방법 논문

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

DOI:

10.3791/54641

⸱

2016년 11월 4일

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

이 논문에서

요약

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우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

초록

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Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 유세포 분석으로 검출된 표현형을 기반으로 특정 세포 집단을 정제하는 기술입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 다른 세포의 영향 없이 단일 세포 집단의 특성을 더 잘 이해할 수 있습니다. MCS(magnetic-activated cell sorting)와 같은 다른 세포 농축 방법과 비교했을 때, FACS는 유세포 분석에 의한 표현형 검출 능력으로 인해 세포 분리에 더 유연하고 정확합니다. 또한 FACS는 일반적으로 여러 세포 집단을 동시에 분리할 수 있어 실험의 효율성과 다양성을 향상시킵니다. FACS에는 몇 가지 제한 사항이 있지만 in vitro 및 in vivo 환경 모두에서 기능 연구를 위해 세포를 정제하는 데 널리 사용되었습니다. 여기에서는 pDC의 체외 기능 연구를 위해 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스의 골수에서 매우 희귀한 면역 세포 집단인 plasmacytoid dendritic cells(pDC)를 분리하기 위해 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 프로토콜을 보고합니다.

서론

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선택한 세포 집단을 다른 세포와 효율적으로 분리하면 다른 방법으로는 불가능할 수 있는 집단에 대한 연구를 수행할 수 있습니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 고순도로 흥미로운 세포 집단을 농축하는 방법입니다. 1,2 서로 다른 세포 유형은 일반적으로 한 세포 집단을 다른 세포 집단과 구별할 수 있는 원형질막에서 고유한 분자 또는 여러 분자의 고유한 조합을 발현합니다. 이러한 세포 표면 분자가 특정 형광 접합 항체에 결합하면 유세포 분석기/분류기라고 하는 검출 기계는 단일 세포 수준에서 세포의 다른 분자 마커를 나타내는 다양한 형광 염료의 광 신호를 여기시키고 감지할 수 있습니다. 광 신호의 존재(해당 표면 분자의 양의 발현을 나타냄) 또는 광 신호의 부재(분자의 음의 발현을 나타냄)로 구성되는 결합된 정보는 세포의 표현형을 정의합니다. 검출기를 통과한 후, 동일한 관심 표현형을 가진 세포는 전하를 기반으로 지정된 수집 튜브로 전환됩니다.

FACS는 농축할 인구가 형광으로 표지되어 있는 한 다양한 연구에 광범위하게 적용됩니다. 3-7 장내 미생물총(microbiota)8에서 면역글로불린(Ig)A로 코팅된 박테리아와 IgA가 코팅되지 않은 박테리아를 분리하고 형광 단백질을 발현하는 유전자 조작 세포 집단을 분류하는 데 사용되었습니다. 9 중요한 것은 둘 이상의 모집단을 동시에 분리할 수 있는 능력이 있어 시간과 시약을 절약할 수 있을 뿐만 아니라 보다 정교한 연구 설계가 가능하다는 것입니다. 10 그러나 FACS에도 한계가 있습니다. 관심 집단이 매우 드문 경우(1% 미만) 분류 효율이 감소하여 심각한 세포 손실이 발생할 수 있습니다. 또한, 일부 항체 결합은 분류된 세포 집단의 기능적 변화를 유도하는 세포 내 신호 전달을 활성화할 수 있습니다. 11 따라서 분류에 사용되는 표현형은 신중하게 선택해야 합니다.

FACS 외에도 MCS(magnetic-activated cell sorting)와 같은 특정 세포 집단의 농축을 위한 세포 표면 마커를 기반으로 하는 다른 방법이 있습니다. 12 FACS와 유사하게, 마그네틱 비드 접합 항체는 특정 세포 표면 분자를 표적으로 할 수 있습니다. 항체-항원 상호 작용에 따라 마그네틱 비드 코팅된 세포는 자기장을 통과한 후 코팅되지 않은 세포에서 분리될 수 있습니다. 그러나 MCS에서는 자기 구슬이 FACS의 다양한 형광색과 달리 구별할 수 없기 때문에 제한된 수의 분자만 표적으로 삼을 수 있습니다. 따라서 MCS는 복잡한 표면 마커 조합으로 세포 표현형을 정의하기가 어렵습니다. 13,14 또한 MCS는 표적 세포의 의도하지 않은 활성화를 유발할 수도 있습니다.

전신 홍반성 루푸스(SLE)의 마우스 모델에 대한 연구에서15 우리는 형질세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC)를 정제하여 질병 진행에 따른 기능적 변화를 조사하고자 했습니다. 우리는 처음으로 MCS를 사용하여 정상 상태에서 쥐 pDC에서 고유하게 발현되는 분자인 PDCA-1을 표적으로 하여 골수에서 pDC를 농축했습니다. 16 그러나 세포 순도는 예상외로 낮았는데, 이는 SLE와 같은 염증성 환경에서 다른 세포 집단에 대한 PDCA-1의 상향 조절 때문일 수 있습니다. 16 궁극적으로, 우리는 고순도 pDC를 CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ 집단으로 분리하기 위해 4개의 표면 마커(CD11c, CD11b, B220 및 PDCA-1)의 조합과 함께 FACS를 사용했습니다. 쥐 pDC에는 또 다른 특정 표면 마커 Siglec-H가 있습니다. 우리는 Siglec-H를 사용하지 않기로 결정했는데, 이 분자의 항체 결합은 IFNα를 생성하는 pDC의 기능을 억제하기 때문입니다. 11

세

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프로토콜

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참고 : MRL / MP-의 Fas의 LPR 루푸스 발생하기 쉬운 쥐 사육과 버지니아 공대 (동물 복지 보증 번호에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 요구 사항에 다음과 같은 특정 병원균이없는 시설에서 유지되었다 (MRL / LPR) : A3208-01). 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 모든 동물 실험은 IACUC 프로토콜 # 12-062 하에서 수행 하였다.

1. 세포 배양 매체 및 정렬 버퍼

  1. 완전한 세포 배지 (C10)를 10 % 소 태아 혈청, 1 mM 피루브산 나트륨, 1 내지 100 % MEM 비 필수 아미노산, 10 mM의 HEPES, 55 μM 2- 머 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민 및 보충 된 RPMI 1640을 사용하여 준비 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신.
  2. 정렬 버퍼를 준비 된 10 mM HEPES가 보충 1X 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)를 사용하여 (가득 HBSS) 2.5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민0.05 밀리미터의 MgCl 2, 0.2 U / ㎖ DNase의 I.

2. 마우스 해부

  1. 4 ML의 C10를 포함하는 두 개의 6 cm 직경 요리를 준비합니다. 얼음에 요리를 놓습니다.
  2. CO 2 흡입 마우스를 안락사.
  3. 비장을 수확하고 얼음에 C10와 함께 접시에 보관합니다.
    1. 해부 접시에 직면하고있는 배와 마우스를 아래로 핀. 70 % 에탄올을 분무하여 몸을 소독.
    2. 피부를 잘라 아래 목의 치골에서 복부 정중선을 따라 근육 벽에서 피부를 분리합니다.
    3. 발목의 첫 번째 절개에서 뒷다리를 따라 피부를 잘라.
    4. 다시 측면에있는 피부를 핀과 다이어프램하는 최초의 절개 곳에서 측면을 따라 근육 벽을 잘라.
    5. 헤드의 우측에 근육 벽 위로 고정.
    6. 소장 하부 위장 옆 마우스의 오른쪽에 비장을 찾아. 일의 한쪽 끝을 픽업전자 비장과 위장에서 분리.
  4. 대퇴골과 경골을 포함, 모두 뒷다리를 잘라하고, 가능한 한 많은 모든 근육을 제거합니다.
    1. 혈관을 피하기 위해 노력하고, 날카로운 가위로 발목 골반 / 고관절에서 뒷다리를 따라 근육을 잘라.
    2. 골수 콘텐츠의 노출없이 골반 / 고관절 발목 / 발 관절 절단하여 뒷다리를 분리한다.
    3. 반복적 면도날 긁 접합 지점에서 근육을 절단함으로써 뼈 깨끗 나머지 근육.
  5. 얼음에 4 ML의 C10을 포함하는 6cm 접시에 뼈를 유지합니다. 다음 마우스를 해부를 진행합니다.

3. 비장 격리

  1. 더 레드 조각을 볼 수 없을 때까지 4 ML의 C10를 포함하는 접시의 상단에 70 μm의 셀 스트레이너에 대한 주사기 플런저 부드럽게 비장을 균질화.
  2. 스트레이너 관통 접시에 추가 6 ML의 C10 추가ND 후 15ml의 원뿔형 튜브에 총 10 ml의 세포 현탁액을 전송.
  3. 5 분, 4 °에 C 800 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기.
  4. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 2 ㎖의 1 × 적혈구 (RBC) 용해 완충액에서 세포 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
  5. 배양 후, 5 분, 4 °에 C 800 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기.
  6. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 한 ML C10에서 세포 펠렛을 재현 탁. 어떤 큰 덩어리 (죽은 세포)를 취소하고 나중에 얼음에 튜브를 유지.
    주 : 많은 작은 덩어리가있는 경우, 일단 세포 현탁액을 필터링하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 사용한다.
  7. 자동 세포 계수기를 사용하여 트리 판 블루로 세포 수를 계산.

4. 골수 세포 분리

  1. 박격포로 4 ML의 C10과 뼈를 전송하고 총 10 ML의 C10의 볼륨을 만들기 위해 6 ML의 C10을 추가합니다.
  2. AP를 이용하여 모르타르에서 가볍게 뼈 균열estle.
  3. C10에 골수를 해제 유봉으로 가볍게 저어.
  4. 70 μm의 세포 여과기를 통해 얼음에 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 골수를 함유하는 10 ㎖의 C10 전송. 아직 뼈가 포함 된 박격포에 10 ml의 신선한 C10을 추가합니다.
    주 : 피펫 붉은 덩어리가 표시하는 경우 여과기를 통과하기 전에 골수 위아래로 수회 함유 용액.
  5. 반복 두 번 4.4-4.2 단계를 반복합니다. 마지막 세척 후, 뼈 흰색 나타납니다.
  6. 5 분, 4 °에 C 800 XG에 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. 한편, 실온에서 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 5 ㎖를 즉시 사용 가능한 밀도 구배 매질을 제조.
  7. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 10 ㎖의 C10에서 세포 펠렛을 재현 탁.
  8. 천천히 두 단계 들간의 인터페이스를 유지하면서 5 ml의 밀도 구배 매체의 상부에 10 ml의 세포 현탁액을 층을 포함한다. 그런 다음 30 분에 대한 1,363g에서 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리0 (또는 브레이크 OFF)로 설정 가속 9로 설정하고 감속와 RT (20 ° C).
  9. 원심 분리 한 후 조심스럽게 가기 8 mL의 용액을 제거하고 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 인터페이스 (단핵 세포 층)의 2 mL의 버피 코트를 수집한다.
  10. 골수 단핵 세포, 캡을 포함하는 15 ML 원뿔 관에 12 ml의 차가운 얼음 C10을 추가 한 다음, 잘 혼합 10 분, 4 °에 C 800 XG에서 튜브를 원심 분리기 여러 번 반전.

FACS 5. 세포 표면 염색

  1. 샘플 염색
    1. 항 - 마우스 CD16 / 32 항체 용액 (에서 1-100 희석 HBSS - 전체 / ml의 최종 농도 5 μg의)를 준비합니다.
    2. 단계 4.10의 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고, 단핵 세포상의 Fc 수용체를 차단하기 위해 100 ㎕의 항 - 마우스 CD16 / 32 항체 용액 중에 세포 펠렛을 재현 탁. 10 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
    3. (개미 형광 - 복합 항체 혼합물을 준비내가 마우스의 CD11c-PE 1시 40분 희석, 항 - 마우스 CD11b를-APC-CY7 1:80 희석, 항 - 마우스 PDCA-1-FITC 1시 40분 희석 및 항 마우스 B220-V500 HBSS-에서 1시 40분 희석 샘플 당 100 ㎕의 최종 부피)의 제조업체에서 권장 전체.
      참고 : 사용하기 전에 항체를 적정하는 것이 중요하다.
    4. 단계 5.1.2에서 10 분 배양 한 후, 항 마우스 CD16 / 32 언 바운드 제거하기 위해 5 분, 4 ° C 800 XG에 4 ml의 얼음 차가운 HBSS - 전체와 원심 분리기를 추가합니다.
    5. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 100 ㎕의 형광 접합 된 항체 혼합물의 세포 펠렛을 재현 탁. 어둠 속에서 15 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
    6. 15 분 부화 후, 언 바운드 형광 복합 항체를 제거하는 5 분, 4 ° C 800 XG에 4 ml의 얼음 차가운 HBSS - 전체와 원심 분리기를 추가합니다.
    7. FACS 로딩 솔루션 (HBSS-전체 500 NG / ㎖ DAPI)를 준비합니다.
    8. 단계 5.1.6에서 원심 분리 후, 상층 액을 대기음 500 μ의 세포 펠렛을 재현 탁; 리터 FACS 로딩 솔루션입니다. 12 X 75mm 둥근 바닥 튜브 (FACS 튜브)에 세포 현탁액을 전송하고 1 시간 내에 정렬 될 때까지 어둠 속에서 얼음에 튜브를 유지.
  2. 보상 염색
    1. PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI 또는 염색 등의 레이블 6 FACS 튜브. 1 × 10 6 세포 /를 FACS 튜브에 튜브 및에서 나누어지는 비장 세포는 5 분, 4 °에 C 800 XG에 4 ml의 HBSS - 전체 씻어.
      주 : 사용 사균의 생균을 구별하는 형광 염료, DAPI를 DNA 결합. DAPI는 죽은 세포의 세포막 (그러나 살아있는 세포) 및 바인드 염색체 DNA를 통과 할 수 있습니다.
    2. 뜨는을 대기음, 100 μl의 HBSS-전체에서 세포 펠렛을 resuspend.
    3. 항 - 마우스 CD19-PE 1시 40분 희석, 항 - 마우스 CD11b를-APC-CY7 1:80 희석 항 마우스 PDCA -1- FITC 1시 40분 희석 또는 각각 대응 FACS 튜브 내의 다음 항체 중 하나를 추가 manufa의 권장 방지 마우스 B220-V500 1시 40분 희석cturer. 그대로 5 일 (DAPI)과 6 일 (흠) FACS 튜브를 남겨주세요. 흔들어 잘 혼합하고 15 분 동안 어둠 속에서 얼음에 모든 FACS 튜브를 품어.
    4. 배양 후, 5 분, 4 ° C 800 XG에서 각 튜브와 원심 분리기에 FACS 튜브를 4 ml의 차가운 얼음 HBSS-전체를 추가합니다.
    5. 원심 분리 후, 상층 액을 대기음, 500 μl의 얼음에있는 세포 펠렛을 500 ㎕의 FACS로드 용액에 재현 탁 DAPI 표시된 튜브에 펠렛을 제외하고 차가운 HBSS-전체를 재현 탁. 정렬 될 때까지 어둠 속에서 얼음에 모두 6 튜브를 유지.

6. 셀 분류기에 정렬

주 : 사이토와 소프트웨어 절차를 정렬하는 동작은, 회사가 제공하는 구체적인 명령으로 표준화된다. 간단히 말해서, 우리는 20 psi에서 100 미크론 노즐, 5 사이의 설정 대상 셀 농도 사용 - ml의 당 10 만, 70 % 이상으로 효율을 조정 (즉, 충돌 30 아래에 보관%).

  1. 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신이 포함 된 500 μL의 FBS / 튜브 수집 FACS 튜브를 준비합니다.
  2. 단계 5.2에서 단일 얼룩 보정 튜브를 이용한 셀 소터의 보정 파라미터를 조정한다.
    1. 각각의 형광 강도에 대한 부정적인 게이트를 설정 흠 튜브 만 셀을 기록합니다.
    2. 각각의 형광 강도에 대한 긍정적 인 게이트를 설정하는 다른 단일 얼룩 보상 튜브 만 셀을 기록합니다.
      주 : 소프트웨어가 자동으로 보정 파라미터를 계산합니다.
  3. 3,000 셀을 기록하여 정렬 된 세포 집단의 게이트를 설정하는 단계 5.1에서 하나의 샘플을 사용합니다. 수동 분명히 다른 점에서 분리 점 그룹으로 X 및 Y 축 그래프 게이트 표적 세포 집단의 파라미터 형광 강도 사용.
    참고 :이 게이팅 세트는 연구자의 요구 사항에 따라 유연하고 임의이다. 연구자들은 하나 이상의 마커에 기초하여 높은 순도를 기대하는 경우, 게이트 이동높은 대응하는 형광 강도에 따라.
  4. 컬렉션 튜브를로드하고 대상 세포 인구를 정렬 시작합니다.
  5. 모든 샘플 튜브가 완료 될 때까지 정렬 한 후 얼음에 포집 관을 유지합니다.
  6. 4 ml의, 모자까지 포집 관에 얼음 감기의 C10을 추가하고 혼합하는 반전.
  7. 5 분, 4 ° C 800 XG에서 수집 튜브를 원심 분리기, 다음의 손길이 닿지 않은 세포 펠렛으로 약 200 μl를 떠나, 뜨는을 대기음.
  8. 세포 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 원심 분리 관에 모든 세포 현탁액을 전송하기 위해 1 ml의 얼음 추위에 C10을 추가합니다.
  9. 원심 분리기의 손길이 닿지 않은 세포 펠렛 100 μl를 떠나는 1.5 ML의 5 분, 4 ° C 800 XG에 튜브와 뜨는을 대기음.
  10. 사용할 때까지 얼음에 정렬 된 세포 집단을 저장합니다.

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결과

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우리는 높은 순도 골수 PDC를 풍부하게하는 것을 목표로하고 IFNα를 생산하는 능력에 대한 PDC의 기능 변화를 연구하는 젊은이와 노인 모두의 MRL / LPR의 루푸스 발생하기 쉬운 마우스에서 다른 세포 유형의 영향없이. 사용 된 첫 번째 정제 전략은 그림 1과 같이 농축 후 만 7.75 % 순도 주도, MCS했다. MCS에 비해 FACS은 96.4 %로 높은 순도의 PDC 농후. 높은 순도를 보장하기 위해, 단계적으로 게이팅 전략을 수행 하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 단핵 세포 게이트 전방 산란 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC) 파라미터에 의해 먼지로부터 분리 하였다. FSC 폭 (FSC-W) FSC 높이 대 (FSC-H) 및 SSC-H 대 SSC-W를 사용하여 단일 세포 집합체에 의해 생성 된 거짓 양성 신호를 방지하기 위해 게이트 하였다. 라이브 하나의 세포가 다음 DA...

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토론

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이 원고에 설명된 프로토콜은 IFNα 생성 능력을 유지하는 살아있는 pDC의 고순도 농축을 위한 것입니다. 이 프로토콜의 응용에는 세포 및 분자 기능의 연구를 위한 MRL/lpr의 골수 및 임의의 다른 마우스 계통으로부터 pDC 및/또는 임의의 다른 단핵 세포의 정제가 포함되나 이에 국한되지 않습니다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 분류된 pDC의 높은 생존력과 순도를 보장하는 것입니다. 첫 번째 핵심 단계는 뼈에서 골수를 방출하는 것입니다. 골수 세포 손상을 최소화하려면 뼈를 부수는 대신 뼈를 부드럽게 깨뜨리고 유봉을 저어주는 것이 중요합니다. 두 번째 핵심 단계는 밀도 구배 배지로 단핵 세포를 농축하는 것입니다. 세포 현탁액을 로딩하는 동안 하상(밀도 구배 배지)과 상상(세포 현탁액) 사이에 명확한 인터페이스를 설정하는 것이 중요합니다. 원심분리 조건은 주로 단핵 세포를 포함하는 버피 코트 층의 형성에도 중요합니다. 원심분리 후 뼈 파편, 적혈구 및 고밀도 호중구는 버피 코트층에서 제외되어 튜브 바닥에 머무릅니다. 세...

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공개 사항

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저자는 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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유세포 분석 핵심 시설을 사용해 주신 Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine의 유세포 분석 실험실에 감사드립니다. 이 작업은 XML의 스타트업 펀드로 지원되었습니다. XL은 생물의학 및 수의학 대학원 프로그램의 Stamps Fellow입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
태아 소 혈청HyCloneSH30396.03
Sodium pyruvategibco by life technologies11360-070
MEM non-essential amino acidsgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-메르캅토에탄올Gibco21985-023
L-글루타민 생명 과학의 gibco25030-164
페니실린-스트렙토마이신생명 과학의 gibco15140-122
1x 행크' s 균형 잡힌 소금 솔루션 Gibco by Life Technologies14175-079
MACS BSA 재고 솔루션Miltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
적혈구 (RBC) 용해 완충액 eBioscience00-4300-54
밀도 그라데이션 중간 GEHealthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
안티-마우스 CD19-PEBD Pharmingen553786
안티-마우스 CD11c-PEeBioscience12-0114-82
안티-마우스 CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
안티-마우스 PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
안티-마우스 B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouseMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I 유세포 분석기 BD Biosciences643178
BD FACS Diva 버전 6BD Biosciences
Life Technologies의

참고문헌

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