이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Transduction-transplantation은 마우스의 인간 혈액 악성 종양을 모델링하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 기술은 조혈 세포에서 관심 유전자의 발현을 초래하며 정상 및/또는 악성 조혈에서 유전자의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최근 골수증식성 신생물(MPN)에서 확인된 칼레티큘린(CALR) 돌연변이를 예로 사용하여 형질도입-이식을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 5-플루루라실(5-FU) 처리된 기증자 마우스의 전체 골수 세포에 돌연변이 CALR을 암호화하는 레트로바이러스로 transduction하고 치사적으로 방사선 조사된 syngeneic 숙주에 이식합니다. 돌연변이 CALR을 발현하는 공여자 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표시됩니다. 이식된 마우스는 말초 혈액의 혈소판 상승, 골수 내 거핵세포 증식, 골수 섬유증을 포함한 MPN 표현형을 발달시킵니다. 레트로바이러스를 생성하고, 바이러스 역가를 계산하고, 전체 골수 세포를 형질도입하고, 방사선 조사를 받은 수용 마우스에 이식하는 방법에 대한 단계별 설명을 제공합니다.
서론
전달-이식 생쥐에서 혈액 악성 종양을 모델링하는 유용한 방법이다. 이 기술은 다시 BCR-ABL1의 이소성 표현이 충실 마우스 (1) 만성 골수성 백혈병을 요점을 되풀이 수있는 최초의 시범 데이트 골수의 악성 종양을 공부에 특히 가치가있다. 이 기술은 이후에 골수 증식 성 신 생물 (MPN)에 돌연변이 JAK2 V617F 및 MPL W515K / L의 광범위한 연구를 촉진하고있다.
MPN 성숙한 골수 세포 및 골수 섬유증의 과잉 특징 혈액 종양의 그룹이다. 이 질환은 일반적으로 릴화 Jak2, MPL, 또는 CALR 하나의 체세포 돌연변이를 획득 한 조혈 줄기 세포의 클론 확장에서 발생한다. 전달 이식 JAK2 V617F 및 MPL W515K / L 모델 전시 진성 다혈 구증 및 골수 섬유증 (2)의 임상 적 특징 - 5 </ SUP>. 최근, 칼레 티 큘린 돌연변이 MPN의 마우스 모델은 또한 전달 이식 방법 (6)로 생성되었다. 이러한 마우스는 증가 된 혈소판, 거핵구 증가 수, 골수 섬유증 필수적인 혈소판과 같은 질환을 개발한다. 함께, 이러한 모델은 MPN의....
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프로토콜
이 연구는 승인 및 캘리포니아 대학교 어바인에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 권고에 따라 실시 하였다. 모든 절차는 이소 플루 란 마취하에 수행 된 모든 노력은 고통을 최소화 하였다.
Ecotropic 레트로 바이러스의 1 세대
- 상업적 맥시 프렙 키트 또는 세슘 클로라이드 정제를 이용하여 적어도 1 μg의 / μL의 농도로 고품질 플라스미드를 준비한다.
주의 : 이러한는 MSCV 백본 (CALR 7,8이 경우에) 관심의 유전자를 코딩 벡터 및 (등 GFP, 네오) 선택의 마커뿐만 아니라 ecotropic 포장 플라스미드, 인코딩 개그-POL-ENV를 포함 (함 여기 플라스미드 등). - DMEM에서 해동 및 확장 낮은 통로 293T 세포는 페니실린 / 스트렙토 마이신 (D10)와 10 % FBS와 L 글루타민 보충. 가습에서 10cm 조직 배양 처리 접시에 접시 5 × 10 6 세포조직 배양, 37 ℃ 배양기에서 5 % CO 2.
- 문화 293T 세포를 확장합니다. 형질 전환 전날에, 진공 플라스크에 1 ml의 PBS와 대기음 뜨는을 추가하여 세포를 씻으십시오.
- 세포를 Trypsinize하....
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결과
형질 도입 이식 기술은 세포가 관심있는 유전자를 발현과받는 마우스의 조혈 재구성을 초래한다. 그림 1은 MPN 돌연변이 칼레 티 큘린의 전달 이식 마우스 모델의 개요를 보여줍니다. 간단히, CALRwt 또는 CALRdel52을 표현 레트로 바이러스는 C57B / 6 기증자 마우스에서 BM 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 형질 세포는 첫 번째 달 후 이식시 발생 조사 C57B / 6받는 사람 마우스와 공여 세포 생착에 이식된다. 10개월 이식 후 - 질병 표현형의 증거는 명백 3개월 6에서 골수 섬유증 다음 마우스 전시는 혈소판과 거핵 세포를 증가 후 이식을하게된다. 기증자의 세포가 생착하지 않을 경우, 마우스의 죽음은 이식 다음 첫 2 주 이내에 발생할 수 있습니다. 주입 동안 불량한 주사 또는 외상 외에 다른 기술적 오류가 변환되는 가난한 생착을 일으킬 수D 세포 또는 마우스 죽음. 이 대부분의 조혈 세포가받는 사람이 아닌 기증자의 기원.......
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토론
이 프로토콜은 질병의 드라이버로 CALRdel52 변이 골수 섬유증으로 진행과 필수적인 혈소판 같은 질환 요점을 되풀이하는 생쥐 골수 이식을 수행하는 방법에 대한 상세한 설명을 제공한다. 혈소판 증가, 거핵 세포의 확장 및 골수 섬유증에 CALRdel52 결과를 발현하는 세포의 이식에 성공. 골수 이식은 다단계 과정이기 때문에 기술적 오류 관심 또는 마우스 사망의 유전자를 발현하는 세포의 생착 불량한 않도록 방지 할 수있는 단계를 인식하는 것이 중요하다.
종종 간과 성공적으로 전달 이식 모델에 중요한 요인은 바이러스의 품질입니다. 고 역가 바이러스 관심 유전자를 발현하는 세포를 적게 될 것이다 낮은 역가와 관련된 바이러스를 사용하는 반면, 양호한 전달 효율 및 질환 따라서 강한 근거를 용이하게한다. 전달 efficiency 바이러스 및 폴리 브렌과 retronectin 같은 세포 사이의 접촉을 증가 시약에 의해 향상 될 수있다. 간 성상 세포의 형질 도입이 바이러스에도 고농도.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 V Foundation Scholar(AGF)와 MPN Research Foundation(AGF)의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, 일컬어 pCL-Eco | Addgene | 12371 | EcoPack 2-293과 같은 레트로바이러스 패키징 세포주를 EcoPak 플라스미드 및 표준 293T 세포 대신 사용할 수 있습니다. 추가 γ-레트로바이러스 엔벨로프 및 패키징 플라스미드는 Addgene 및 기타 회사에서 사용할 수 있습니다. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | 추가 &감마;-레트로바이러스 전달 플라스미드는 Addgene 등에서 구할 수 있습니다. |
| 소모품 | |||
| 27 G x 1/2" 바늘 | BD | 305620 | |
| 소 태아 혈청 | Corning | MT-35-010-CV | |
| 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | 수제 |
| PBS | 코닝 | MT-21-031-CV | |
| 10cm 접시 | Fisher | 172931 | |
| 15ml 원추형 튜브 | Fisher | 12565268 | |
| 60mm 접시 | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µ m 세포 여과기 | Fisher | 22363549 | |
| 50ml 원뿔형 튜브 | Fisher | 12565270 | |
| 6웰 플레이트 | Fisher | 130184 | |
| FACS 튜브 | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μ m 주사기 필터 | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK 버퍼 | Lonza | 10-548E | 집에서 만들 수 있습니다 |
| 재조합 쥐 IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| 재조합 쥐 IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| 재조합 쥐 SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection 시약 |
| 1.5ml 원심분리기 튜브 | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X선 조사기 |
참고문헌
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G.
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재인쇄 및 허가
