방법 논문

의 강성 측정 전의 VIVO 마우스 대동맥

DOI:

10.3791/54630

⸱

2016년 10월 19일

 ,  ,  ,  , 
1Program in Translational Biomechanics, Institute of Translational Medicine and Therapeutics, University of Pennsylvania, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Department of Physiology, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

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우리는 원자력 현미경을 사용하여 마우스에서 대동맥을 분리하고 탄성 계수를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

초록

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동맥 경직은 중요한 위험 인자 및 심혈관 질환 바이오 마커 및 노화의 특징이다. 원자력 현미경 (AFM)은 하드 (플라스틱, 유리, 금속 등)의 임의의 기판 위에 세포 표면에 이르기까지 다양한 재료에 대한 점탄성 기계적 성질을 특성화하기위한 다용도 분석 도구이다. 널리 세포의 강성을 측정하는 데 사용되지만 자주 대동맥의 강성을 측정하는 데 사용되었다. 본 논문에서는 무부하 마우스 동맥의 생체 탄성 계수를 측정하기 위해 접촉 모드 AFM을 사용하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 마우스 대동맥의 분리를 위해 우리의 절차를 설명하고 AFM 분석에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이것은 레이저 빔의 배향, 스프링 상수 및 AFM 프로브의 편향 감도를 교정 한 힘 곡선 취득 단계가 설명되어있다. 우리는 또한 데이터 analy에 대한 자세한 프로토콜을 제공힘 곡선의 동생.

서론

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동맥의 생체역학적 특성은 심혈관 질환(CVD)과 노화에 중요한 결정 요인입니다. 콜레스테롤과 무관한 주요 위험 요소이자 CVD의 진행 지표인 동맥 경직은 혈관 손상, 죽상 경화증, 연령 및 당뇨병1-8에서 증가합니다. 동맥벽 경직은 혈관 평활근 세포의 역분화(dedifferentiation), 이동(migration) 및 증식(prosecration) 증가와 관련이 있다9-12. 또한, 동맥 경직도 증가는 대식세포 접착력 향상1, 내피 투과성 및 백혈구 전이(leukocyte transmigration) 13, 혈관벽 리모델링(vessel wall remodeling) 14,15과 관련이 있다. 따라서, CVD의 동맥 경직 또는 노화를 예방할 수 있는 치료법은 높은 혈중 콜레스테롤을 감소시켜 CVD를 치료하는 현재 이용 가능한 약리학적 중재를 보완할 수 있습니다.

AFM은 다양한 물리 및 생물학적 응용 분야에 사용되는 강력한 분석 도구입니다. AFM은 고해상도 이미지를 얻고 조직및 세포 1,2,10,16,17과 같은 부드러운 생물학적 샘플의 생체 역학적 특성을 나노 단위 수준에서 높은 정확도로 특성화하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. AFM의 가장 큰 장점은 살아있는 세포와 함께 사용할 수 있다는 사실입니다.

이 논문은 AFM을 사용하여 생체 외 마우스 동맥의 탄성 계수를 측정하는 방법을 설명합니다. 설명된 방법은 1) 마우스 동맥(하행 대동맥 및 대동맥궁)을 적절하게 분리하고 2) AFM으로 이러한 조직의 탄성 계수를 측정하는 방법을 보여줍니다. 동맥에서 하중이 가해지지 않은 탄성 계수를 측정하면 혈관 손상, CVD 및 노화에 대한 반응으로 발생하는 세포외 기질(ECM)의 변화를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

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프로토콜

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이 연구에서 동물 연구는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 방법들은 승인 된 지침에 따라 수행 하였다.

1. 마우스 및 대동맥의 분리 준비

  1. 복강 - (2 밀리그램 / kg 일) - (- 100 ㎎ / ㎏ 80), 자일 라진 (8-10 ㎎ / ㎏) 및 케타민 아세 프로 마진을 가진 마우스를 마취. 꼬리 핀치 테스트와 마취를 확인합니다. 마우스가 완전 마취 후에 경부 전위로 마우스를 안락사.
  2. 그 뒷면에 마우스를 놓고 해부 보드에 마우스를 고정. 70 %와 복부 영역을 청소 (V는 / v)의 에탄올을 정리합니다.
  3. 중반 선에서 피부를 조이고 복부에 중간 크기의 미세 가위와 작은 초기 절개를합니다. 집게로 피부를 누른 상태에서 흉골에 복부의 피부와 복막을 잘라 중간 크기의 미세 가위를 사용합니다.
  4. b의 갈비뼈를 절단중간 크기의 미세 가위와 OTH면. 조심스럽게 작은 크기의 미세 가위로 폐와 간을 제거하고 심장과 대동맥을 둡니다. 해부 현미경으로 마우스와 해부 보드를 전송합니다.
  5. 작은 집게로 대동맥 주위의 지방을 잡고 작은 가위를 사용하여 조심스럽게 대동맥 주위에 지방을 버려야합니다.
  6. 부드럽게, 집게로 대동맥을 잡아 바로 복부 대동맥 위, 상행 대동맥과 하행 대동맥의 끝에서 또 다른 컷의 시작 부분에 작은 크기의 미세 가위와 한 컷을합니다.
  7. (칼슘과 마그네슘없이 PBS) 1X 인산 완충 생리 식염수를 포함하는 60 mm 접시에 해부 대동맥을 전송합니다.
  8. 작은 크기의 미세 가위를 사용하여 대동맥에서 남아있는 지방 조직을 멀리 해부 계속합니다. 길이 방향으로 대동맥을 열고 작은 가위를 사용합니다.
  9. 하행 대동맥과 aorti의 작은 조각 (~ 2 × 4 mm)를 잘라 작은 크기의 미세 가위를 사용하여AFM 분석을위한 C 아치 (그림 1). 60 mm 플라스틱 접시에 조직을두고 PBS의 드롭에 습기를 유지.

figure-protocol-1
그림 1. 마우스의 다른 대동맥 세그먼트의 위치를 나타내는 화상은 대동맥은 다이어프램 중심부로부터 분리하고, 하행 대동맥의 일부 및 대동맥 궁은 탄성 계수를 결정하기 위해 사용되었다. 스케일 바, 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

원자 현미경 측정 2. 준비 조직 샘플

  1. 조심스럽게 대동맥을 건드리지 않고 실험실-닦아 사용하여 PBS를 제거합니다. 조직의 내강면이 위를 향하도록 특정합니다.
  2. 조심스럽게 추가로 플레이트에 열린 대동맥의 양쪽 끝에 접착제 5 보내고 - 겔 로딩 팁 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 10 μl를 (그림 2).
    주 : 단단히 양단 조직을 연결하는데 필요한 접착제의 양은 경험적으로 결정되어야한다. 이 대동맥이 과정에서 뻗어되지 않는 것이 중요합니다.
  3. 이 접혀 또는 부동하지 않았는지 확인하기 위해 접착 대동맥을 확인합니다. 대동맥에 접착제를 공기가 건조 후 (30-60 초), 부드럽게 PBS를 추가하고 샘플을 잠수함.
    참고 : - 조직 분석을 위해 준비되는 동안 수행 될 수 준비 원자 현미경 (5 3 단계).

figure-protocol-2
도 2 : 대동맥 세그먼트 만화는 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 60-mm 배양 접시에 붙인 시아 노 아크릴 레이트 접착제는 AFM 측정에 대비 대동맥 샘플의 가장자리에 적용되고있다..COM / 파일 / ftp_upload / 54630 / 54630fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 프로브로드

  1. 프로브 부하 스탠드에 유체 프로브 홀더를 탑재합니다.
  2. 핀셋을 사용하여 구형 팁 질화규소 AFM 프로브 (0.06 N / m 캔틸레버)를 밀어 상기 프로브 홀더 (우리는 1 μm의 직경의 SiO2 입자를 사용하고 있지만, 큰 크기가 사용될 수도 있음). 원자 현미경 탐침 단단히 프로브 홀더에 고정되어 있는지 확인합니다.
  3. 원자 현미경 헤드의 마운트 Z-스캐너에 프로브 홀더를 밀어 프로브 홀더가 단단하게 고정되어 있는지 확인합니다.

4. 프로브상의 레이저 정렬

  1. 원자 현미경 소프트웨어를 엽니 다. 소프트웨어에 대한 실험 유형을 선택, 실험의 종류는 유체 모드에 문의 유체 및 실험에서 모드를 문의하는 모드, 실험 그룹에 문의하십시오. 로드 애 썼는데을 클릭소프트웨어의 eriment; 이 레이저 켜집니다.
  2. 50 mm 유리 바닥 접시에 증류수 3 ㎖를 추가하고 레이저 정렬 장치의 무대에서 접시를 놓습니다. 이 장치는 캔틸레버의 후면 상에 레이저 빔을 포커싱 프로세스를 단순화한다.
  3. 레이저 정렬 장치의 레이저 정렬 장치 및 전원 상에 직립 위치에 AFM 헤드를 탑재합니다. AFM 팁의 액 적을 형성하기 위해 증류수 약 50 μL를 추가한다.
  4. AFM 팁을 접시에 물과 접촉하도록 조이스틱을 이용하여, AFM 헤드 저하. 접촉이 접시에 AFM 팁과 물 사이에 있지 않은 경우 접촉이 될 때까지 부드럽게 요리를 올립니다. AFM 팁이 정렬 장치의 LCD 화면에서보기에 오도록 포커스 밝기 XY 위치를 조정한다.
  5. 강자성 헤드의 레이저 위치 손잡이를 조정함으로써 AFM 프로브의 팁 상에 레이저 스폿을 위치. 멋 부리다를 조정 AFM 헤드 검출기 위치 노브를 사용0과 -1 사이의 값 V까지 포토 다이오드의 이온 수직 편향에 대해 획득되며, 0 ~ V는 수평 편향 얻어진다.
  6. 레이저 합 신호가 극대화되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 반복 스텝 4.5은 AFM 팁상의 레이저 빔의 최대 합 신호를 얻기 위해 광 다이오드의 위치의 위치를 ​​재조정한다.
    주 : 4.5 단계가 반복되는 경우에도, 최대 합 신호를 획득하기 위해 상기 프로브 홀더의 AFM 프로브의 위치를 변경하는 것이 필요할 수있다.

5. AFM 프로브의 편향 감도 및 스프링 상수 보정

  1. forcep와 60 mm 배양 접시에 스크래치를 확인하고 증류수로 접시를 채우십시오. 샘플 홀더 접시에 배양 접시를 놓습니다. 이 경우, 거꾸로 현미경의 동력 XY 스캔 무대에서 접시를 탑재합니다.
  2. 이 영상 중 보안 유지하기 위해 판의 상부에 자기 판 홀더를 배치합니다.
  3. 딸깍 하는 소리 참고 :이 AFM 팁을 파괴 방지로이 단계는 매우 중요합니다.
  4. 현미경 단계에 AFM의 머리를 놓습니다.
  5. 접시에 스크래치에 초점 현미경을 사용합니다. 조이스틱을 사용하거나 천천히 조심스럽게 PBS에 AFM 탐침을 낮추기 위해, 탐색 메뉴에서 '아래로'화살표를 클릭합니다. 약간 접시에 스크래치 위의 머리를 놓습니다.
    주 : AFM 헤드의 초기 위치는 샘플에 가까운 경우, 현저하게 감소 될 시간이 결합.
  6. 결합 전에, AFM 팁에 레이저 빔과 같은 필요한 최대 SUM 신호를 얻기 위해 광 다이오드의 위치의 위치를 ​​재 조정.
  7. 설정 메뉴에서 변경 프로브를 클릭하여 팁 유형을 선택합니다.
    8. 매개 변수를 확인하고 매개 변수를 설정 클릭 : 256 1 Hz에서, 샘플 / 라인 0으로 스캔 속도를 크기를 스캔 편향 설정 값 20 nm이다. 참여를 클릭합니다. 프로브는 판의 표면에 닿을 때까지 체결 상태 창이 열린 상태로 유지됩니다. 프로브를 결합 한 후, 램프를 클릭합니다.
  8. 매개 변수 검사 도구 모음 메뉴에서 모드를 확장하고 설정을 클릭 : 2 Hz로 램프 속도, 나노 (500) 사이에 1 μm의 램프 크기, 256 샘플의 수, 팁 반경은 500 nm의, 0.5 (에 샘플 푸 아송의 비율은 재료를 가정 측정 할 20 내지 100 nm의 상대와 트리거 임계 값을 0으로 팁 절반 각도, 트리거 모드) 완벽하게 비압축성이다.
  9. obta하기 위해 램프 툴바 메뉴에 램프가 연속 클릭플레이트 (그림 3A)에 힘 곡선입니다. 이 힘 곡선에서, 편향 오류에 채널 1을 설정합니다.
    참고 :이 소프트웨어가 Z 위치 대 수직 편향과 같은 결과를 그래프로 할 수 있습니다.
    1. 힘 곡선의 왼쪽 또는 오른쪽 끝을 클릭하고 힘 곡선 (그림 3A, 점선 레드 라인)의 선형 영역을 포함하도록 커서를 끕니다. 직선으로 적합하기 위해 경 사진 지역의 경계를 표시하기 위해이 두 줄을 사용합니다.
  10. 도구 모음에서 램프를 선택하고 업데이트 감도을 클릭합니다. 값을 기록하고이 단계를 네 번 더 반복한다. 도구 모음에서 보정을 선택하고 감지기를 클릭합니다. 입력 편향 감도 상자에 다섯 개의 측정 값의 평균 값.
  11. 원자 현미경 헤드를 높이기 위해 3 회 - 2를 철회 클릭합니다. 이 단계를 방지하는 것이 중요AFM 팁과 열적 튜닝 과정에서 플레이트 사이의 상호 작용. 도구 모음에서 열 조정을 클릭합니다.
  12. 직사각형 캔틸레버를위한 V 모양의 캔틸레버 1.144과 1.106에 100 kHz에서 (이 정보는 제조업체의 카탈로그에서 얻을 수있다)과 편향 감도 보정 - 열 1의 조정 범위를 설정합니다.
  13. 열전달 조정 메뉴에서 열 조정 곡선 (그림 3B)를 얻기 위해 데이터를 획득 클릭합니다. 강자성 소프트웨어를 사용 장소 레드 피팅에 대한 경계를 정의하는 그래프의 에지에서 마우스를 드래그 (도 3b에 도시 된 바와 같이) 곡선의 양쪽에 점선. 선택 중 하나 로렌 시안 (공기) 이상의 데이터를 맞는에 따라 단순 조화 진동자 (유체) 모델입니다.
  14. 맞춤 데이터, 다음 봄 K를 계산하고이 값을 저장을 클릭합니다. 레스프링 정수 교정을 여러 번 이탄 및 평균 값을 사용합니다. 여러 번 취소를 클릭합니다.
  15. 현미경 단계에서 AFM 헤드를 제거하고 정렬 장치에 놓습니다. 현미경 무대에서 접시를 제거합니다.

figure-protocol-3
그림 3 : AFM 프로브의 교정에 사용되는 AFM 강제 곡선. (A)의 대표적인 AFM 력 곡선 (검량선). 수직 적색의 힘 곡선의 연장 부는 라인 캔틸레버 편향 감도를 결정하는 데 사용되었다 점선. (B) 앞서 20 설명한 캔틸레버의 스프링 정수를 산출하는 데 사용되는 단순 조화 진동자 맞는 그래프. 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전.

전의 VIVO의 탄성 계수 측정

  1. 현미경 무대에서 대동맥 조직을 포함하는 60 mm 배양 접시를 놓고, 자기 접시 홀더 플레이트를 고정합니다.
  2. 현미경 단계에 AFM의 머리를 놓습니다. 원자 현미경 탐침은 대동맥과 접촉하지 않는 특정하게 조심스럽게 PBS로 접촉하고, 메 니스 커스 (meniscus)를 형성한다. 필요한 경우, 정렬 부에 AFM 헤드를 배치하고, 접촉을 방지 현미경 스테이지의 AFM 헤드를 배치하기에 충분한 여유가있을 때까지 퇴각 클릭.
  3. 이동을 클릭합니다. 천천히 AFM 탐침을 낮추고, 조이스틱을 사용하거나 화살표를 '아래'를 클릭하면 대동맥 위의 캔틸레버를 찾습니다. 필요한 경우, AFM 헤드 검출기 위치 노브를 이용하여 포토 다이오드의 위치를 ​​조정한다.
  4. 캔틸레버는 대동맥과 접촉 할 수 있도록 참여를 클릭합니다.
  5. 일단대동맥이 종사하고, 압전 센터가 안정적인지 확인하고 램프를 클릭합니다. 압전 센터가 변동되는 경우,이 거짓 참여의 결과 일 수있다. 프로브를 철회하고 조금씩 포토 다이오드에 레이저의 수직 오프셋을 증가 (~ 0.5 V) 다시 참여.
    1. 프로브까지 샘플 표면 위에있는 경우에도 수동으로 가까운 시료 표면에 탐침을 낮추고 다시 결합 전에. 이전 단계 변동을 제거하지 않으면, 프로브를 교환하려고.
  6. 3 μm의, 상대에 대한 트리거 모드와 100 nm의 트리거 임계 값에 램프 크기를 설정하고 램프 연속 클릭합니다. 탐침과 시료 사이의 접촉 지점은 Z 램프 사이클의 ¾ 하부 대략 중앙에 발생하는 것을 관찰한다. 이 관찰되지 않는 경우, 시료로부터 분리 필요에 따라 램프의 크기를 조정하고, 샘플을 다시 도달.
  7. 메뉴 바에서 현미경을 클릭 한 다음 설정을 작동시킵니다. 스핀들 모터는 30 μm의 철수로 변경합니다. 경사대 툴바 메뉴의 램프가 연속 클릭합니다.
  8. 힘 곡선을 관찰 한 후, 메뉴 바에서 캡처를 클릭 한 다음 파일 이름을 캡처합니다. 결말 ".000"(이 추가 캡처 한 파일이 1 숫자가 증가 할 수 있습니다)에 원하는 파일 이름을 입력합니다. 지정된 폴더를 선택하고 데이터를 저장합니다.
  9. 캡처 도구 모음 메뉴에서 캡처를 클릭합니다. 다음 이동을 철회하고 클릭합니다. 대동맥의 다른 영역에 캔틸레버의 위치를 조이스틱 또는 소프트웨어 컨트롤을 사용 (다음 초기 측정 지점도 4 참조).
  10. , 램프를 작동 클릭하고 각각 연속 램핑. 힘 곡선을 관찰 한 후, 중지를 클릭하십시오 캡처합니다.
  11. 6.10 - 반복 6.9 단계를 반복합니다. . 지역 당 캡처 적어도 5 측정은 그림 4 주와 같이 우리는 일반적으로 15 수집 - 그림 4와 같이 각각 각 조직의 5 가지 사항 - 3 25 힘 곡선을.

figure-protocol-4
. 그림 4 : 전체의 강성을 확보하기 위해 각 동맥에 - 5 가지 사항 (5 분야 1 -) - 3에서 25 번 외팔보 접근과 조직 들여 쓰기 (지역 1)의 만화는이 AFM 측정은 15까지 반복된다 조직 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 데이터 분석

  1. 오픈 힘 곡선 분석 소프트웨어.
  2. CL싫어지기 찾기 및 메뉴 바에서 열기 및 파일을 두 번 클릭 분석 할 수 있습니다.
  3. 편향 감도, 상수 봄, 팁 반경, 팁 절반 각도와 푸 아송의 비율을 확인하려면 도구 모음 메뉴에서 수정 포스 매개 변수를 클릭합니다. 매개 변수가 옆에있는 확인란을 선택하고 새 값 열에서 올바른 값을 입력 변경합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다.
  4. 힘 곡선에 잡음이있는 경우 방향이 0 일 3과 필터 주문에, 평균 점수를 확장하기 위해, 박스 카 필터를 클릭하고 입력을 설정합니다. 데이터를 원활하게 실행을 클릭합니다.
  5. 메뉴 바에서 기준 수정을 클릭하고 1 일에 방향을 확장하기위한 입력, 강제로 플롯 장치, 분리에 입력, 수정 주문을 설정하고 기준 소스를 확장 실행을 클릭합니다.
  6. 도구 모음 메뉴에서 들여 쓰기를 클릭하고 맞춤 변수를 취급하는 포인트 기반, 접점 알고리즘을 문의하는 확장, 맞춤 방법에 활성 곡선에 대한 입력을 설정, No로 접착 포스, 맥스 포스 맞춤 경계 30 %, 최소 강제 맞춤 경계에 포함 0 % 헤르츠 (구형)에 맞춤 모델입니다.
    주 : 우리의 측정에서, 팁 및 샘플 (후퇴 곡선 캔틸레버의 음 편향) 사이에 상당한 밀착성이 거의 관찰되지 않았다. 접착 성이 관찰되는 경우에, 해당 모델 (DMT 또는 JKR)를 분석 (18,19)에 사용되어야한다.
  7. 영률의 값을 저장한다. 3 개의 각각의 영 (탄성) 모듈러스 분석-도 4에 도시 된 바와 같이 서로 작은 거리 이내의 영역 (5) (5 면적당 힘 곡선).
    참고 : 아티팩트를 제거 영의 계수> 100 kPa의를 제외하려면 (보통 ~ 총 측정의 10 %)를 분석.
  8. 3 각 평균 영률 값 계산 - (측정 된) 5 영역 및 전체 대동맥 대한 평균 탄성 계수를 계산하기 위해이 값을 사용한다.
    주 : 적어도 3 개의 더 자주 4-6 개별 대동맥은 동맥 경화의 정확한 평가를 획득하기 위해 사용된다. 최종 결과는 "N"독립적 인 실험의 평균 ± SEM으로 그려진다. 필요한 대동맥의 정확한 수는 물론, 필요한 정확성 수준에 따라 달라질 것이다.

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결과

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도 5a는 6 개월, 남성 C57BL / 6 마우스에서 하강 (흉부) 대동맥의 위상 콘트라스트 이미지를 보여줍니다. AFM 캔틸레버 직접 조직 위의 자리에 들여 쓰기를위한 준비.도 5b 및도 5c는 접촉 모드 AFM 들여 쓰기에 의해 얻어진 대표 힘 곡선을 보여줍니다. 도 5b 및도 5c에 도시 된 그린 선 구체 대한 헤르츠 모델을 이용하여 얻어지는 최적 곡선을 나타낸다. 본문에 설명 된도 5d에서, 하행 대동맥 대동맥 아치의 평균 강성 세 개별 쥐에서 측정 하였다. 하행 대동맥과 대동맥 궁은 ​​각각 층류 및 방해 흐름의 영역을 표현합니다. 그럼에도 불구하고, 자신의 (기계적으로 언로드) 탄성 계수는 ​​AFM의 결정에 따라 유사하다.

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토론

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AFM 압입은 세포 및 조직의 강성 (탄성 계수)을 특성화하는데 사용될 수있다. 본 논문에서는 마우스의 하행 대동맥과 대동맥 궁을 분리하고이 동맥 영역 생체의 탄성 계수를 결정하는 자세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 지금 요약하고이 문서에 설명 된 방법의 기술적 인 문제 및 제한 사항에 대해 설명합니다.

몇 가지 기술적 인 문제는 고립과 자신의 작고 얇은 자연 주어진 마우스 대동맥의 분석에 발생할 수 있습니다. 세정 동맥 길이 방향으로 개방되는 경우, 치료는 탄성률 데이터 수집 내막 (내강 표면)을 방해하지 않도록주의해야한다. 최종 샘플 접시 과잉 PBS는 접시에 동맥의 적절한 접착을 방지하고,이 접착 전에 동맥을 건드리지 않고 종이 티슈를 이용하여 조심스럽게 제거해야한다. 단리 동맥 종이 티슈 WHI 스틱 수 있다는 점에 유의제작 과도한 PBS를 제거하려고하고,이 샘플이 손상 될 수 있습니다. 배양 접시에 접착 동맥 동안, 동맥 연신되지 않는 것이 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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AFM 분석은 펜실베이니아 근육 연구소(Pennsylvania Muscle Institute)와 펜실베이니아 대학교 페렐만 의과대학(Perelman School of Medicine)의 중개 의학 및 치료 연구소(Institute for Translational Medicine and Therapeutics)에서 지원하는 기기에서 수행되었습니다. 이 작업은 NIH 보조금 HL62250 및 AG047373의 지원을 받았습니다. YHB는 미국심장협회(American Heart Association)의 박사 후 펠로우십의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BioScope Catalyst AFM 시스템Bruker
Nikon Eclipse TE 200 도립 현미경Nikon Instruments
질화 규소 AFM 프로브Novascan TechnologiesPT. 시02. SN.10.06 N/m 캔틸레버; 1 &마이크로; m SiO2 입자
Dumont #5 집게Fine Science Tools11251-10섹션 1.4
참조 Dumont #5SF 집게Fine Science Tools11252-00섹션 참조 1.8
Fine Scissors-ToughCutFine Science Tools14058-11섹션 1.4 (중간 크기)
Vannas-Tü 참조; bingen 스프링 가위Fine Science Tools15008-08섹션 참조 1.6 (소형)
60mm TC 처리 세포 배양 접시Corning353004
Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 1xCorning21-031-CM칼슘 및 마그네슘 없음
Krazy Glue 인스턴트 다목적 액체Krazy GlueKG58548R섹션 2.2 참조
젤 로딩 팁, 1 - 200 &마이크로; lFisher02-707-139섹션 2.2
참조 Tip TweezersElectron Microscopy Sciences78092-CP섹션 3.2 참조
50mm, 투명 벽 유리 바닥 접시TED PELLA14027-20섹션 4.4 참조

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189(2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57(2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122(2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974(2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101(2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. , e3733(2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

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