이Pfaltz & 바우어 D56340 95% 고체
클로로포름피셔 사이언티픽 MCX 10601 액체
DNA 프라이머MWG 오퍼론n/a맞춤형 DNA 서열 ~20  bps
마이크로플레이트 미국 과학 1402-9800년 96 음, 폴리프로필렌은 클로로포름에 반응하지 않기 때문입니다
마이크로플레이트 접착 필름USA Scientific 2920-0000 well-to-well 오염, 시료 유출 및 증발을 줄입니다.
현미경 커버 유리Fisher Scientific 12-544-D UV 조사 커버 유리에 코팅된 PANI
UV 크로스링커 UVP HL-2000 에너지: X100 μ J/cm2; 시간: 2분
혼성화 오븐VWR01014705 T온도: 400  ° C; 15분 동안 흔들림과
함께 유리 장치 Fisher Scientific반응을 위한 세 개의 목이 있는 둥근 바닥 플라스크; 떨어뜨리는 깔때기, 스토퍼, 콘덴서, 분리 깔때기
현미경Leica Microsystems 라이카 IMC S80배율 20X; 의사 색상 536 nm; 노출 86 msec; 1.0배 획득; 감마 1.6
마이크로플레이트 리더분자 장치 89429-536
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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