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방법 논문

의 유전자형

9.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54623

⸱

2016년 11월 4일

1Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

이 논문에서

요약

여기서 리보솜 스페이서 PCR(RS-PCR)은 소형 전기영동 시스템과 함께 적당한 비용으로 S. aureus를 유전형 분석하기 위한 빠르고 고분해능 방법으로 사용되어 높은 처리량을 허용합니다.

초록

리보솜 스페이서 PCR(RS-PCR)은 황색포도상구균(S. aureus)에 대한 고분해능 및 강력한 유전형 분석 방법으로, 적당한 비용으로 높은 처리량을 허용하므로 일상적인 목적으로 사용하기에 적합합니다. 최상의 분해능, 데이터 평가 및 데이터 관리를 위해서는 소형 전기영동 시스템이 필요합니다. 이러한 전기영동 시스템 및 자체 개발한 소프트웨어(여기에서 무료로 사용 가능)와 함께 유전자형에 대한 밴드 패턴의 할당은 표준화되고 간단합니다. DNA 추출은 간단하고(끓는 준비), 반응 설정이 쉬우며 모든 표준 PCR 기계에서 실행할 수 있습니다. PCR 사이클링은 램핑 및 연신율 시간이 길어지는 것을 제외하고는 일반적입니다. SPA 타이핑 및 MLST(Multi Locus Sequence Typing)와 비교할 때 RS-PCR은 DNA 염기서열분석이 필요하지 않아 분석을 상당히 단순화하고 높은 처리량을 허용합니다. 또한, S. aureus의 소 균주에 대한 해상도는 적어도 스파 타이핑만큼 우수하며 MLST 또는 펄스장 겔 전기영동(PFGE)보다 우수합니다. RS-PCR 데이터베이스에는 현재 총 141개의 유전자형 및 변이가 포함되어 있습니다. 이 방법은 소 유방염에 관여하는 S. aureus 균주의 독성 유전자 패턴, 전염성 및 병원성과 밀접한 관련이 있습니다. S. aureus 유전자형 B(GTB)는 전염성이 있으며 가축 문제를 일으켜 스위스와 다른 유럽 국가에서 큰 비용을 초래합니다. 스위스에서 관찰되는 다른 모든 유전자형은 개별 암소와 사육장을 감염시킵니다. RS-PCR에 의한 유전형 분석은 임상 수의학의 두 가지 핵심 요소인 소 유방 내 감염(IMI)에 관여하는 S. aureus의 역학 및 병원성 가능성에 대한 신뢰할 수 있는 예측을 가능하게 합니다. 적당한 비용 및 높은 시료 처리량과 함께 이러한 유익한 특성으로 인해 이 간행물의 목표는 다른 실험실에서 황색포도상구균(S. aureus)의 유전형 분석을 위한 RS-PCR을 쉽게 설정하고 실행할 수 있는 상세한 단계별 프로토콜을 제공하는 것입니다.

서론

황색 포도상 구균 (S. 구균) 소 1 유방 내 감염 (IMI)에 대한 전 세계적 책임을 가장 중요한 병원체로 알려져있다. 12 유럽 국가 그 소에 Cosandey 등. 3, 보스 등. (4)에 의해 푸르니에 등. 2 스위스 암소에서 설명하고 연구의 연구 S. 구균은 IMI는 유 전적으로 이질적인 그룹 소에서입니다. 16S-23S rRNA의 유전자 간 스페이서 영역 (RS-PCR)의 PCR 증폭에 의해, 17 유전자형 총 초기 101 역학적 분리 독립이 검출되었다. 다른 15 유전자형 GTS (가) 각 1 모든 균주의 % 4을 거의 발생하지 반면 유전자형 B 및 유전자형 C (GTC)는 (80 %) 가장 많았다. 유럽 레벨 3에서 GTB는 GTC는 GTF, GTI, 그리고 GTR은 분석 된 모든 균주 (N = 456)의 76 %를 포함하는 가장 중요한 유전자형이었다. GTB는 w 중부 유럽에 위치하고했다hereas 다른 유전자형 널리 전파되었다. 균주의 나머지 24 %는 그들 중 많은,하지만, 한 번만 관찰되었다 (41) 유전자형을 포함.

유전자형이 높은 유럽 수준으로 스위스에서뿐만 아니라, 그들의 독성 유전자 패턴과 연관되었는지 포니 외. 2 Cosandey 외. (3), Graber 외. (5)에 의한 연구는 또한 보여 주었다. 연구는 또한 S. 중 IMI 보급에 엄청난 차이를 밝혀 구균 GTB, GTC 다른 유전자형 2,5 : GTB 고려, 무리 암소의 87 %까지이 유전자형에 감염되었다. GTC의 다른 유전자형의 경우에, 그러나, IMI은 무리 1-2 소에서 발견되었다.

IMI S.에 의해 발생 구균은 일반적으로 해당 유방 동맥의 염증과 우유에서 염증 세포의 증가를 초래한다. 결과적으로, 체세포 CO우유에 unts (SCC), 대부분의 국가에서 우유 품질의 주요 지표는 감소 우유 가격 또는 납품 정지로 이어지는 증가한다.

포니 외. (2)의 RS-PCR 외에, 다른 입력 방법은 S.의 소 하위 유형 균주에 대해 기재 한 구균 8-11. 두 가지 일반적인 것들로는 스파 입력 (12)과 멀티 자취 그리기 순서 타이핑 (MLST) (13)를 포함한다. 후자 7 하우스 키핑 유전자의 염기 서열을 필요로하는 반면, 전 하나, 단백질 A에 대한 포도상 구균 스파 코딩하는 유전자의 가변 영역을 스페이서 DNA 시퀀싱에 기초한다. 이것은 하나의 12 일곱 PCR들 (13) 각각의 특정 장치를 사용하여 앰플 리콘 정화 시퀀싱 반응을 분석 한 후, 수행 될 필요가 있음을 의미한다. RS-PCR에 비해, 이러한 방법은 낮은 샘플 처리량과 높은 비용의 결과로 실험실에서 상당한 추가적인 노력이 필요합니다. 그만큼처리량은 PFGE 특히 낮습니다. S.의 소 균주에 대한 이러한 방법의 해상도를 고려 구균, RS-PCR 적어도 MLST 4 PFGE (15)보다 4 더 나은를 입력 스파만큼 좋은 것입니다.

바이너리 입력 (13)을 포함한 모든 이들 방법은 S.으로 인한 소 IMI의 발병에 더 통찰력을 얻기에 그 효과를 입증 구균,하지만 때문에 언급 제한으로 그들은 많은 임상 연구 덜 적합하다. 또한, RS-PCR에 의한 유전자형 포니 등에 의해 설명 된 바와 같이. 2 역학적 S.의 발병 가능성을 예측 신뢰성있게 구균, 소 IMI 임상 수의학에 두 개의 키 값을 포함했다.

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프로토콜

1. 황색 포도상 구균 분리 된 균주

  1. S.의 10 μl를 확산 구균 재고 문화 또는 하나의 식민지가 5 % 양 혈액 (BA)를 포함 컬럼비아 아가 플레이트에 선택 배지에 성장.
  2. 24 시간에 18 시간 동안 37 ° C에서 기적 품어.

2. DNA 추출

  1. 10 mM 트리스 - 염산 10 밀리미터 나 2 EDTA, pH가 8.5를 포함 TEL 버퍼를 준비합니다. 15 분 동안 121 ° C에서 분취 및 오토 클레이브를 준비합니다.
  2. 100 μl의 전화에서 멸균 플라스틱 루프 또는 멸균 나무 이쑤시개와에 resuspend를 사용하여 BA 1 식민지를 수집합니다. 스크류 캡 1.5 ml의 튜브를 사용합니다.
  3. 10 분 동안 95 ° C에서 품어. 그 후, 젖은 얼음에 즉시 샘플을 배치합니다.
  4. PCR (PCR 용 = 주형 DNA)에 적합한 H 2 O 100 : 샘플 1을 희석. 비 희석하고, 희석 된 샘플을 1 달 동안 -20 ℃에서 보관 될 수있다.

3. RS-PCR

    2 O, DNA 형성 촉매 마스터 믹스 μL 12.5, 2 μL의 G1 프라이머 10 μM, 2 μL L1 프라이머 10 μM, 순수의 약 30 NG에 해당하는 주형 DNA의 7 μL DNA 2.
  1. 표준 PCR의 자전거 타는 사람에서 다음 사이클 프로그램을 실행 : 15 분 7 분 55 ° C에서 2 분 램프 및 어닐링 다음에 1 분 94 ° C를 포함하는 27주기, 다음 95 ° C는. 추가의 2 분의 램프 후, 2 분 동안 72 ℃에서 연장된다. 4 ℃로 냉각 한 다음 10 분 동안 72 ° C에서 최종 연장 PCR을 종료합니다.
    주 : PCR 산물을 5 일 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
  2. 각 실행에 대한 RS-PCR, 즉 양성 대조군, 공지 된 유전자형 (일반적 GTB)와 샘플 및 대조군을 포함 (H 2 O).

4. 전기 영동

  1. 함께 DNA (MED 키트)에 대한 상용 소형 전기 키트를 사용하여PC와 설치된 소프트웨어에 연결된 bioanalyzer와. 조심스럽게 제조 업체의 대응 매뉴얼을 공부한다.
  2. 칩 프라이밍 스테이션을 설정하고 제조업체의 설명서에 따라 주사기 클립을 조정합니다.
  3. 제조업체의 설명서에 따라 젤 염색 믹스를 준비합니다.
  4. (제조자의 설명서에 따라) 젤 염색 믹스로드.
    1. 사용하기 전에 30 분 동안 실온으로 겔 염료 혼합물 평형.
    2. 칩 프라이밍 스테이션에서 새로운 DNA 칩을 넣습니다. 잘 표시 G.에서 젤 염료의 피펫 9 μl를
    3. 플런저 1 ml의에 위치되어 있는지 확인하고 칩 마중물 역을 닫습니다. 를 눌러 플런저은이 주사기 클립에 의해 개최 될 때까지. 30 초 후 주사기 클립을 해제에 대해 정확히 기다립니다.
    4. 5 초 동안 기다립니다. 천천히 1 ml의 위치로 플런저를 다시 잡아 당깁니다.
    5. 두 우물에서 열기 칩 프라이밍 스테이션과 젤 염료의 피펫 9 μl의는 'G'를 표시했다.
  5. 는 M로드arker
    1. 모든 12 샘플 우물에 잘 사다리에있는 마커의 피펫 5 μL. 빈이 13 우물 중 하나를 두지 마십시오.
  6. 래더 및 샘플을로드.
    1. 피펫 래더 기호 잘 표시에 DNA 사다리 1 μL.
    2. 샘플의 피펫 1 μl를 (사용 우물) 또는 탈 이온수 (사용하지 않는 우물) 1 μL.
    3. 2,400 rpm에서 1 분간 어댑터와 소용돌이에 수평으로 칩을 넣습니다.
    4. 5 분 이내에 bioanalyzer에서 칩을 실행합니다.
  7. 분석을 실행
    1. bioanalyzer와 연결된 컴퓨터를 시작합니다. 소프트웨어를 엽니 다.
    2. bioanalyzer의 뚜껑을 열고 (칩이 한 방향으로 만 맞는) 칩 홀더에 칩을 놓습니다. 조심스럽게 뚜껑을 닫습니다.
    3. 소프트웨어의 악기 맥락에서 "전기 영동을"> "dsDNA"> "DNA 7500"을 선택합니다. 소프트웨어의 현재 파일 접두사를 그대로 사용하거나 수정합니다.
    4. 소프트웨어에있는 시작 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어에서 샘플 이름을 입력합니다. 칩 실행이 완료되면 (후 약 30 분) 실행 메시지의 끝은 bioanalyzer 소프트웨어에 나타납니다.
    5. 제조자의 지시에 따라 bioanalyzer의 전극과 상기 칩을 제거하고 세정.

5. 전기 영동 프로필에서 유전자형을 유추

  1. (소프트웨어는 저자에서 자유롭게 사용할 수 있습니다)을 마 소프트웨어를로드합니다.
  2. > "가져 오기 참조 데이터", "파일"다음 마할 소프트웨어로 가져 오기 참조 데이터
  3. bioanalyzer 소프트웨어의 데이터 컨텍스트에서 실행되는 전기를 엽니 다. 하나의 샘플의 전기 영동 프로파일을 선택합니다.
  4. 관련 피크를 확인합니다.
    1. '도구'> '평균 형광 "관련 피크를 확인하기 위해 마 소프트웨어를 사용합니다. 은 "형광"상자에 삽입형광 값은 그들이 bioanalyzer 소프트웨어로부터 판독 될 수있는 형광 단위 (FU)로 나타내었다. 오름차순으로 가장 높은 형광 4 (3) 피크를 삽입하고 쉼표 (,)로 구분. 예 : 126,130,132,137.
      참고 : 모든 이들 피크의 FU의이 bioanalyzer 소프트웨어로 표시하는 경우, 그들은 음모에서 그들을 판독하여 추정 할 필요가있다.
  5. 은 "계산"버튼을 누릅니다. 관찰 된 형광은 박스 "최소 피크 높이"에 소정의 값을 초과하면, 피크가 적합하다.
  6. 유전자형을 추론.
    1. 마할 텍스트 상자 "입력 봉우리 (BP)"를 오름차순으로 모든 관련 피크의 염기쌍의 크기와 쉼표 (,)로 구분으로 삽입합니다. 예 : 440,462,519,579,637.
      주 : 이러한 크기의 피크는 모든 bioanalyzer 소프트웨어에 의해 지시되는 경우에, 플롯 그들을 판독하여 추정 될 필요가있다.
  7. 은 "계산"버튼을 누릅니다.
  8. 목록에서상자, 최소 제곱 마할 라 노비스 거리 "D2M"를 찾습니다. 이 ≥0.05 인 오른쪽에 대응하는 P 값은 그 확률 귀무 가설 H 0이 거부되었는지 ≥5 % 인 경우 (H 0 : 관찰 기준 프로파일이 동일) 관찰 된 프로파일과 동일하도록 허용되는 것을 의미 지정된 유전자형의 기준 프로파일.
  9. D2M 최소화하지만 해당 P 값의 필드가 비어 있으면, 확률 <5 % H 0을 거부한다.
    참고 :이 D2M 최소한 있지만 프로파일이 동일하지 않은 것을 의미합니다. 이러한 결과는 비 평균 전기 영동 조건에서 발생할 수 있습니다.
    1. 이러한 편차를 보정하려면 값 395을 "피크 (BP) 관찰"텍스트 상자에 삽입하고 "계산"버튼을 누릅니다. 최소한의 D2M와 대응하는 P 값 ≥0.05 다시 확인합니다. 성공하지 않으면, 값 405, 415 및 425을보십시오.
      참고 : 때때로 작은 단계도 있습니다가리키는. 관찰 된 프로파일이 기준 데이터가 존재하지 여전히 성공적이지 않으면 새로운 유전자형 또는 변형 될 수있다.
  10. 다양한 프로필
    1. 반복 별도로 5.6 각 전기 프로파일 5.9에 단계를 반복합니다.

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결과

유전자형과 그 변종의 정의

식별 된 모든 유전자형에서 하나 이상의 주파수 대역이 상이한 전기 영동 프로파일은 새로운 유전자형으로 간주된다. 새로운 유전자형은 이름과 확장 푸르니에 등에 따라. 5 GTAZ의 유전자형 GTAA 다음 GTZ의 유전자형 GTA, 선도 및 GTBA GTBZ, 그리고 GTCC에 GTCA 현재된다. 한 밴드의 변화는 유전자형 변형으로 간주된다. 그것은 유전자형 (예를 들어, GTRI, GTRII)의 이름 뒤에 상 첨부 로마 숫자로 표시됩니다. 총, 참조 데이터베이스에 141 유전자형 및 변형은 현재 존재한다.

푸르니에 등으로, RS-PCR. 5...

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토론

RS-PCR (> 30 순수한 DNA / 분석 겨)에서 DNA의 초과가있을 때 전체 공정의 가장 중요한 단계는이. 그 피크가 모두 기준선에서 시작 및 종료하는 경우 일반적으로, 프로파일의 해상도가 최적이다. 두 개의 피크가 서로 너무 가까이있는 경우, 해상도는 완전하지 않습니다. 수동 식별을 필요되도록 이러한 조건 bioanalyzer 소프트웨어 부적절한 피크 식별을 초래할 수있다.

BP 또는 FU로 표현 모든 눈에 띄게 분리와 관련 피크는 추가 분석을 위해 포함되어 있습니다. 너무 많은 템플릿 DNA RS는-PCR 넓은 피크가 발생하기 때문에 피크의 중복 및 장애 해결을 피크. 또한, 이동은 유전형이 더 이상 추론 수 없도록 잘못 증가 크기 피크 느려질 선도이다. 마지막으로, 관련성의 피크의 수가 크다. 3 개 이상의 봉우리와 프로파일의 경우, 최대 형광과 피크는 일반적으로 150 FU를 초과 할 수 없습니다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, J. Naskova의 훌륭한 작업에 대해 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
트리스 (하이드 록시 메틸) - 아미노메탄머크1.08382.0500Mw = 121.14 g / mol
Titriplex III머크1.08418.0250Mw = 372.24 g / mol; 물질은 Na2EDTA·와 동일합니다. 2H2O
염산 5 mol/LMerck1.09911.0001
콜롬비아 한천+5% 양 혈액bioMé rieux43049
Agilent DNA7500 KitAgilent Technologies5067-1504
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2940CA
Agilent 2100 전문가 소프트웨어Agilent Technologies
HotStarTaq 마스터 믹스 Qiagen203445
프라이머 L1Mycrosinth5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
프라이머 G1Mycrosinth5'GAA GTC GTA ACA AGG3'

참고문헌

  1. Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
  2. Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
  3. Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
  4. Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
  5. Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
  6. Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
  7. Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
  8. Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
  9. Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
  10. Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
  11. Tavakol, M., et al. Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands. Acta Vet.Scand. 54, 28(2012).
  12. Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
  13. Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
  14. Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
  15. Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).

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