방법 논문

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

DOI:

10.3791/54604

⸱

2016년 11월 18일

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

초록

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이 원고는 자동 로봇 분배 시스템을 이용하여 하이드로 겔 bioink 이러한 기능으로 세포의 직접적인 전달 하였다 셀 가이드 기능의 도입을 설명한다. 이 세포는쪽으로 침전 및 기능을 감지 할 수 있습니다로 특정 bioink가 선정되었다. 분배 시스템은 보조 배압의 프린트 헤드를 사용하여 하이드로 겔 bioinks 생세포를 bioprints. 그러나, 날카롭게 스타일러스 또는 메스 프린트 헤드를 교체하여, 분배 시스템은 또한 표면 식각 지형 신호를 생성하기 위해 사용될 수있다. 스타일러스의 이동은 X, Y 10 μm의 단계 및 Z 방향으로 프로그램 될 수있다. 패터닝 홈은 홈 '방향과 정렬 긴 형태를 채택하도록 영향을, 중간 엽 줄기 세포를 배향 할 수 있었다. 패터닝은 직선, 동심원 및 정현파에 플로팅 소프트웨어를 사용하여 설계 될 수있다. 후속 절차, 석면에모세포 및 중간 엽 줄기 세포는 배압 구동 압출 헤드에 bioprinting 들면 2 % 젤라틴 bioink 현탁시켰다. 셀 베어링 bioink이어서, 에칭에 사용 된 것과 같은 프로그램 된 좌표를 사용하여 인쇄 하였다. bioprinted 셀 감지 에칭 홈의 방향을 따라 그 긴 방향으로 입증 된 바와 같이 에칭 된 기능에 대응할 수 있었다.

서론

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셀 배치의 고의적 인 패턴은 생체 내 세포 조직 1 모방 문화의 형성을 가능하게한다. 사실, 여러 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 연구는 공간 배치 2,3를 구성하여 도움을받을 수 있습니다. 대부분 패터닝 시스템은 촉진 또는 후속 수동 셀 증착하여 세포 부착을 방지하기위한 표면 개질 방법에 의존한다. Bioprinting 세포 분포 하나 이상의 공간 및 시간 제어를 제공합니다. 이러한 기능 이외에도 bioprinting 기하학적 복합체 지지체 (4)를 생성하기위한 기술적으로 간단 신속하고 비용 효과적인 방법 인 것으로 설명되었다. 그것은 컴퓨터 디자인 소프트웨어를 이용하고, 제조 공정 4에 셀의 도입을 허용한다.

Bioprinting 시스템의 기반이 레이저로 자신의 작업 원칙을 기준으로 분류 된, 잉크젯 기반 또는 4 압출 기반. 그것은 실제 시간 프레임 내에서 임상 적 4-6 크기의 조직 구조의 제작을 허용하기 때문에 압출 bioprinting가 가장 유망한 것으로 설명되었다. 이것은 셀 베어링 하이드로 bioink 기계적 또는 배압 이용한 압출 하나에 의해 수행된다. 여기에서 제시된 방법에서는, 배압을 채용 하였다. 언급 한 바와 같이, 세포를 cytocompatible bioink에 전달된다. 이러한 bioink는 유해한 전단 응력을 생성하지 않고 세포의 전달을 지원하고, 붕괴 또는 7-10 ( "잉크 블리드」라 함)의 확산없이 인쇄 된 트레이스의 무결성을 유지하기에 충분한 점성이어야한다.

그들의 접착면과 세포의 상호 작용은 세포 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 표면 토포 그래피는 셀 형상, 방향 (11), 그리고 심지어 표현형을 제어 할 수있다. 특히, 그루브 및 채널의 제조를 유도하는 것으로 입증되었다여러 세포 유형에 뻗어, 가늘고 긴 형태. 이 형태의 도입이 능성과 능성 세포의 표현형에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 홈에 정렬 될 때, 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 통해 합성 10,14-17 수축 표현형을 채택 심근 12,13 및 혈관 평활근 세포쪽으로 분화의 증거를 보여준다.

채널 또는 홈을 정렬 셀은 예를 깊은 반응성 이온 에칭, 전자빔 리소그래피, 직접 레이저 인쇄, 펨토초 레이저, 포토 리소그래피 및 플라즈마 건식 에칭 (18), 다수의 방법을 통하여 폴리머 표면에 생성 될 수있다. 이러한 접근은 종종 시간 소모 복잡한 장치를 필요로 생성 된 패턴의 형상에 한정 될 수있다. 또한, 그들은 bioprinting와 패턴을 동기화하지 않고 즉시 cellularization을 허용하지 않습니다. 자동화의 배위 제어 이동분배 시스템은 솔루션의 증착을 위해 복잡한 패턴을 따를 수 있습니다. 여기서 우리는 마이크로 제어 이동이 셀 방향에 대한 채널을 만드는 데 이용 될 수있는 방법을 보여줍니다. 날카롭게 스타일러스 또는 메스 압출 주사기 대신에 상기 프린트 헤드에 부착되고, 장치는 묘화 소프트웨어의지도하에 중합체 표면을 에칭 할 수있다. 상기 방법은 패턴 디자인에 융통성을 제공하며 일반적으로 폴리스티렌, PTFE, 폴리 카프로 락톤과 같은 생체 공학에 사용되는 고분자 재료에 적용 가능하다. 에칭에 후속 단계로, 세포를 긁어 홈에 직접 bioprinted 수있다. 여기에 사용 된 젤라틴 bioink는 추적을 유지하고 침착 세포가 에칭 기능을 감지 할 수 있도록 모두 할 수 있었다. 에칭 홈에 bioprinted 중간 엽 줄기 세포는 별개의 라인에서 그들을 따라 연장하는 것으로 입증되었다.

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프로토콜

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주 :이 프로토콜은 표면 에칭 (도 1b) 및 압출 기반 bioprinter (도 1C) 10 배압 이용한 로봇 분배 시스템 (도 1A)의 사용을 설명한다.

폴리스티렌 표면의 1. 수정

  1. 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 에칭 인쇄 모두의 높이 일관성을 망치고, 중앙 위쪽 활 경향 때문에 1mm 폴리스티렌 시트를 사용한다.
    주 : 폴리스티렌 시트 세포 부착을 위해 변형되지 않은 때, 플라즈마 처리가 수행된다.
  2. 산소 플라즈마 처리.
    1. 우선, 플라즈마 시스템에 연결된 산소 실린더 레귤레이터 2 바의 압력을 선택한다. 그런 다음 컴퓨터의 제어판에 다음 조건에 입력 플라즈마 시스템을 전환 : 150 W, 산소의 30 sscm, 10 분 (전력, 가스 흐름과 시간을 각각 참조).
    2. 폴리스티렌 substrat 배치플라즈마 챔버에 전자 문을 밀봉 제어판의 시작 버튼을 누릅니다. 소 태아 혈청에서 산소 플라즈마 처리 폴리스티렌 기판을 담가 3 회 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)를 세척하기 전에 2 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.

2. 프로그램의 인쇄 패턴

  1. 스타일러스 또는 메스로 먼저 에칭에 표면을 프로그램을 사용합니다.
    1. 스타일러스를 사용하는 경우가 쐐기 및 고정 될 때까지, 분배 주사기 (중 5 또는 10 ㎖)의 노즐에 (큰 관심과 함께 내부에서) 1.5 mm 직경의 섬유 바늘을 삽입합니다. 이 인쇄 아암의 클램프기구에 고정 될 수 있도록 메스를 사용하는 경우, 라운드 처리 메스를 선택한다.
      주 : 스타일러스가 더 메스 블레이드보다 곡선 패턴을 에칭.
    2. 먼저 bioprinted 배열을 만들려고 할 때, XY 좌표를 생성하기 위해 번호를 축으로 그래프 용지에 원하는 패턴을 스케치합니다. 그럼 내가스프레드 시트 소프트웨어 (그림 2)에 에칭 / bioprinted 패턴의 좌표 nput.
      참고 : "원하는 패턴"선형, S 자형, 또는 원형 등의 다양한 모양이 될 수 있습니다. 여기에 설명 된대로 선택은 심근에 중간 엽 줄기 세포의 분화에 대한 평행 직선 라인으로 필요한 실험 모델에 따라 달라집니다. 캐터 그래프 기능이 제안 플롯 패턴의 시각화를 허용한다.
    3. 인쇄 / 분배 소프트웨어를 엽니 다. "> 프로그램을 프로그램 추가"를 선택하여 프로그램을 설정하는 "포인트를 추가, 편집>"다음을. X를 보냅니다 y는 함수를 사용하여 소프트웨어 분배 / 인쇄에 스프레드 시트에서 얻은 좌표 값을 "복사 및 붙여 넣기".
    4. 표면 상으로 스타일러스 / 잉크 노즐을 배치하기 위해 각각 실행하기 전에 로봇의 "Z"의 높이를 보정.
      1. 인쇄 / 분배 소프트웨어에서의 "로봇"옵션을 선택 변경 모드 및 "클릭# 34; 그리고 "교육 모드"옵션을 활성화합니다. 일단 선택되면, 소프트웨어는 로봇의 "조그"기능을 가능하게한다.
      2. 조그하려면 먼저 메뉴 표시 줄에서 다음 명령을 선택하여 기본 위치로 로봇을 초기화; "로봇> 메카 초기화는"다음 "로봇> 조그"를 선택합니다. 입력 패턴의 기원에 정확하게 스타일러스를 배치하는 데 필요한 "X 및 Y 슬롯"의 (mm 단위) 수치.
      3. 다음으로, "Z 슬롯"의 입력 (mm 단위) 수치는 표면과 접촉 스타일러스 또는 프린팅 노즐을 배치하지만 굴곡하지 않거나 표면 덴트. 이 점은 "Z"시작 값으로 지정됩니다.
        주 : 각 홈의 깊이는 시스템의 Z 높이를 이용하여 용이하게 변경 될 수있다. 40, 80 및 170 ㎛ 인 홈은 1 mm 두께의 폴리스티렌 시이트 (도 4 및 표 1)의 표면으로 절단하는 것으로 입증된다.
    5. 상기 p-을 선택좌표 점의 각각에 대한 RINT 명령, 즉, "선 분배의 시작"은을 종료 로봇에 신호를 "선 분배의 끝을"중간 점을 지정하고 "전달 라인"첫 번째 점과 인쇄 개시를 정의 인쇄 실행.
    6. 상단 메뉴 표시 줄에서 다음과 명령을 선택하여 로봇에 프로그램을 통신 : "로봇> C & T 데이터를 보내기".
    7. "실행"모드로 로봇을 변경하여, 에칭 / 인쇄 실행을 시작합니다. 상단 메뉴 표시 줄에서 "> 실행 모드 스위치 모드 변경> 로봇"을 선택하여이 작업을 수행합니다.
    8. 로봇 디스펜서 콘솔에서 녹색 "시작 버튼"을 눌러 인쇄 절차를 시작합니다.

3. 준비 및 인쇄 세포 함유 젤라틴 Bioink을

  1. 최소 필수 중간 알파 중간 (αMEM)에서 2 % 젤라틴을 용해 (10 % FBS와 2 %의 항생제 / antimycot 보충2 시간 동안 60 ° C에서 IC)는 bioink 용액을 제조 하였다.
  2. 예비 배양 αMEM / 10 % FBS를 사용하여 10cm의 조직 배양 접시에 70 % 합류하는 중간 엽 줄기 세포를 발현하는 적색 형광 단백질 (RFP-MSC들). 37 ° C에서 5 분 동안 1X 트립신 EDTA 용액으로 중간 피막을 제거하여 서스펜션에 부착 된 세포를 분리.
  3. 5 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 1X PBS 0.5 ㎖ 중의 세포 펠렛을 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포 밀도를 계산.
  4. bioink 상온으로 식힌 후, 부드럽게 5 × 6 셀 ML -1의 최종 농도를 달성하기에 bioink RFP-엽 줄기 세포의 현탁액에 충분한 양으로 혼합한다.
  5. 밀봉 노즐 프린팅 주사기로 세포 베어링 bioink 붓는다. 인쇄 가능한 점도를 달성하기 위해 4 ° C에로드 된 주사기를 진정.
  6. 자동화 된에로드 된 주사기를 놓습니다로봇 분배 시스템의 공압 라인을 연결하고. 주사기 루어 봉인을 제거하고 인쇄 노즐을 부착합니다.
  7. 5mm에서 0.05 MPa의 배압을 사용하여 얇은 라인으로 cellularized bioinks 돌출 / 27 G 바늘 / 노즐을 통하여 10 ㎖ 주사기로부터 초 쓰기 속도가 미리 프로그램 증착 다음, 폴리스티렌 필름 표면 상 (원주 위에 추천 테이퍼) 2.1 단계에 설명 된 패턴은 사전 식각 홈 상에 cellularized bioink을 배치합니다.
  8. 실온에서 1 시간 배양 후, 도립 형광 현미경을 이용하여 시청하기 전에 24 시간 (세포가 감지 에칭 특성에 반응 할 수 있도록)에 전지 (10 % FBS 및 항생 물질로 보충) 10 ml의 성장 배지를 추가 부화 10 배 배율에서.

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결과

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대표적인 결과는 배압 보조 로봇 디스펜스 시스템은 표면 에칭 bioink 인쇄 (도 1 A) 모두를 행하는 압출 bioprinter 기초로 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 중합체 표면에 에칭 된 홈의 생성에 사용될 수 있으며, 후속하는 기능 (도 1 B 및 C)에 직접 베어링 셀 bioink를 인쇄.

에칭 및 인쇄 모두 곡선 응용 프로그램 (그림 3 AC)에 필요한 방사형 패턴, 프로그래밍 된 좌표로 선형의 인쇄를 가능하게하는 인쇄 / 분배 소프트웨어에 (그림 2) 입력을 결정한다. Z 축 설정 에칭 홈 깊이의 조절 (도 4 및 표 1)을 허용.

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토론

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이 과정의 중요한 단계는 프로세스가 기능에 세포 침전을 허용 출혈 / bioink 확산없이 인쇄 전단 응력 세포 사멸없이 세포를 제공하고 불필요한 리니지쪽으로 분화를 유발하지 않아야 같이 줄기 세포의 실제 bioprinting 전달된다.

예상 된 셀의 정렬이 발생하지 않으면, bioink 점도는 인쇄의 적합성을 평가한다. bioink는 세포 패턴 중합체 표면에 침전 할 수 있다는 것이 중요하다. bioink 중합체의 농도는 감소 될 수 있거나 그것의 온도는 점도를 감소시키고 셀의 침강을 촉진하는 (37 ° C에서 최대까지) 증가 하였다. 그러나 이러한 감소는 / 블리드 후 인쇄를 확산하기 위해 bioink의 원인이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 2 % 젤라틴 1X PBS에 용해 (V / w)을 사용하는 것이 좋습니다. 세포 농도가 인쇄 후 작게 나타나는 경우 인쇄에 의한 전단 응력을 위태롭게 할 수있다인쇄 된 세포 (7)의 생존. 이전과 같은 레사 주린...

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공개 사항

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저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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여기에 제시된 연구는 싱가포르 국립 연구 재단(Singapore National Research Foundation)의 CREATE 프로그램(NRF-Technion): 심장 복원 치료 연구 프로그램의 재생 의학 이니셔티브(Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program)와 과학기술연구청(A*STAR) 산하 과학공학연구위원회(SERC)의 공공 부문 기금(PSF) 2012의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Robotic 디스펜싱 시스템Janome2300N
플라즈마 기계Femto ScienceCovance
USB 현미경
광학 현미경OlympusIX71
Name 회사카탈로그 번호코멘트
소프트웨어
스프레드시트ExcelExcel
인쇄 좌표 소프트웨어JanomeJR C-Points
이미징 소프트웨어NIH(National Institutes of Health)ImageJ
NameCompany카탈로그 번호코멘트
Equipment
Stylus (Blade)OLFAAK-5
5ml 인쇄 주사기San-ei TechSH10LL-B
30G 인쇄 바늘San-ei TechSH30-0.25-B
1 mm 폴리스티렌 시트현지
태아 소 혈청Invitrogen 10270-098
인산염 완충 식염인vitrogen
젤라틴, 겔 강도 300, A형시그마 알드리치9000-70-8
&알파; MEMInvitrogen41061-029
항생제 항진균제Sigma AldrichA5955-100ML
적색 형광 단백질 중간엽 줄기 세포(RFP-MSC)Cyagen Biosciences IncorporationRASMX-01201
에서 구매 돼지 껍질에서 추출한 수

참고문헌

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