의 유전자형<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt;에 의해 리보솜 스페이서 PCR (RS-PCR)

요약

여기서 리보솜 스페이서 PCR(RS-PCR)은 소형 전기영동 시스템과 함께 적당한 비용으로 S. aureus를 유전형 분석하기 위한 빠르고 고분해능 방법으로 사용되어 높은 처리량을 허용합니다.

초록

리보솜 스페이서 PCR(RS-PCR)은 황색포도상구균(S. aureus)에 대한 고분해능 및 강력한 유전형 분석 방법으로, 적당한 비용으로 높은 처리량을 허용하므로 일상적인 목적으로 사용하기에 적합합니다. 최상의 분해능, 데이터 평가 및 데이터 관리를 위해서는 소형 전기영동 시스템이 필요합니다. 이러한 전기영동 시스템 및 자체 개발한 소프트웨어(여기에서 무료로 사용 가능)와 함께 유전자형에 대한 밴드 패턴의 할당은 표준화되고 간단합니다. DNA 추출은 간단하고(끓는 준비), 반응 설정이 쉬우며 모든 표준 PCR 기계에서 실행할 수 있습니다. PCR 사이클링은 램핑 및 연신율 시간이 길어지는 것을 제외하고는 일반적입니다. SPA 타이핑 및 MLST(Multi Locus Sequence Typing)와 비교할 때 RS-PCR은 DNA 염기서열분석이 필요하지 않아 분석을 상당히 단순화하고 높은 처리량을 허용합니다. 또한, S. aureus의 소 균주에 대한 해상도는 적어도 스파 타이핑만큼 우수하며 MLST 또는 펄스장 겔 전기영동(PFGE)보다 우수합니다. RS-PCR 데이터베이스에는 현재 총 141개의 유전자형 및 변이가 포함되어 있습니다. 이 방법은 소 유방염에 관여하는 S. aureus 균주의 독성 유전자 패턴, 전염성 및 병원성과 밀접한 관련이 있습니다. S. aureus 유전자형 B(GTB)는 전염성이 있으며 가축 문제를 일으켜 스위스와 다른 유럽 국가에서 큰 비용을 초래합니다. 스위스에서 관찰되는 다른 모든 유전자형은 개별 암소와 사육장을 감염시킵니다. RS-PCR에 의한 유전형 분석은 임상 수의학의 두 가지 핵심 요소인 소 유방 내 감염(IMI)에 관여하는 S. aureus의 역학 및 병원성 가능성에 대한 신뢰할 수 있는 예측을 가능하게 합니다. 적당한 비용 및 높은 시료 처리량과 함께 이러한 유익한 특성으로 인해 이 간행물의 목표는 다른 실험실에서 황색포도상구균(S. aureus)의 유전형 분석을 위한 RS-PCR을 쉽게 설정하고 실행할 수 있는 상세한 단계별 프로토콜을 제공하는 것입니다.

서론

황색 포도상 구균 (S. 구균) 소 ¹ 유방 내 감염 (IMI)에 대한 전 세계적 책임을 가장 중요한 병원체로 알려져있다. 12 유럽 국가 그 소에 Cosandey 등. ^3, 보스 등. ^(4)에 의해 푸르니에 등. ² 스위스 암소에서 설명하고 연구의 연구 S. 구균은 IMI는 유 전적으로 이질적인 그룹 소에서입니다. 16S-23S rRNA의 유전자 간 스페이서 영역 (RS-PCR)의 PCR 증폭에 의해, 17 유전자형 총 초기 101 역학적 분리 ^독립이 검출되었다. 다른 15 유전자형 GTS (가) 각 1 모든 균주의 % 4을 거의 발생하지 반면 유전자형 B 및 유전자형 C (GTC)는 (80 %) 가장 많았다. 유럽 레벨 ^3에서 GTB는 GTC는 GTF, GTI, 그리고 GTR은 분석 된 모든 균주 (N = 456)의 76 %를 포함하는 가장 중요한 유전자형이었다. GTB는 w 중부 유럽에 위치하고했다hereas 다른 유전자형 널리 전파되었다. 균주의 나머지 24 %는 그들 중 많은,하지만, 한 번만 관찰되었다 (41) 유전자형을 포함.

프로토콜

1. 황색 포도상 구균 분리 된 균주

1. S.의 10 μl를 확산 구균 재고 문화 또는 하나의 식민지가 5 % 양 혈액 (BA)를 포함 컬럼비아 아가 플레이트에 선택 배지에 성장.
2. 24 시간에 18 시간 동안 37 ° C에서 기적 품어.

2. DNA 추출

1. 10 mM 트리스 - 염산 10 밀리미터 나 ₂ EDTA, pH가 8.5를 포함 TEL 버퍼를 준비합니다. 15 분 동안 121 ° C에서 분취 및 오토 클레이브를 준비합니다.
2. 100 μl의 전화에서 멸균 플라스틱 루프 또는 멸균 나무 이쑤시개와에 resuspend를 사용하여 BA 1 식민지를 수집합니다. 스크류 캡 1.5 ml의 튜브를 사용합니다.
3. 10 분 동안 95 ° C에서 품어. 그 후, 젖은 얼음에 즉시 샘플을 배치합니다.
4. PCR (PCR 용 = 주형 DNA)에 적합한 H ₂ O 100 : 샘플 1을 희석. 비 희석하고, 희석 된 샘플을 1 달 동안 -20 ℃에서 보관 될 수있다.

3. RS-PCR

결과

유전자형과 그 변종의 정의

식별 된 모든 유전자형에서 하나 이상의 주파수 대역이 상이한 전기 영동 프로파일은 새로운 유전자형으로 간주된다. 새로운 유전자형은 이름과 확장 푸르니에 등에 따라. ⁵ GTAZ의 유전자형 GTAA 다음 GTZ의 유전자형 GTA, 선도 및 GTBA GTBZ, 그리고 GTCC에 GTCA 현재된다. 한 밴드의 변화는 유전자형 변형으로 간주된다. 그것은 유전자형 (예를 들어, GTRI, GTRII)의 이름 뒤에 상 첨부 로마 숫자로 표시됩니다. 총, 참조 데이터베이스에 141 유전자형 및 변형은 현재 존재한다.

푸르니에 등으로, RS-PCR. ⁵.......

토론

RS-PCR (> 30 순수한 DNA / 분석 겨)에서 DNA의 초과가있을 때 전체 공정의 가장 중요한 ^{단계는이.} 그 피크가 모두 기준선에서 시작 및 종료하는 경우 일반적으로, 프로파일의 해상도가 최적이다. 두 개의 피크가 서로 너무 가까이있는 경우, 해상도는 완전하지 않습니다. 수동 식별을 필요되도록 이러한 조건 bioanalyzer 소프트웨어 부적절한 피크 식별을 초래할 수있다.

BP 또는 FU로 표현 모든 눈에 띄게 분리와 관련 피크는 추가 분석을 위해 포함되어 있습니다. 너무 많은 템플릿 DNA RS는-PCR 넓은 피크가 발생하기 때문에 피크의 중복 및 장애 해결을 피크. 또한, 이동은 유전형이 더 이상 추론 수 없도록 잘못 증가 크기 피크 느려질 선도이다. 마지막으로, 관련성의 피크의 수가 크다. 3 개 이상의 봉우리와 프로파일의 경우, 최대 형광과 피크는 일반적으로 150 FU를 초과 할 수 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트리스 (하이드 록시 메틸) - 아미노메탄	머크	1.08382.0500	Mw = 121.14 g / mol
Titriplex III	머크	1.08418.0250	Mw = 372.24 g / mol; 물질은 Na2EDTA·와 동일합니다. 2H2O
염산 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
콜롬비아 한천+5% 양 혈액	bioMé rieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 전문가 소프트웨어	Agilent Technologies
HotStarTaq 마스터 믹스	Qiagen	203445
프라이머 L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
프라이머 G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'