방법 논문

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

DOI:

10.3791/54641

⸱

2016년 11월 4일

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

이 논문에서

요약

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우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

초록

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Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 유세포 분석으로 검출된 표현형을 기반으로 특정 세포 집단을 정제하는 기술입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 다른 세포의 영향 없이 단일 세포 집단의 특성을 더 잘 이해할 수 있습니다. MCS(magnetic-activated cell sorting)와 같은 다른 세포 농축 방법과 비교했을 때, FACS는 유세포 분석에 의한 표현형 검출 능력으로 인해 세포 분리에 더 유연하고 정확합니다. 또한 FACS는 일반적으로 여러 세포 집단을 동시에 분리할 수 있어 실험의 효율성과 다양성을 향상시킵니다. FACS에는 몇 가지 제한 사항이 있지만 in vitro 및 in vivo 환경 모두에서 기능 연구를 위해 세포를 정제하는 데 널리 사용되었습니다. 여기에서는 pDC의 체외 기능 연구를 위해 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스의 골수에서 매우 희귀한 면역 세포 집단인 plasmacytoid dendritic cells(pDC)를 분리하기 위해 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 프로토콜을 보고합니다.

서론

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선택한 세포 집단을 다른 세포와 효율적으로 분리하면 다른 방법으로는 불가능할 수 있는 집단에 대한 연구를 수행할 수 있습니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 고순도로 흥미로운 세포 집단을 농축하는 방법입니다. 1,2 서로 다른 세포 유형은 일반적으로 한 세포 집단을 다른 세포 집단과 구별할 수 있는 원형질막에서 고유한 분자 또는 여러 분자의 고유한 조합을 발현합니다. 이러한 세포 표면 분자가 특정 형광 접합 항체에 결합하면 유세포 분석기/분류기라고 하는 검출 기계는 단일 세포 수준에서 세포의 다른 분자 마커를 나타내는 다양한 형광 염료의 광 신호를 여기시키고 감지할 수 있습니다. 광 신호의 존재(해당 표면 분자의 양의 발현을 나타냄) 또는 광 신호의 부재(분자의 음의 발현을 나타냄)로 구성되는 결합된 정보는 세포의 표현형을 정의합니다. 검출기를 통과한 후, 동일한 관심 표현형을 가진 세포는 전하를 기반으로 지정된 수집 튜브로 전환됩니다.

FACS는 농축할 인구가 형광으로 표지되어 있는 한 다양한 연구에 광범위하게 적용됩니다. 3-7 장내 미생물총(microbiota)8에서 면역글로불린(Ig)A로 코팅된 박테리아와 IgA가 코팅되지 않은 박테리아를 분리하고 형광 단백질을 발현하는 ....

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프로토콜

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참고 : MRL / MP-의 Fas의 LPR 루푸스 발생하기 쉬운 쥐 사육과 버지니아 공대 (동물 복지 보증 번호에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 요구 사항에 다음과 같은 특정 병원균이없는 시설에서 유지되었다 (MRL / LPR) : A3208-01). 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 모든 동물 실험은 IACUC 프로토콜 # 12-062 하에서 수행 하였다.

1. 세포 배양 매체 및 정렬 버퍼

  1. 완전한 세포 배지 (C10)를 10 % 소 태아 혈청, 1 mM 피루브산 나트륨, 1 내지 100 % MEM 비 필수 아미노산, 10 mM의 HEPES, 55 μM 2- 머 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민 및 보충 된 RPMI 1640을 사용하여 준비 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신.
  2. 정렬 버퍼를 준비 된 10 mM HEPES가 보충 1X 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)를 사용하여 (가득 HBSS) 2.5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민0.05 밀리미터의 MgCl 2, 0.2 U / ㎖ DNase의 I.

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결과

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우리는 높은 순도 골수 PDC를 풍부하게하는 것을 목표로하고 IFNα를 생산하는 능력에 대한 PDC의 기능 변화를 연구하는 젊은이와 노인 모두의 MRL / LPR의 루푸스 발생하기 쉬운 마우스에서 다른 세포 유형의 영향없이. 사용 된 첫 번째 정제 전략은 그림 1과 같이 농축 후 만 7.75 % 순도 주도, MCS했다. MCS에 비해 FACS은 96.4 %로 높은 순도의 PDC 농후. 높은 순도를 보장하기 위해, 단계적으로 게이팅 전략을 수행 하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 단핵 세포 게이트 전방 산란 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC) 파라미터에 의해 먼지로부터 분리 하였다. FSC 폭 (FSC-W) FSC 높이 대 (FSC-H) 및 SSC-H 대 SSC-W를 사용하여 단일 세포 집합체에 의해 생성 된 거짓 양성 신호를 방지하기 위해 게이트 하였다. 라이브 하나의 세포가 다음 DA.......

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토론

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이 원고에 설명된 프로토콜은 IFNα 생성 능력을 유지하는 살아있는 pDC의 고순도 농축을 위한 것입니다. 이 프로토콜의 응용에는 세포 및 분자 기능의 연구를 위한 MRL/lpr의 골수 및 임의의 다른 마우스 계통으로부터 pDC 및/또는 임의의 다른 단핵 세포의 정제가 포함되나 이에 국한되지 않습니다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 분류된 pDC의 높은 생존력과 순도를 보장하는 것입니다. 첫 번째 핵심 단계는 뼈에서 골수를 방출하는 것입니다. 골수 세포 손상을 최소화하려면 뼈를 부수는 대신 뼈를 부드럽게 깨뜨리고 유봉을 저어주는 것이 중요합니다. 두 번째 핵심 단계는 밀도 구배 배지로 단핵 세포를 농축하는 것입니다. 세포 현탁액을 로딩하는 동안 하상(밀도 구배 배지)과 상상(세포 현탁액) 사이에 명확한 인터페이스를 설정하는 것이 중요합니다. 원심분리 조건은 주로 단핵 세포를 포함하는 버피 코트 층의 형성에도 중요합니다. 원심분리 후 뼈 파편, 적혈구 및 고밀도 호중구는 버피 코트층에서 제외되어 튜브 바닥에 머무릅니다. 세.......

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공개 사항

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저자는 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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유세포 분석 핵심 시설을 사용해 주신 Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine의 유세포 분석 실험실에 감사드립니다. 이 작업은 XML의 스타트업 펀드로 지원되었습니다. XL은 생물의학 및 수의학 대학원 프로그램의 Stamps Fellow입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
태아 소 혈청HyCloneSH30396.03
Sodium pyruvategibco by life technologies11360-070
MEM non-essential amino acidsgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-메르캅토에탄올Gibco21985-023
L-글루타민 생명 과학의 gibco25030-164
페니실린-스트렙토마이신생명 과학의 gibco15140-122
1x 행크' s 균형 잡힌 소금 솔루션 Gibco by Life Technologies14175-079
MACS BSA 재고 솔루션Miltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
적혈구 (RBC) 용해 완충액 eBioscience00-4300-54
밀도 그라데이션 중간 GEHealthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
안티-마우스 CD19-PEBD Pharmingen553786
안티-마우스 CD11c-PEeBioscience12-0114-82
안티-마우스 CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
안티-마우스 PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
안티-마우스 B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouseMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I 유세포 분석기 BD Biosciences643178
BD FACS Diva 버전 6BD Biosciences
Life Technologies의

참고문헌

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  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Sta....

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재인쇄 및 허가

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Fluorescence activated Cell SortingPlasmacytoid Dendritic CellsBone Marrow IsolationCell Surface StainingForward Scatter AnalysisSide Scatter AnalysisMagnetic Activated Cell SortingLupus prone MiceIFNalpha ProductionCell Purity Analysis

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