방법 논문

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

DOI:

10.3791/54599

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2016년 10월 18일

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

이 논문에서

요약

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이 원고는 표현형 및 유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 거주하는 대 식세포의 정량 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 얻어진 염색 된 세포는 이에 실험 모델에서 얻어진 정보를 증가, 세포 선별, 유전자 발현 분석 또는 기능적 연구를 포함하는 다른 응용에 사용될 수있다.

초록

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신장 질환의 발병과 진행에서 염증과 대식세포의 중요한 역할을 시사하는 증거가 증가하고 있습니다. 대식세포(macrophage)는 신장 손상과 관련된 이질적인 세포입니다. 대식세포는 두 가지 다른 표현형으로 분류될 수 있습니다: 전염증성 사이토카인을 방출하고 섬유증을 촉진하는 고전적으로 활성화된 대식세포(M1 대식세포); 및 대안적으로 활성화된 대식세포(M2 대식세포)는 면역조절 및 조직 리모델링 기능과 관련이 있습니다. 이러한 대식세포 표현형은 신장 손상에 대한 기여도를 결정하기 위해 구별하고 분석해야 합니다. 그러나 염증성 신장 질환 모델, 특히 쥐에서 대식세포 아형에 대한 일관된 표현형 및 기능적 정보를 보고하는 연구는 거의 없습니다. 이 사실은 생쥐와 달리 쥐에서 사용되는 제한된 대식 세포 마커와 관련이있을 수 있습니다. 따라서 이러한 침투 세포의 신장 함량을 신뢰할 수 있는 방식으로 정량화하고 특성화하기 위한 새로운 전략이 필요합니다. 이 원고는 신장 소화를 위한 프로토콜과 유세포 분석을 통한 쥐 신장의 대식세포에 대한 추가 표현형 및 정량적 분석을 자세히 설명합니다. 간략히, 신장을 콜라겐분해효소로 배양하고 살아있는 세포에서 CD45(백혈구 공통 항원) 및 CD68(PAN 대식세포 마커)의 이중 존재에 따라 총 대식세포를 식별했습니다. 그 후 CD86(M1 마커) 및 CD163(M2 마커)의 표면 염색이 수행되었습니다. 쥐 복막 대식세포는 유세포 분석에 의한 대식세포 마커 검출을 위한 양성 대조군으로 사용되었습니다. 당사의 프로토콜은 세포 폐사율을 낮추고 다양한 세포 내 및 표면 단백질 마커의 특성을 분석할 수 있게 하여 다른 프로토콜에서 관찰되는 세포 무결성의 손실을 제한했습니다. 또한 이 절차를 통해 세포 분류 및 mRNA 또는 단백질 발현 연구를 포함한 추가 기술에 대식세포를 사용할 수 있습니다.

서론

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신장 질환은 전 세계적인 건강 문제로, 유병률이 증가하고 이환율 및 사망률 증가와 관련이 있습니다1. 신장 손상의 진행과 발달에 관여하는 가장 중요한 메커니즘 중 하나는 주로 대식세포에 의해 유발되는 염증입니다. 대식세포는 신장 질환을 포함한 많은 염증성 질환에서 중추적인 역할을 합니다2. 따라서 급성 신장 손상(AKI) 또는 만성 신장 질환(CKD) 환자의 생검에서 침투하는 대식세포의 존재가 증가한 것으로 보고되었습니다3,4. 최근 연구에 따르면 신장 질환의 장기적인 결과는 대식세포에 의해 조절될 수 있다고 합니다5,6. 국소 미세환경에 대한 반응으로, 대식세포는 다양한 생물학적 기능을 수행하는 다른 표현형으로 분화될 수 있습니다7. 두 가지 잘 분화된 대식세포 표현형이 확립되었습니다: 고전적으로 활성화된 대식세포(M1 대식세포)와 대안적으로 활성화된 대식세포(M2)8. M1 대식세포는 염증을 촉진하는 반면, M2 대식세포는 항염증 역할을 하며 조직 복구에 관여한다9. 따라서 대식세포 이질성에 대한 더 나은 지식은 대식세포의 조절과 신장 병리학에 대한 기여도를 이해하고 새로운 치료 접근법을 개발하는 데 필요합니다.

쥐와 쥐 모델 모두 신장 손상과 관련된 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 데 널리 사용되어 왔다10. 그러나 이러한 설치류 간의 대식세포 표현형을 식별하는 데 사용되는 다양한 마커에는 상당한 차이가 있습니다. 따라서 F4/80 또는 Ly6C와 같은 여러 쥐 마커는 쥐에서 사용되지 않으므로 이러한 종 간의 발견 외삽을 제한합니다. 더욱이, 쥐의 대식세포 표현형을 설명하는 마커의 수는 제한되어 있으며, 이는 쥐와 비교하여 이러한 동물의 대식세포 이질성을 분석하는 연구가 부족하다는 것을 설명합니다. 따라서 쥐의 신장 질환 모델에서 대식세포의 역할을 이해하기 위해 대식세포 하위 집합 특성화를 위한 새로운 전략이 필요합니다.

이 원고는 유세포 분석을 통해 쥐 신장에서 채취한 대식세포의 표현형 및 정량적 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 세포 분류 및 mRNA 또는 단백질 발현 연구를 포함한 여러 분석법을 통해 신장 질환에서 대식세포의 역할을 심층적으로 특성화할 수 있습니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 지침 유럽 의회의 63분의 2,010 / EU 및 국가 가이드 라인 2천13분의 53 다음 지역 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

시약 및 솔루션 1. 준비

  1. 무균 조건 하에서 모든 시약 및 솔루션을 준비하고 층류 후드 사용합니다. 4 ° C에서 솔루션을 유지합니다.
  2. 염색 버퍼를 준비 (2 % 태아 소 혈청 1 배 둘 베코의 PBS에서 (FBS)).
  3. 식염수의 각 ml의 콜라게나 제 0.5 mg을 추가하여 콜라겐 솔루션을 준비합니다.
  4. 케타민 / 자일 라진의 마취 솔루션을 준비합니다 (2 : 1 v / v)로.

2. 신장 관류 및 추출

  1. 케타민 / 자일 라진의 복강 내 주사 (75 밀리그램 / 12 ㎎ / ㎏ 체중)로 쥐를 마취. 조심스럽게 동물이 충분히 마취되어 있는지 확인하기 위해, 피부의 작은 배를 꼬집어. 그런 다음, 마취 동안 건조를 방지하기 위해 수의사 연고와 눈을 다룹니다. 참고 : 4 월을일짜리 위 스타 쥐이 분석에 사용됩니다.
  2. 쥐가 완전히 마취되면, 앙와위에서 수술 테이블에 놓습니다.
  3. 복부에 70 % 에탄올을 적용합니다.
  4. 흉막과 복강을 노출, 흉곽의 치골에서, 복부 피부와 복막을 통해 중앙 절개를합니다.
  5. 모든 혈액 신장에서 제거 될 때까지 관류 시스템을 사용하여 신장을 관류하는 복부 대동맥에 생리 식염수 (0.9 %)을 주입한다. 피를 해제하기 위해 복부 수준에서 대동맥을 잘라.
  6. 신장 폐문 (신장 정맥, 동맥과 요관)에서 절단하여 쥐에서 모두 신장을 제거합니다. 신장을 디 캡슐주의 깊게 캡슐 (11)을 분리, 손가락을 사용하여 신장의 가장자리를 누른다.
  7. 행크스 '균형 소금 용액에 신장을 놓습니다.

3. 신장의 소화와 세포 현탁액

  1. 작은 조각으로 가위 신장의 절반을 잘라 넣어1.5 ML 튜브에 조각.
    참고 : 모든 다음의 농도는 1 샘플 (1/2 쥐의 신장)에 대해 계산된다.
  2. 콜라게나 제 용액 1 ㎖를 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 콜라게나 제 용액을 전체 조직에 접근하는지 확인 반전하여 매 5 분 혼합한다.
  3. 솔루션을 수집하고 플런저의 도움으로 스트레이너 (40 μm의)를 통해 통과하고, 염색 버퍼 10ml에 그것을 재현 탁.
  4. 15 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
  5. 1 ml의 ACK (암모늄 - 염화 - 칼륨) 용균 버퍼에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 1 분, 실온에서 30 초 후, 반응을 중지 염색 완충액 10 ㎖를 추가한다.
  6. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
  7. 다시 중단 완충액 (1 ml)로 염색 적절한 부피 펠릿 및 스트레이너 (30 μm의)을 사용하여 세포 현탁액을 필터.
  8. 혈구에 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포의 수를 세어 STA하는 1.5 ㎖의 튜브에 2 백만 세포를 추가ining.

4. 세포 염색 및 유동 세포 계측법 분석

  1. 5 분 100 XG에 원심 분리기 세포.
  2. Fc 수용체를 차단하기 위해 39 ° C에서 10 분 동안 : 다시 일시 래트 혈청 100 ㎕에서 펠렛 (1 : 100 희석).
  3. 5 분 동안 염색 버퍼와 원심 분리기 (100) XG 1 ㎖을 첨가하여 세척 하였다.
  4. 살아있는 세포 (1,000 3) 감지 및 솔루션 CD45 APC-Cy7 (1 : 100), CD163 A647 (100 4) 각 조건에 대한 염색 버퍼 100 ㎕의 세포 표면 얼룩에 대한 항체를 섞는다.
  5. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 항체 믹스 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
  6. 5 분 동안 100 XG에 염색 버퍼 원심 1 ㎖을 첨가하여 세척 하였다. 이 단계를 반복합니다.
  7. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 고정 / Permeabilization 솔루션의 600 μl를 추가합니다.
  8. 5 분 동안 170 XG에 1 ml의 Permeabilization / 워시 버퍼와 원심 분리하는 과정을 2 회 반복한다.
  9. intracel의 경우 : CD68 FITC 항체 (1000 35)를 추가각 조건에 대한 Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕에적인 다공질 염색.
  10. CD68 항체 용액에 펠렛을 다시 중단하고 어둠 속에서 4 ° C에서 50 분을 품어.
  11. 5 분 동안 170 XG에 1 ml의 Permeabilization / 워시 버퍼와 원심 분리기로 씻으십시오.
  12. , Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕의 펠렛을 다시하면 일시 중지 CD86PE 항체 (35 : 1000)를 추가하고 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어.
  13. 5 분 동안 100 XG에서 버퍼와 원심 분리기 Permeabilization / 워시 1 ㎖를 추가하여 씻으십시오.
  14. Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕의 펠렛을 다시 중단하고 관 세포 계측법 흐름에 전달합니다.
  15. 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 측면 산란 빛 / 앞으로 산란 빛 (SSC / FSC) 창에 문이 살아있는 세포에서 CD45 염색을 결정합니다. 제 2 단계에서, CD68 + 세포에서 CD86 및 CD163의 발현을 분석한다.

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결과

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우리는 신장에서 대 식세포 침투의 증가 존재와 관련된 신 손상의 염증 실험 모델에서 대 식세포의 이질성을 분석 하였다. 이전 12보고 된이 모델에서 신장 손상, 위 스타 쥐 3 주 동안 물을 마시는 알도스테론 (1 mg의 -1 kg -1 일)을 더한 소금 (염화나트륨 1 %)의 투여에 의해 유도했다.

우리 실험 스케줄이도 1에 도시되어있다. 우선, 신장 세포를 분리 하였다 기계적 방법 및 콜라겐 (도 1a)와 상기 소화 효소를 사용. 그 후, 적혈구가 용해시켰다 신장 식세포는 유동 세포 계측법을 사용하여 검출 하였다. 세포 막 탐지 및 CD68 세포 염색 (그림 1B)에 대한 CD45, CD86 및 CD163에 ...

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토론

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대 식세포는 신장 질환 등 다양한 염증 질환에 중요한 역할을 이종 세포이다. 각 모집단 식세포는 사구체 신염, 당뇨 성 신장 병증 및 신장 암 14-16에서보고 된 바와 같이, 신장 손상의 발달에 다른 방식으로 기여하기 때문에 신장 질환 식세포 서브 세트의 특성에 대한 관심이 높아지고있다. 급성 신장 손상의 초기 단계에서, M1 식세포의 우세는 관상 괴사 및 염증 촉진이 관찰된다. 그러나, 이후의 단계에서 M2 식세포의 높은 함량은 염증을 해결하고 조직 재 형성에 참여 관찰된다. M1이 우세 할 따라서 증가 및 염증성 신장 손상을 영속 수 있지만 만성 신장 질환에서 M1과 M2의 대 식세포 모두 동시에 공존. 따라서, 신장 질환에서 대 식세포 아형의 병태 생리 학적 역할에 대한 지식을 증가하는 것이 중요하다. 면역 조직 화학적 연구는 강력한 방법으로 17 대 식세포 부분 집합의 비율을 확인할 수 없습니다. 따라서, 양적으로 다른 식세포 표현형을 결정하는 신장 염증 반응에 대한 이들 세포의...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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이 연구는 FIS/FEDER(Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 및 PI14/00883), 스페인 죽상동맥경화증 학회, 스페인 신장학회 및 Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT)의 보조금으로 후안 안토니오 모레노에게 지원되었습니다. FIS/FEDER는 PI14/00386 및 Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica를 Jesús Egido에 지원합니다. Fundaciòn Conchita Rabago to Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT)에서 Alfonso Rubio Navarro로.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
층류 후드더 빠르거나이에 상응하는 장비
원심분리기Hettich또는 동급 장비
유세포 분석기 (FACSAria)BD Biosciences
Fetal bovine serumBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
콜라겐 분해 효소시그마-알드리치12/1/9001
ACK 용해 버퍼Thermo Fisher ScientificA10492-01
유세포 분석 스트레이너BD Biosciences340626
Falcon 세포 스트레이너Thermo Fisher Scientific352340
유세포 분석 튜브Falcon3520525 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브
원심분리기 튜브Corning centristar430791
수조Memmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° C
고정/투과화 용액 또는 투과화/세척 완충액BD Biosciences554714
Rompum(자일라진)바이엘또는 이에 상응하는
케탈라(케타민)화이자또는 동급의
행크스 평형 염 용액시그마-알드리치H8264-500ML
식염수 브라운
Anti-CD45 (클론:OX-1) APC-Cy7Biolegend2022161:100
Anti-CD68 (클론: ED1) FITCBio-RADMCA341F35:1,000
anti-CD86 (클론: 24F) PEBiolegend20030735:1,000
anti-CD163 (클론: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342R4:100 희석
사체 염색 분자 프로브L34955희석 3:1,000
622415 염색/

참고문헌

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  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
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CD45 CD68CD86 CD163M1 M2

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