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방법 논문

경동맥 내 주사 대장균 신우 신염의 쥐 모델에서

7.9K 조회수

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DOI:

10.3791/54649

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2017년 7월 18일

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1Department of Radiology, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University, 3Department of Urology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

이 논문에서

요약

이 원고는 대장균에 의한 신장 내 감염을 신장 골반으로 직접 사용하는 신우신염의 쥐 수술 모델을 설명합니다. 실험 절차는 신우신염의 발병 기전과 관련 염증 및 섬유증을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

Pyelonephritis는 신장의 세균 감염이며 대장 균에 의해 가장 흔하게 발생합니다.감염이 재발하면 심각한 신장 염증과 섬유증을 유발할 수 있으며, 궁극적으로 신장 기능이 저하될 수 있습니다. 신우신염의 임상적 관리 및 예방을 개선하기 전에, 진행, 재발 및 치료 효능의 기전을 연구하기 위해 신뢰할 수 있는 동물 모델을 확립해야 합니다. 경요도 감염 모델은 인간의 신우신염을 매우 모방하지만 박테리아를 신장으로 운반하기 위해 요도 역류에 의존하기 때문에 상당한 차이를 보입니다. 본 명세서에서는 비침습적 자기공명영상(MRI)에 의해 쥐의 신장 골반에 세균 주사를 수행하기 위한 상세한 수술 프로토콜이 제공되고 확인됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 동물은 원하는 농도의 대장균 박테리아에 직접 노출되고 적절한 수술 후 관리를 통해 수술 절차에서 완전히 회복할 수 있습니다. 이는 식염수(가짜) 대조군과 비교하기 위해 실험 동물 모델에 대한 후속 종단 MRI 평가를 용이하게 합니다. 이 직접 전달 접근 방식을 사용하면 감염의 중증도를 제어할 수 있으며 진행에 대한 기계론적 연구와 새로운 치료 전략 개발에 적용할 수 있습니다.

서론

설치류 모델은 신우 신염 (pyelonephritis)과 요로 감염 (UTI)을 포함한 수많은 인간 질병 발현을 연구하는데 사용되었습니다. UTI는 전 세계적으로 건강 문제이며, 모든 연령의 어린이, 남성 및 여성에게 영향을 줄 수 있습니다. 1 , 2 , 3 UTI의 초기 증상은 방광염을 포함하며 감염이 요관을 따라 상승하면 신장 감염 (신우 신염)이 발생할 수 있습니다. 동시에 당뇨병의 유행은 전 세계적으로 4 억 명에 이릅니다. 4,5 중요한 UTI 입사 최대 비만 또는 재발 UTI 감염 (루티), 패혈증, 신우 신염으로부터 신장 섬유증, 및 방광 기능 장애의 위험 증가의 결과로, 제 2 형 당뇨병을 가진 환자의 4 배 이상으로 할 수있다. 6 , 7 , 8 설치류현재의 항생제 요법은 UTI 환자의 하위 집단에서만 지속적이고 예방적인 반응을 일으키기 때문에 모델은 UTI를 연구하는 데 중요합니다. 임상 UTI 치료를 향상시키기 위해 중요한 단계는 2 형 당뇨병의 영향뿐만 아니라 급성 감염에서 염증에서부터 섬유화에 이르기까지의 rUTI 및 병태 생리 학적 과정을 이해하는 것입니다.

동물 모델을 개선하는 목표는 질병 진행 및 치료 중재를보다 정확하게 평가할 수있는 기술을 개발하는 것입니다. 여러 가지 접근법이 신장 손상의 병태 생리학, 항생제 치료의 효과 및 UTI 자연 경과의 다른 측면을 연구하기 위해 쥐 및 / 또는 마우스에서 신우 신염을 유도하기 위해 사용되었습니다. 역행성 요로 감염을 확증하기위한 일반적인 접근법은 경 요도 카테터 삽입 법입니다. 10 , 11 , 12 , 13 ,이 방법은 마취 된 동물의 방광으로 요도를 통해 박테리아를 도입합니다. 이 기술은 인간 신우 신염을 면밀히 시뮬레이션하지만, 신우 신염 감염의 실제 발생률과 크기는 예방 접종 중 또는 즉시 접종 후 자발적 인 ureteric 역류 또는 요실금 배뇨가 없기 때문에 여러 변수가있을 수 있습니다. 그 결과 11, 신장 감염뿐만 아니라 치료 전략을 연구하는이 모델의 유틸리티를 제한 할 수있는 상승 신우 신염 감염을 유도에서 실험 다양성.

이 보고서는 대장균 이 쥐 신장에 직접 주입되는 외과 적 신우 신장염 쥐 모델을 기술합니다. 이 쥐 모델이 침습적 임에도 불구하고, 신장으로 전달 된 대장균 의 양은 효과적으로 신장 감염 및 염증을 가능하게하면서 효과적으로 조절 될 수있다. 14 이 절차에서 우리는 또한이러한 생길 수있는 신장 감염이 생체 내 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 세로로 모니터링 될 수있는 방법.

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프로토콜

모든 동물 연구는 Case Western Reserve University에서 승인 된 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 아래에 설명 된 수술 절차의 기간은 약 45-60 분입니다. MRI 절차 자체는 매 시간마다 약 15 분입니다.

1. 마취

  1. 쥐를 isoflurane 챔버에서 2 % isoflurane을 산소와 혼합하여 쥐를 마취 한 후 주사제 마취를 복막 내 투여하기 전에 동물의 취급과 구속을 용이하게하십시오.
  2. isoflurane에 3-5 분 노출 한 후에 동물이 마취되었는지 확인하고 발가락 핀치에 반응이 없음을 확인하십시오.
  3. 쥐를 xylazine과 케타민의 혼합 복강 내 주사로 75mg / kg 케타민 / 10mg / kg xylazine으로 추가 진정시킨다. 복강 내 주사를 할 때는 바늘을 뒤로 당겨 장이나 다른 중요한 기관의 일부가 뚫리지 않았는지 확인하십시오.
  4. 나는절개 부위에 2mg / kg bupivacaine을 피하 주사하여 국소 통증 완화를 제공하십시오.

2. 수술 영역의 준비

  1. 그들이 수술에 사용되기 전에 수술 도구 및 소모품을 소독하고 무균을 위해 수술 패드에 배치합니다. 대부분의기구와 보급품은 고압 가압 소독하고 재사용 할 수 있습니다.
  2. 모든 수술 절차에는 멸균 장갑을 사용하십시오.
  3. 전기 면도기를 사용하여 모피를 동물의 오른쪽 면도 면도하십시오. 갈비뼈의 바닥에서 뒷다리의 꼭대기까지 동물을 면도하고 절개를위한 큰 머리카락없는 부위를 제공하십시오.
  4. 동물을 멸균 외과 패드에 올려 주변 부위와 소독 부위를 격리시킵니다.
  5. 포비돈 요오드 또는 베타 딘과 같은 소독제로 피부를 문지릅니다. 수술 부위의 중심에서 문지르기를 시작하고 원형 방식으로 외부로 이동하십시오. 포비돈 요오드 또는 베타 딘의 새로운 닦음으로 적어도 세 번 반복하십시오.
  6. 요오드가 흡수되면 독성이있을 수 있으므로 피부가 깨끗해질 때까지 70 % 알코올 면봉으로 수술 부위를 문질러주십시오.

3. 수술 절차

  1. 무균 상태에서이 절차를 유지하십시오.
  2. 오른쪽 측면을 위쪽으로 향하게하여 왼쪽 측면 decubitus 위치에 따뜻한 난방 침대에 마취 동물을 위치.
    참고 : 저체온증을 예방하려면 동물의 핵심 체온을 35-37 ° C로 유지해야합니다. 이 온난화 베드는 무균 상태를 유지하기 위해 필요에 따라 멸균해야합니다.
  3. 갈비뼈 케이지를 느끼고, 갈비뼈 바닥에서 시작하는 무균 크기 10 메스 블레이드를 사용하여 2 ~ 3cm 정도의 등 복부 후 복막 절개를하십시오.
  4. 절개의 양 측면을 따라 세로로 멸균 거즈를 놓습니다.
  5. 복강을 시각화하고 액세스하려면 피하 조직, 지방 및 근육을 멀리 해부하십시오. 더 깊게 관통 할 수 있도록 곡선 형 블레이드 Mayo 가위를 사용하십시오.상처에 배급하고 두꺼운 조직을 자른다.
  6. 간이 명확하게 보이고 접근 할 수있게되면 무딘 포셉을 사용하여 간을 위쪽으로 후퇴시킵니다.
  7. 다른 한편으로는 다른 한 쌍의 무딘 집게를 사용하여 복부 캐비지 바깥에 위치하도록 오른쪽 신장을 노출시킵니다.
  8. 신장과 왼쪽을 잡으려면 왼손 엄지 손가락과 엄지 손가락을 사용하십시오. 오른손으로 천천히 꾸준히 15 (흰색 거품으로 표시) 신우으로 멸균 주사기를 0.1 ml의 대장균 E. UTI89 용액 (농도 9 × 10 -1 10 × 8 (1) 사이) 주사.
    참고 : 참조 15에 설명 된대로 세균성 역가를 준비하십시오.
  9. 복막으로 inoculum의 유출을 방지하기 위해 바늘 위에 흡수 hemostat의 스트립을 놓습니다. 천천히 신장 골반에서 바늘을 당겨냅니다.
    주의 : 주변 조직을 관통하거나 감염시키지 않도록주의해야한다.ons 및 / 또는 합병증.
  10. 큰 주사기를 사용하여 복강 내로 다시 넣기 전에 신장을 생리 식염수로 완전히 헹구십시오.

4. 봉합

참고 : 조직에 묻힐 봉합사는 4-0 비 흡수성 꼰 봉합해야합니다. 신체 표면에는 흡수성 또는 모노 필라멘트 봉합사를 사용할 수 있습니다.

  1. 혈류 방해를 막기 위해 봉합사를 최대한 조직 모서리에 가깝게 놓으십시오. 전형적으로 가장자리로부터 0.3cm 이하가 필요하다.
  2. 미세한 치아 포셉 한 쌍을 사용하여 피부를 잡고 약간 뒤로 젖히고 바늘 홀더를 피부를 관통하기위한 준비 자세로 회전 시키십시오.
  3. 손바닥을 회전시켜 바늘을 회전시키고 피부를 통과시켜 피부의 전체 두께에 걸쳐 바늘을 움직입니다.
  4. 프로 시저를 수행하는 개인과 가장 가까운 스킨 가장자리에 대해이 과정을 반복하십시오.
  5. 죄다조직의 가장자리를 막기에 충분한 봉합선. 더 단단하면 혈액 공급을 방해하고 천천히 상처를 치며 열개를 초래할 수 있습니다.
  6. 짧은 줄만 잘라서 3-4mm 꼬리를 남기고 단순한 중단 스티치처럼 사각 매듭을 사용하여 봉합을 묶습니다.
  7. 첫 번째 스티치를 묶은 후 첫 번째 스티치를 약 3mm 정도 떨어진 곳에 두 번째 스티치를 준비하고 실행중인 봉합을 계속하십시오.
  8. 절개 끝 부분에 도달하면 마지막 스티치를 끝까지 당기지 마십시오. 대신, 봉합사 봉합 부의 말단부를 묶기 위해 짧은 바늘로 여기에 바늘 홀더로 고정 된 루프를 사용하십시오.
  9. 기구 넥타이를 사용하여 정사각형 매듭을 사용하여 봉합을 묶습니다. 그 결과 3 개의 가닥이 말단의 완성 된 매듭에서 튀어 나오게됩니다.

5. 동물성 회복

  1. 수술 후 2.1 mg / kg Yohimbine을 복강 내 주사하여 마취를 후 향적으로합니다. 에이시신은 3-5 시간 후 외과 수술로부터 완전히 회복 될 것으로 예상됩니다.
  2. 동물을 난방 패드 (저체온증을 피하기 위해)와 수술 후 흡수성 부드러운 침구 위에 올려 놓으십시오.
  3. 경구 또는 비경 구 액체로 정상 수유로 돌아갈 때까지 (24 시간 이내) 재수 화를하십시오. 탈수 효과를 제한하기 위해 수술 직후에 생리 식염수 약 0.6 ml를 복강 내 주사한다.
  4. IACUC에서 승인 한 동물 관리 및 사용 프로토콜에 설명 된대로 진통을 제공하십시오. 통증 관리를 위해 carprofen 5 mg / kg을 피하 주사하십시오.
  5. 붓기, 삼출액, 통증 또는 열개에 대한 절개를 정기적으로 관찰하십시오.

6. 자기 공명 영상을 통한 검증

  1. 고지 소형 동물 MRI 스캐너에서 생체 내 MRI 실험을 수행하십시오.
  2. 산소에서 3 % isoflurane으로 마취를 유도하고 MRI 스캐너에서 아이소 센터 (isocenter)에서 적절한 신장으로 동물을 위치시키고 적절하게radiofrequency coil을 먹었다. nosecone을 통해 이미징 절차 전반에 걸쳐 1 ~ 2 % isoflurane 마취를 동물에게 지속적으로 제공하십시오.
    참고 : 그림 1에 표시된 생체 내 MRI 이미지의 경우, 래트 크기의 볼륨 코일 (내부 직경 = 72mm)을 사용했습니다.
  3. 동물 모니터링 및 제어 시스템을 사용하여 각 동물의 호흡 률 (40-60 breaths / min) 및 핵심 체온 (35 ± 1 ° C)을 유지하십시오.
  4. 다중 슬라이스, 다중 에코 스핀 에코 MRI 획득을 사용하여 감염된 신장과 대조군 모두의 고해상도 축 방향 T2 강조 영상을 얻습니다. 일반적인 MRI 획득 파라미터는 반복 시간 = 5,000 msec, 에코 시간 = 40 msec, 슬라이스 두께 = 2.0 mm, 평면 내 공간 해상도 = 200 μm, 신호 평균 3 개, 획득 시간 8 분입니다.

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결과

의료 이미징 기술은 UTI 및 치료 효능을 비 침습적으로 평가할 수있는 기회를 제공합니다. 따라서 MRI를 이용하여 1-2 x 10 7 UTI89 대장균 주입 후 급성 감염의 유무를 확인하고 수술 전과 후에 신장의 변화를 시각화 하였다. 그림 1a-b 는 신장 감염의 점차적으로 증가하는 영역을 보여줍니다 (노란색 화살표). 감염 후 1, 4 일째에 각 동물에 대해 얻은 MRI 이미지는 급성 신우 신염 감염의 성장을 특성화하는 데 도움이됩니다.

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도 1 : 축 대장균에서 MRI 이미지를 T1 강조 - 신우 신염에 의한 설치류 모델

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토론

설치류 (예 : 생쥐와 쥐)의 급성 신우 신염은 경 요도 카테터 삽입에 의해 생성 될 수 있습니다. 16 , 17 , 18 이 요도 감염 방법은 비 침습적이며 상행 감염의 인간 병리 생리학을 모방한다는 점에서 유리하다. 17, 18, 19, 20 그러나,이 방법은 또한 요철 감염률 인한 배뇨 같은 해부학 적 변화와 같은 생리 학적 한계 신장에 투여 변수 대장균으로 고생 할 수있다. 11 Fierer et al. (1971)은 대장균

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공개 사항

저자는 다른 공개가 없습니다.

감사의 글

저자는 NIH/NIDDK K12 DK100014(Lan Lu), Case Comprehensive Cancer Center(NIH/NCI P30 CA43703) 및 Clinical and Translation Science Collaborative of Cleveland(NIH/NCATS UL1 TR000439)의 지원에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수 패드Fisher14-127-47
멸균 면 거즈 패드Fisher22-415-469
라텍스 수술용 장갑Henry Schein Animal Health21540
곡선형 마요 가위FisherS17341
직선 둔기 포셉Fisher08-895
메스 핸들 Fisher08-913-5
멸균 메스 블레이드Fisher53220
1 ml Luer-Lok 주사기BD Biosciences309628세균 주사용
20 ml Luer-Lok 주사기 BD Biosciences301031식염수 세척용
HemostatSeneca Medical240267
23 G 3/4 in. 바늘 BD Biosciences305143
30G 1인치 바늘 BD Biosciences305128
U-100 인슐린 주사기Exel International 25846약물 주사용
IsofluraneHenry Schein 동물 건강050033
XylazineHenry Schein 동물 건강33197IP
케타민Patterson 수의사 주입 07-881-9413IP
주입 요힘빈 (아티파메졸)Patterson Vetrinary 07-867-7097수술 후 IP 주입
Bupivacaine (Marcaine)Patterson Vetrinary 07-890-4584절개 부위에 SQ 주입 
4-0 크롬 거트 봉합Ethicon Inc.U203H
4-0 꼰 Vicryl 봉합사Ethicon Inc.J304H
1 ml SubQ 주사기BD Biosciences309597
E. coli  UTI89 또는 CFT073ATCC700928
Surgicel 흡수성 지혈제 Ethicon Inc.ETH1951CS 
Biospec 9.4T MRI 브루커 94/20 소련
스 사

참고문헌

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