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방법 논문

손쉬운 및 환경 친화적 인 경로는 그레이드 기공 크기와 폴리 (젖산) 공사장 공중 발판을 제조

8.3K 조회수

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DOI:

10.3791/54595

⸱

2016년 10월 17일

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1Department of civil, environmental, aerospace, and materials engineering (DICAM), RU INSTM, University of Palermo

이 논문에서

요약

이 작업에서는 용융 혼합과 선택적 침출의 조합을 사용하여 폴리(젖산)/폴리에틸렌 글리콜(PLA/PEG) 스캐폴드를 준비했습니다. 본 명세서에서 논의된 방법은 다공성과 공극 크기를 모두 높게 제어함으로써 3층 스캐폴드를 개발할 수 있도록 허용했다. 기계적 특성은 또한 생리학적 환경에서 평가되었습니다.

초록

최근 몇 년 동안 FGS(Functionally Graded Scaffolds)는 조직 공학용 장치 제조에 중요한 역할을 했습니다. 이 새로운 생체 재료 연구 분야의 중요성은 한 구조 또는 구성에서 다른 구조 또는 구성으로 지속적인 변경을 포함하여 다양한 조직의 복잡한 기능을 모방할 수 있는 임플란트를 개발할 필요가 있기 때문입니다. 이 후자의 맥락에서 주요 관심 주제 중 하나는 뼈-연골 계면 조직에 적합한 골격의 설계에 관한 것입니다. 본 연구에서는 폴리(젖산)(PLA), 염화나트륨(NaCl) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 용융 혼합하여 등급이 매겨진 공극 크기를 갖는 3층 골격을 달성했습니다. 공극 크기 분포는 NaCl granulometry 및 PEG 용매화에 의해 제어되었습니다. 골격은 형태 학적, 기계적 관점에서 특성화되었습니다. 제조 방법, 공극 구조 및 압축 기계적 거동 사이의 상관 관계가 발견되었습니다. 계면 접착 강도는 맞춤형으로 설계된 계면 강도 테스트를 사용하여 정량적으로 평가되었습니다. 또한 인간의 생리학을 모방하기 위해 37°C에서 인산염 완충 식염수(PBS) 용액에 대한 기계적 테스트도 수행했습니다. 여기에 제시된 방법은 다공성, 기공 크기 분포 및 기계적 성능에 대한 높은 제어를 제공하므로 간단하고 친환경적인 경로를 따라 맞춤형 특성을 가진 3층 스캐폴드를 제작할 수 있는 가능성을 제공합니다.

서론

플라스틱 폐기물에 대한 우려가 높아지고 재생 불가능한 자원의 사용이 감소함에 따라 지난 몇 년 동안 학계와 업계 모두에서 생분해성 폴리머에 대한 관심이 중요해졌습니다1-7. 특히, 생체 적합성 및 생분해성 합성 고분자는 약물 조절 방출8,9, 흡수성 봉합사8,10, 바이오프로세스 강화11 및 조직 공학12과 같은 여러 생물 의학 응용 분야에 널리 퍼져 있습니다.

조직 공학은 병들거나 손상된 조직의 정상적인 기능을 회복하고 유지할 수 있는 장치의 개발에 중점을 둡니다. 대부분의 천연 조직은 특정 공간 계층에서 다양한 유형의 세포와 세포외 기질(ECM)로 구성되어 있습니다. 예를 들어, 관절 연골(AC)은 콜라겐 섬유와 콜라겐 결합 단백질의 유형과 방향이 다양한 여러 영역으로 구성됩니다. 더욱이, 연골과 뼈는 현저하게 다른 계층 구조를 보여줍니다. 이러한 맥락에서, 각 층에서 공학적 특성을 가진 다층 골격을 준비하면 이러한 복잡한 시스템의 모든 국소 미세환경을 고려하여 이종 조직을 대체할 수 있습니다13,14.

골격의 세포적/생물학적 및/또는 물리화학적 특성에 따라 조직 공학에서 채택한 주요 전략은 단위상, 이중 위상 및 삼상으로 나눌 수 있습니다. Biphasic 및 Triphasic 접근법(BTA)은 2개 또는 3개의 서로 다른 기공 아키텍처, 재료 또는 필러를 사용하여 다층 기능 장치를 준비합니다. 또한, 단일 재료를 사용하여 물리적 특성에서 구배를 생성할 수 있는 한 이중 위상 또는 삼중 장치를 얻을 수 있습니다(12).

세포 이동은 형태 형성, 염증, 상처 치유 및 종양 전이에서 중요한 역할을 합니다. 세포 이동은 장치의 표면에서 코어까지 화학적 물리적 특성의 구배의 존재에 의해 촉진됩니다. 따라서 위에서 논의한 요구 사항을 충족하는 생체 재료는 세포 이동을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 이동(화학주성)을 유발하는 화학적 구배(chemical gradient) 외에도 세포 배양 기질의 기계적 특성도 세포 이동(메카노타시스)으로 이어질 수 있습니다15.

다층 구조는 또한 층의 특정 면적 또는 적재된 약물의 양을 변경하여 고분자 매트릭스 내에 통합된 특정 약물의 조정 가능한 방출을 제공할 수 있습니다.

지난 10년 동안 다공성 또는 기공 크기와 같은 형태학적 특성의 불연속적 또는 연속적인 구배를 갖는 골격을 개발하기 위해 몇 가지 접근 방식이 제시되었습니다16-31. 가장 최근의 논문은 입자 침출 12,28,32, 가스 발포 기술16, 전기 방사17-19, 레이어 주조 기술20, 신속한 프로토 타이핑21,22, 열 유도 상 분리 (TIPS) 22, 원심 분리 동결 건조24,25, 삼중주기적 최소 표면 (TPMS) 26, 동결 주조27-30.

이 작업의 틀 내에서 용융 혼합, 압축 성형 및 염 침출을 결합하여 PLA 기반 3층 다공성 스캐폴드(TLS)를 달성하는 빠르고 간단한 경로를 제시합니다. 스캐폴드 생산에 일반적으로 사용되는 대부분의 기술과는 달리, 본 명세서에 채택된 전략은 환경 및 살아있는 세포 및 조직에 잠재적으로 위험한 독성 용매를 필요로 하지 않기 때문에 완전히 친환경적인 것으로 간주될 수 있다32. 제작된 장치의 형태학적 특징과 기계적 거동을 모두 분석하여 본 연구에서 확립된 기본 가공-구조-특성 관계는 특정 대상 특성을 가진 다기능 등급 골격 설계의 향후 발전에 대한 지침을 제공합니다.

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프로토콜

1. 비계 제작

  1. 20 분 동안 실험실 믹서기에 염화나트륨을 갈기 100 ℃에서 히터에 건조.
  2. 공진 발생하지 않고 가장 높은 주파수에서 30 분 동안 체질 기계에있는 말린 염화나트륨 (한 번에 45g)을 넣습니다. 500 μm의 1000 μm의 (M 500)에 이르기까지 여섯 소금 분수를 수집; 300 μm의 500 μm의 (M 300); 100 μm의 200 μm의 (M 100); 90 μm의 100 (M 90); 그림 1에 도식화로 45 μm의 소금 입자 10 (M 45) μm의 65 그리고 마지막으로 M에서보다 작은 45 μm의 크기를.
  3. 진공 처리하는 동안 가수 분해 절단을 방지하기 위해 밤새 모든 재료를 건조. 유리 전이 - 중합체의 경우 - 각 재료 극복없이 건조도를 최대화하기 위해 온도를 선택한다. 따라서, PEG에 대한 PLA에 대한 T = 90 ° C 및 T = 25 ° C, T = 염화나트륨 105 ° C를 선택합니다.
  4. 먹이배치 믹서 T = 190 ° C에서 동작하고, N = 60 rpm으로하고 약 후에 보통 토크 상수 값을 달성 할 때까지 처리를 각각 20/5/75의 중량 퍼센트 조성 PLA, PEG 및 염화나트륨, 10 분. 그 후, 신속하게 결과 자료를 수집합니다.
  5. 10mm 직경 3mm의 높이에 해당 통형 금형의 블렌드를 넣고 상압에서 60 초 3 분간 180 바에서 그들을 유지, 210 ° C에서 동작하는 실험실 프레스를 사용하여 단일 층을 준비 . 그 후, 180 바의 압력을 유지하고, 실온에서 혼합물을 냉각.
  6. 압축 성형을 통해 3 층 어셈블리
    1. 10mm 직경 1 mm의 높이를 갖는 동일한 (1.5)에서 설명한 것과 같은 방식으로 그러나 다른 금형을 사용하여, 즉, 각각의 단일 층을 준비한다. 마지막으로, 디스크 (6) 여섯 가지 입경 함유 10mm 직경 1 mm의 높이를 갖는 얻었다 : M (500), M (300), M (100),
    2. FOR 조립 삼층 발판 A (TLS A), 원통형 금형 내부에 M 500 M 300 M 100을 쌓아 및 주위 압력에서 60 초, 3 분 210 ° C에서 동작하는 실험실 언론을 압축 - 성형 180 바, 180 바의 압력을 유지하고, 실온에서 냉각시켰다.
      참고 : A. TLS에 사용되는 것과 동일한 절차에 따라 각각 M (90), M (45)와 동일한 금형 M (10) 및 행동은 압축 성형 작업에 적층하여 TSL B를 제조
  7. 원통형 금형에서 디스크를 제거하고 교반하지 않고, 끓는 순수 욕조에 넣어. 3 시간 후, 욕조에서 생성 된 다공성 구조를 제거하고 화학 후드에서 실온에서 12 시간 동안 그들을 건조 할 수 있습니다.

2. 형태 학적 분석

  1. 주사 전자 현미경에 의해 발판의 모폴로지를 평가한다.
    1. 액체 질소에서 샘플을 분해 한 후 첨부접착제 카본 테이프를 이용하여 알루미늄 스터브에 샘플. 마지막으로, 스퍼터 coate을 금 촬상 전에 아르곤 분위기하에 90 초 동안 시험 동안 정전기 방전을 회피하기 위해.

3. 비계 기공 크기

  1. 골격의 기공 크기 분포를 인식 할 수있는 화상 처리 소프트웨어 SEM 분석에 의해 얻어진 이미지를 정교.
    참고 : 본 연구에서는 기공 크기 분포 분석은 MATLAB 기반 소프트웨어 이전 33 기재하여 행했다

4. 다공성

  1. 침출 전에 샘플을 계량하고, 다음 식에 따라 공극률을 이론적으로 평가 :
    figure-protocol-1
    참고 : 균일 한 혼합을 가정하여, 염화나트륨, m PEG를 해요 및 PLA를 해요, 각각의 NaCl, PEG 및 PLA의 이론적 질량입니다. 티그는 염화나트륨, PEG 및 PLA의 (ρ)는 각각 2.16 g / cm 3, 12 g / cm 3 전자 1.24 g / cm 3이다 밀도를.
  2. 침출 및 샘플 (ρ 지지체)의 겉보기 밀도를 평가하기 위해, 건조 후의 시료 중량을 측정 한 다음, 지지체의 겉보기 밀도와 비 다공성 PLA의 밀도의 비의 역수로 실제 기공율을 평가 식 (2)를 사용.
    참고 : 그것은 지지체의 빈 볼륨 (빈 + 전체) 발판의 전체 볼륨의 비율을 표현한다.
    figure-protocol-2

5. 기계적 성질

  1. 1 KN 로드셀을 구비 한 인장 장치를 사용하여 압축 모드에서 샘플을 테스트한다. -1 분 1mm의 일정한 변형 속도를 설정합니다.
  2. 생리적 환경에서 샘플의 기계적 성능을 조사하기 위해, dynamomete을 장비37 ℃에서 함유하는 욕 (PBS) (pH는 7.4)와 (R)과 점 5.1에 기재된 방법과 동일한 설정으로하여 시험한다.
    1. 젖은 환경에서 각 측정 전에 PBS 모든 구멍을 채울 수 있도록하기 위해 5 분 동안 진공 플라스크에 PBS와 함께 샘플을 흡수. 그 후, 지지체가 설정 점 온도에 도달하기 위해 15 분 동안 37 ℃에서 PBS로 유지 할 수있다.
  3. 문헌 32, 34에 기재된 방법에 따라 기계식 시험기에 접속 된 맞춤 설계 계면 강도 테스트 장비를 사용하여 TL TL A 및 B의 층간의 계면 접착 강도 (IAS)을 결정한다.
    1. 리그의 발판을 수정하고 시스템의로드 셀 및 기본 플래 튼과의 올바른 정렬을 보장합니다. 높은 점도 접착제를 사용하여 알루미늄 테스트 스텁에 발판 샘플을 부착하고 테스트 장비에 배치합니다.
    2. 젖은 상태의 테스트를 위해, 1 시간 PRI에 대한 PBS에서 샘플을 수화또는 시험에. 분 -1 1mm의 변형 속도로 가해진 인장 하중하에 1 KN로드 셀을 사용한다.
      주 : 고장 어느 한쪽 층의 최대 인장 강도 또는 그 때문에 계면에서 박리가 발생할 수 있음을 고려. 응력 - 변형률 곡선의 최대 강도로 IAS 평가.

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결과

골격의 기공 구조에 염화나트륨 입경의 영향은 시료의 형태를 조사하고, 각각의 이미지 분석에 의한 공극 크기 분포를 산출함으로써 정 성적 및 정량적으로 평가 하였다 2A도 -. F가 얻어진 모노 레이어 비계의 SEM 현미경 사진을 나타낸다 다른 염화나트륨 입자 크기를 포함하는 물질의 염 침출.

보다 상세하게, M (500) (도 2a)는 아마도 이상 500 ㎛의 용융 혼련시에 직경 염 입자의 파손에 500 μm의 평균 직경을 갖는 공극을 보였다. 같은 그림에서 명확하게 볼 수, 기공 구조가 약 10 μm의 벽에 둘러싸여 제대로 상호 불규칙한 기공의 수가 적은 것이 특징입니다. 그림 (b)는이에서 M (300)의 형태를보고이 경우, 세공 따라서...

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토론

첫 번째 중요한 단계 체질 효율의 최적화이다. 염화나트륨 입경의 높이 제어는 원하는 공극 크기 분포를 갖는 지지체를 제조하기위한 기초이다. 다른 중요한 단계는 몰드로부터 표본 추출시 얇은 PLA 단층의 파괴를 방지한다. 화상 처리 해석 장치 전체를 대표 할 수 없습니다.

인장 시험 동안, 샘플 멀리 장비에서 찢어 수 있습니다.

체질 단계에 앞서, 염이 잘 염화나트륨 입경의 높은 제어를 얻기 위해서 건조 된 것을 확인. 이 문제 인해 매우 높은 흡습성, 특히 최소 염 입경 중요하다. 압축 성형 단계에 앞서, 금형으로부터의 샘플 제거를 용이하게하기 위해 몰드에 얇은 테프론 분무 코팅을 적용한다. 화상 처리 분석은 다른 이미지 촬영 고려하여 수행되어야발판의 다른 지역에서 그들이 전체 장치의 대표 있는지 확인합니다. 마지막으로, 앞서주의 깊게 검사 (습식 환경에서 수행 특히)를 인장 접착 성을 샘플링 접착제를 확인한다.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 INSTM의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
폴리(젖산)NatureWorksPLA 2002D
폴리(에틸렌 글리콜)시그마83797-1KG-F
클로라이드 나트륨시그마793566-5KG-D
포스페이트 버퍼 솔루션시그마P5368-10PAK
실험실 믹서BrabenderPLE 330 - Plasticorder
Laboratory PressCarver
Scanning Electron MicroscopyPhenom-worldProX
만능 시험기Instron3365 (영국)
BioPuls BathInstron, Norwood
체질 기계EndecottsE.V.F.1.
진공 오븐ISCONSV9035
정밀 밸런스장갑AX224

참고문헌

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