본 연구는 생물막 억제제와 Bacillus subtilis 다세포성에 미치는 영향을 연구하기 위한 재현 가능한 방법론의 개발을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 연구는 D-아미노산과 같은 저분자 생물막 억제제가 Bacillus subtilis 생물막의 발달 및 복원력에 미치는 영향을 연구하기 위한 다양한 방법론을 평가합니다. 먼저, 플랑크톤 성장에 대한 소분자 억제제의 효과와 생물막 형성에 대한 효과를 분리하기 위해 생물막 특이적 표적을 가진 소분자 억제제를 선택하는 방법이 제시됩니다. 다음으로, 접종 조건이 소분자 억제제에 대한 다세포 부유 B. subtilis 배양의 민감도에 어떤 영향을 미치는지에 초점을 맞춥니다. 결과는 D-아미노산과 같은 이러한 억제제의 보고된 효과의 불일치가 일관되지 않은 배양 전 조건에 기인함을 시사합니다. 또한, 항균 물질에 대한 생물막 내성에 대한 소분자 처리의 기여도를 평가하기 위해 최근에 개발된 프로토콜이 설명됩니다. 마지막으로, B. subtilis 생물막에서 세포와 주변 세포외 기질의 3차원 공간 배열을 분석하기 위해 주사 전자 현미경(SEM) 기술이 제시됩니다. SEM은 3차원 생물막 구조와 매트릭스 질감에 대한 통찰력을 용이하게 합니다. 여기에 설명된 방법의 조합은 생물막 억제제의 존재 및 부재 시 생물막 발달 연구에 크게 도움이 될 수 있으며 이러한 억제제의 작용 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.
서론
다세포 세균 지역 사회는 자연 및 인위적 환경에서 중요한 역할을하고, 유익하거나 매우 유해 할 수 있습니다. 이러한 다세포 콜로니 개별 세포 자체 생산 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 매트릭스에 매립되는 것을 특징으로하는 바이오 필름으로서 알려져있다. 허가제 강하게들이 정착 표면에 세포를 접착. 그들은 기계적 및 화학적 힘에 대항하는 방패 역할 및 셀룰러 통신 1을 촉진, 인접 셀 사이에 긴밀한 연락을 만듭니다. 생물막은 세포가 고도로 규제 사용하십시오 차별화 된 커뮤니티로 볼 수있다, 종 2-5에서뿐만 아니라, 지역 사회 내에서 활동을 조정하는 프로세스를 조율. 생물막 상태로 성장 플랑크톤 자유 생활 모드 간의 전환은 종종 개발 프로세스와 관련된다. 좋은 예는 그람 양성 토양 박테리아 고초균 및 따라서 인 undomesticated 균주는 biofilm 형성을 유도하는 발달 단계를 연구하는 강력한 모델 생물 역할을한다. 이 박테리아에서, 운동성 세포는 전문적인 작업 4를 수행 눈에 띄는 다세포 구조로 자신을 구성 할 수 있습니다. 셀들의 하나의 그룹은 매트릭스 생산자 엑소 폴리 사카 라이드 6 분비 아밀로이드 단백질 TASA 7,8, 표면 소수성 단백질 BslA 9,....
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프로토콜
1. 펠리클과 바이오 필름 콜로니 형성에 작은 분자 억제제의 효과 평가
- 칼슘 염화 철 (III) 클로라이드 수화물없이 정의 생물막 유도 MSgg 매체 (25)의 2 배 솔루션을 준비합니다. 여과 멸균 한 후, 염화칼슘을 추가한다. 매체는 직접적으로 사용할 준비가되거나 어둠 속에서 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- 실험의 날에 1 배 MSgg 희석을 준비합니다.
- (멸균 증류수 (펠리클) 또는 멸균 3 %의 고온 (80 ℃) 한천 (생물막)와 1 배 50 μM (펠리클) 또는 250 μM의 최종 농도로 철 (III) 클로라이드 수화물을 추가 배 MSgg 매체 희석 바이오 필름). 원하는 농도로 항생제 또는 작은 분자 억제제를 넣고 잘 섞는다. 예를 들어, 펠리클 또는 생물막을 확립 76.3 밀리미터 (10 ㎎ / ㎖) D 류신 원액 196.6 μL를 추가 30 ㎖ 0.5mm의 D 류신의 최종 농도를 얻었다.
아니TE는 :. 최종 1X MSgg 조성물은 표 1에 설명되어있는 원래의 레시피 (25)에 비해, 배지를 50㎍ / 트레오닌 mL 및 고체 MSgg 매체에 생물막 콜로니를 성장 철 농도가 주름 콜로니 형태를 최적화하기 위해 2.5 배 증가 하였다 포함 .
- (멸균 증류수 (펠리클) 또는 멸균 3 %의 고온 (80 ℃) 한천 (생물막)와 1 배 50 μM (펠리클) 또는 250 μM의 최종 농도로 철 (III) 클로라이드 수화물을 추가 배 MSgg 매체 희석 바이오 필름). 원하는 농도로 항생제 또는 작은 분자 억제제를 넣고 잘 섞는다. 예를 들어, 펠리클 또는 생물막을 확립 76.3 밀리미터 (10 ㎎ / ㎖) D 류신 원액 196.6 μL를 추가 30 ㎖ 0.5mm의 D 류신의 최종 농도를 얻었다.
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결과
펠리클 분석은 B의 높은 규제 및 동적 프로세스를 연구하는 하나의 방법이다 서브 틸리 다세포. 이 외에, 펠리클 분석 한 실험에서 단일 세포 배양 multidish 접시에 미리 시동 조건 또는 소분자 어느 농도의 범위를 테스트하는 데에 적합하다. 그러나, B. 서브 틸리 펠리클 형성은 예비 배양 조건에 민감하다 (예를 들어, 예비 - 배양의 성장 배지 및 성장 단계) 접종 비와 미리 배양 배지의 제거. 우리는 따라서 먼저 우리가 D-류신에 의한 페리 클 억제를 재현 할 수 실험 설정에 대한 검사. 우리의 결과는 세포 진탕 4 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ LB의 중간 대수 증식기 (단일 콜로니로 정의 풍부한 LB 배지에서 사전 배양 한 경우 D 류신 의해 재현 펠리클 억제를 얻을 수 있음을 보여 ), 스핀 다운하여 (1)에 사전 정의 MSgg 배지에 재현 탁 : 1000 inoculat이온 (그림 3A). 200에서 진탕하면서 3.......
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토론
바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 형태 강력하고 고도로 구조화 된 생물막 모두 액체 (펠리클)와 고체 배지에 (식민지). 따라서, 특정 바이오 필름 저해제의 작용 모드를 특성화하는 이상적인 모델 생물로서 기능한다. 고체 배지에서 세포 가장자리에 중심에서 방사 주름 등 펠리클에서 알 수없는 고유 한 특징을 가진 다세포 구조를 형성한다. 따라서, 펠리클과 식민지 B.을 연구 보완 시스템은 서브 틸리 다세포.
이 연구의 목적은 B. 개발하는 바이오 필름 (펠리클과 식민지) 억제를위한 서브 틸리 모델 시스템입니다. 몇 가지 단계는 생물막 방해 논문의 재현성을 위해 중요하다. 첫 번째 중요한 단계는 biofilm 형성에 미치는 영향으로 인해 플랑크톤 생활에서 자란 박테리아에 대한 일반적인 독성이 아니라고 확인하는 것입니다. 이는 등의 소정의 농도의 효과를 비교하여 고려 될 수있다플.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
전자 현미경 이미징은 Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging의 일부 지원을 받아 Weizmann Institute of Science의 전자 현미경 유닛에서 수행되었습니다. 이 연구는 또한 ISF I-CORE 보조금 152/1, Dan Kane 부부, Lois Rosen, Yeda-Sela 연구 보조금, Larson Charitable Foundation, Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research 보조금, 대체 연구 방법에 대한 보건부 보조금, 프랑스-이스라엘 협력 - Maimonide-Israel 연구 프로그램에 의해. IKG는 Rowland and Sylvia Career Development Chair를 수상했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| 인산 칼륨 monobasic | 시그마, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| 인산칼륨 이염기성 | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)프로판설폰산 | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| 마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트 | 머크, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| 염화칼슘 무수 | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| 염화 망간(II) 사수화물 | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| 철(III) 염화물 육수화물 | 시그마, 270.30g/월) | F2877-500G | |
| 염화아연 무수 | Acros Organics, 136.29g/mol | 424592500 | |
| 티아민 염산염 | 시그마, 337.27g/mol | T1270-100G | |
| L-트립토판 | Fisher Scientific, 204.1g/mol | BP395-100 | |
| L-페닐알라닌 | 시그마, 165.19g/mol | P5482-100G | |
| L-트레오닌 | 시그마, 119.12g/mol | T8625-100G | |
| 글리세롤 무수 | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-글루탐산 모노소듐 염 수화물 | 시그마, 169.11g/mol | G1626-1KG | |
| D-류신 | 시그마, 169.11g/mol | 855448-10G | |
| 에탄올 무수 | Gadot | 830000054 | |
| 면도날 | Eddison | NA | |
| 원형 셀룰로오스 여과지 | Whatman, 90mm | 1001-090 | |
| 글루타르알데히드 | EMS(Electron Micoscopy Science), 물 25% | 16220 | |
| 파라포름알데히드 | EMS, 물 | 15710 | |
| 나트륨 카코딜레이트 | 머크에 16%, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| 칼슘 클로라이드 2-하이드레이트 | 머크, 147.02 g/mol | ||
| 스텁 - 알루미늄 마운트 | EMS, 슬롯 헤드 | 75230 | |
| 탄소 접착 테이프 | EMS | 77825-12 | |
| 셰이커 37 ° C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| 원심분리기 | Eppendorf 탁상용 원심분리기 5424 | NA | |
| 디지털 소닉파이어, 모델 250, 더블 스텝 마이크로팁 | 브랜슨 NA | ||
| 인큐베이터 30 ° C | 바인더 | NA | |
| 인큐베이터 23 ° C | 바인더 | NA | |
| 필터 시스템, 500 ml, 폴리스티렌 | Cornig Incorporated | NA | |
| 로터리 쉐이커 - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 스퍼터 코터 | Edwards | NA | |
| CPD 030 임계점 건조기 | BAL-TEC | NA | |
| 환경 주사 전자 현미경 | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
참고문헌
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L....
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재인쇄 및 허가
