방법 논문

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

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DOI:

10.3791/54653

⸱

2018년 10월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

이 논문에서

요약

이 보고서는 특성화 세균성 외부 막 단백질 및 인간 보완 레 귤 레이 터 vitronectin 사이 상호 작용에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 바인딩 반응 어떤 세균성 종에 vitronectin의 생물 학적 기능을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.

초록

박테리아는 호스트 면역 반응을 회피의 수단으로 보완 레 귤 레이 터를 사용 합니다. 여기, 우리는 호스트 면역 시스템에 저항에 세균성 세포 표면 놀이에 역할 vitronectin 인수를 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 교류 cytometry 실험 Haemophilus 함께 유형 f의 세균성 수용 체 외부 막 단백질 H에 대 한 리간드로 인간의 플라즈마 vitronectin를 확인. 순화 된 재조합 단백질 H와 vitronectin, 간의 단백질-단백질 상호 작용 하는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 고용 되었다 하 고 바이오-레이어 간섭계를 사용 하 여 평가 했다 선호도 바인딩. 호스트 면역 반응의 회피에 세균성 세포 표면에 단백질 H vitronectin의 바인딩의 생물학 중요성 정상 및 vitronectin 고갈 인간의 혈 청 혈 청 저항 분석 결과 사용 하 여 확인 되었다. 세균성 부착에서 vitronectin의 중요성 vitronectin 코팅, 그램 얼룩 뒤 없이 유리 슬라이드를 사용 하 여 분석 했다. 마지막으로, 세균성 접착 인간 폐 포 상피 세포 monolayers 조사 했다. 여기에 설명 된 프로토콜 관심의 어떤 세균성 종의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

Vitronectin (Vn)는 중요 한 인간의 당단백질 fibrinolytic 시스템의 규제를 통해 항상성 유지에 관여 이다. Vn 또한 보완 레 귤 레이 터로 C5b6-7 복잡 한 형성과 C9 중 합 하는 동안 터미널 보충 통로 억제 함으로써 작용 한다. 여러 가지 세균성 병원 체 저항 보완 증 착1,2,3의 수단으로 세포 표면에 Vn을 모집 하기 위해 표시 되었습니다. 또한, Vn 박테리아 및 호스트 상피 세포 수용 체, 그로 인하여 추진 준수 및 병원 체2,,45의 국제화 사이 "샌드위치" 분자 기능을 합니다. 바인딩 Vn의 세균성 세포 표면에는 현재 정체 불명된 다른 단백질에 의해 중재 됩니다. Vn-에서 바인딩 회피 호스 면역 반응의 기능적인 역할을 완전히 elucidating 따라서 Vn 모집 단백질의 식별을 요구할 것 이다.

Vn-바인딩 단백질을 확인 하는 초기 단계는 관심의 병원 체는 순화 Vn. 교류 cytometry 바인딩할 수 있는지 여부를 테스트 Vn 병원 체 세포에 바인딩되어 있는지 여부를 확인 하는 편리 하 고 간단한 방법입니다. 이 연구에서 우리는 다양 한 Haemophilus 함께 유형 f (Hif) 임상 격리6Vn의 바인딩을 평가. 여기에 설명 된 방법은 양적 이며 다양 한 세균성 긴장의 바인딩 용량을 구분 하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 연구에서 우리는 Vn-바인딩 단백질7단백질 H (전화), Hif의 특징. 따라서, 현재 연구에서 야생-타입 (WT) Hif 및 Hif M10Δlph 돌연변이의 Vn 바인딩 잠재력 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 비교 했다.

병원 체 Vn 바인딩합니다 확인은, 두 번째 단계는 표면 프로테옴 잠재적인 Vn-바인딩 단백질 식별 특성. 다양 한 접근법이 목적8,9를 사용할 수 있습니다 그러나 이러한 방법론은이 보고서에서 설명 하지 않습니다. 단백질 단백질 상호 작용을 조사 하기 위한 가장 적합 한 방법은 recombinantly 대장균 에서 선택한 세균성 표면 단백질을 표현 하 고 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하입니다. 여기, 우리 사용 PH Vn와 분자의 상호 작용 방법을 설명 합니다. 재조합 PH와 Vn 간의 상호 작용은 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)7 과 바이오-레이어 간섭계 (BLI)10,11이라는 최근에 개발 된 레이블 없는 기술을 사용 하 여 특징 이었다. 반면 ELISAs 단백질 단백질 상호 작용을 확인 하는 데 사용 될 수, 씨는 상호 작용의 운동 매개 변수에 대 한 자세한 데이터를 제공 합니다.

세균성 부착에서 Vn의 기능적 역할을 연구 하기 두 개의 서로 다른 분석을 활용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 첫 번째 분석 결과 두 번째 시험 검사 상피 세포의 표면에 부착 하는 반면 Vn 코팅 유리 표면에 세균성 부착의 직접 측정은. 첫 번째 분석 결과 대 한 유리 슬라이드 했다 Vn, 코팅 그리고 WT 또는 돌연변이 Hif 긴장의 바인딩 그램 얼룩 그리고 현미경 검사 법에 의해 평가 되었다. 이 기술은 쉽게 박테리아가 Vn12바인딩할 능력에 따라 구분 합니다. 포유류 세포에 세균성 접착의 유형 II 치조 상피 세포; 단층에 교양된 박테리아를 추가 하 여 다음 분석 세균성 부착 했다 식민지 형성의 수를 계산 하 여 평가 단위 (CFUs). 준수 하 고 내 면 박테리아는 Vn4,13의 유무에서 고유 수 있습니다.

Vn 수집 세균 혈 청 저항에서의 역할은 혈 청 죽이 분석 결과 (즉, 혈 청 살 균 활동)를 사용 하 여 평가 되었습니다. 혈 청 저항에서 Vn 수집의 중요성을 평가, Vn 고갈 혈 청 (VDS)의 살 균 활동 정상적인 인간 혈 청 (NHS)의 비교 되었다. 쉽게 사용 하는 방법은 혈 청 저항에 따라 구속력이 박테리아 대 Vn-바인딩을 구분 합니다. 우리는 여러 가지 세균성 병원 체4,12의 혈 청 저항에 Vn의 역할을 연구 하기이 방법을 사용.

수많은 방법 호스트 병원 체 상호 작용 연구 보고 되었습니다. 여기, 우리는 적용할 수 있습니다 쉽게 어떤 병원 체의 연구를 병에 Vn의 역할 평가 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 우리는 다양 한 병원 체를 사용 하 여 이러한 프로토콜을 테스트 하 고 Hif이이 보고서에 대 한 예제로 선정 되었다.

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프로토콜

1. 세균성 표면 단백질 Ligand로 Vn의 분석

  1. Vn-바인딩 cytometry 사용 하 여 세균성 표면에서의 검출
    참고: cytometry, 우리 사용 측면 분산형 및 앞으로 분산형 게이트 긍정적인 이벤트를. Vn와 상호 작용을 검사, Hif 임상 격리 (n = 10)7 대장균 BL21 함께 선정 됐다 (DE3) 부정적인 컨트롤 (그림 1A).
    1. 문화 Hif 임상 10 µ g/mL 나드와 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 hemin 보충 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 매체에서 분리 합니다. Luria Bertani 매체를 사용 하 여 대장균14문화. 중간 로그 단계에서 Hif를 수확 (OD600 = 0.3)15, resuspend 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), pH 7.2, 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (차단 버퍼;를 포함 하는 박테리아와 PBS-BSA). 10 서 스 펜 션 조정9 CFU/mL.
    2. 5 x 106 CFU 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브 (12 x 75 m m2)에 포함 된 aliquots를 전송 하 고 블로킹 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 박테리아, 펠 렛을 5 분 동안 실내 온도 (RT)16 에서 3500 × g 에서 정지를 원심 다음 신중 하 게는 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고 제거 하려면 발음.
    3. 블로킹 버퍼를 포함 하는 250의 50 μ와 세균 펠 릿 resuspend nM Vn 동요 없이 RT에 1 시간에 대 한 샘플을 품 어 고. 부 화, 후 5 분, 3500 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은 다음 PBS와 비슷한 원심 분리 단계를 사용 하 여 시간 3 펠 릿을 세척 합니다.
    4. 세균성 펠 릿 기본 양 반 인간 Vn polyclonal 항 체 (Pab)의 50 μ PBS BSA에 1: 100 희석에 추가 합니다. RT에 1 시간에 대 한 정지를 품 어 다음 세 번 (단계 1.1.3에서에서와 같이) 언바운드 항 체를 제거 하는 PBS 가진 박테리아를 씻어.
    5. 다음, 추가 PBS BSA 포함 fluorescein isothiocyanate (FITC) 50 μ-당나귀 안티 양 Pab (1: 100 희석)를 활용 하 고 어둠 속에서 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
    6. 버퍼만 및 Pab Vn 없이 차단 된 박테리아를 배양 하 여 빈 컨트롤을 준비 합니다.
    7. 박테리아 차단 버퍼의 1 mL로 세 번 세척 하 고 1.1.2 섹션에 설명 된 대로 원심 분리, 여 현 탁 액을 펠 렛. 마지막으로, resuspend와 PBS의 300 µ L 세균성 펠 릿 및 흐름 cytometry7에서 분석.
  2. 재조합 PH 및 Vn 사이 상호 작용의 ELISA 분석
    참고: 컨트롤 일반적인 바인딩 제외를 포함 해야 합니다. 인간 요인 H (FH) 또는 C4b 묶는 단백질 (C4BP)는 각각 양수와 음수 컨트롤로 사용 됩니다.
    1. 각 50 별도로 인간의 단백질 (Vn, FH, 및 C4BP)의 희석 Tris HCl, pH 9.0 (코팅 버퍼)에 nM. Polysorp 결정 플레이트의 각 음에 단백질 해결책의 100 µ L를 분배. 뚜껑 접시 닫고 결정 플레이트 웰 스에 4 ° C에서 하룻밤 (16h) 촉진 단백질의 동원 정지를 저장 합니다.
    2. 싱크대 위에 거꾸로 기울이기로 결정 접시에서 솔루션을 삭제 하 고 세 번와 300 µ L의 PBS/웰 스를 씻어. 1 h 2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA)를 포함 하는 PBS와 RT에 대 한 코팅된 우물을 차단 합니다.
    3. 차단 솔루션을 제거한 후 씻어 0.05% (v/v) 트윈 20 (PBST) 잘 당 포함 된 PBS의 300 µ L로 세 번 웰 스. 각 샘플에 산도 그 태그 잘 하 고 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 50 nM 재조합의 100 µ L를 추가 컨트롤 스에서 PBS BSA의만 100 µ L를 추가 합니다.
      참고: 인코딩 Hif에서 PH lph 유전자 PCR에 의해 증폭 되었고 표현한 단백질의 C-말단에 6 × 그 태그를 추가 하는 pET26b 식 벡터에 복제. 재조합 벡터 표현에 대 한 대장균 BL21(DE3)로 변모 했다. Ni NTA 수 지는 재조합 단백질15정화 사용 되었다.
    4. 단백질 해결책을 무시 하 고 우물 잘 당 PBST의 300 µ L로 세 번 세척 하 여 바인딩되지 않은 단백질을 제거 합니다. PBS-BSA 포함 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)의 100 µ L를 추가-반 그의 Pab (1시 10분, 000 희석)를 활용 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 품 어
    5. 5% 아세톤 및 45% 메탄올 솔루션에서 tetramethylbenzidine을 용 해 하 여 20 m m 솔루션을 준비 합니다. 솔루션 B를 준비 하려면 19.2 g H2O의 1000 mL에 구 연산 분해 하 다음 코를 추가 하 여 4.25에 pH를 조정 30% H2O2의 230 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 어둠 속에서 두 솔루션을 저장 그냥 사용 하기 전에 솔루션 ELISA 검출 시 약을 준비 하는 A의 9.5 mL 500 µ L 솔루션 B의 혼합.
    6. 세 번 잘 당 PBST의 300 µ L로 우물을 세척 하 고 100 µ L ELISA 검출 시 약의 각 음을 추가 하 여 항 원-항 체 복합물을 검출.
    7. 그래서 1 M H2의 50 µ L를 추가 반응을 중지 하4/well. 450에 우물의 광학 밀도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
  3. 재조합 PH 및 씨를 사용 하 여 Vn의 상호 작용 활동의 연구
    1. 제조업체의 지침11에 따라 연결 방법, 아민을 사용 하 여 아민 반응 센서에 인간의 Vn을 무력화.
    2. PBS를 사용 하 여 직렬 4 µ m 0에서 ligand (재조합 PH)을 희석 하 고 96 잘 블랙, 플랫 바닥 결정 플레이트에 결과 솔루션을 전송. 17씨 악기 사용 하 여 30 ° C에서 실험을 실행 합니다.
    3. BLI 데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 폴더를 로드 합니다. '센서 선택' 옵션을 선택 합니다. 그럼, 선택 ' 잘 ' (PBS의 Vn 코팅 센서)에 대 한 참조 빼기.
    4. '기준선 y 축 정렬' 고 '보정 interstep 및 협회에 맞춤'을 선택 합니다. 눌러서 '프로세스 데이터' 분석 탭에서 자동으로 열립니다.
    5. 분석 탭에서 커브 피팅 아래 '협회와 분리' 옵션을 선택 합니다. 모델 선택 ' 1:1 바인딩 및 글로벌 피팅 '. ' 곡선 ' 하 고 피팅 데이터17내보내기를 누릅니다.

2. 세균성 부착에서 Vn의 역할의 특성

  1. Vn 코팅 유리 표면에 세균성 부착의 연구
    1. Vn에 PBS와 피펫으로 10 µ L 유리 현미경에이 솔루션의 한 방울으로 슬라이드의 2 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다. 부정적인 통제로 인간 혈 청 알 부 민 (HSA)와 슬라이드 실시간 코트에서 30 분 동안 슬라이드에 건조 드롭을 수 있습니다.
    2. 단백질 코팅 유리 슬라이드 세 번 초과 uncoated 단백질을 제거 하는 PBS를 포함 하는 비 커에 2 초 동안 슬라이드를 담거 서 세척. 메 마른 플라스틱 페 트리 접시에 20 mL 신선한 Hif 문화 (1.1.1 단계에서 설명)를 추가 하 고 잠수함 Vn-문화 매체에서 HSA 코팅 유리 슬라이드 /. 20 rpm에서 떨고와 1 시간 동안 37 ° C에 요리를 품 어.
      참고: Hif M10 및 Hif M10Δlph 성장 했다 초콜릿 한 천 배지 또는 BHI 액체 매체에서. Lph 돌연변이 대 한 매체는 10 µ g/mL 대15로 보충 되었다.
    3. 부 화, 후 PBS로 채워진 비 커에 세 번 슬라이드를 잠수 하 여 바인딩되지 않은 모든 박테리아를 제거 합니다. 설명 된 대로 그램 얼룩에 의해 박테리아를 시각화 합니다.
      1. 그것을 기울이기 고 휴지에 가장자리를 감동 하 여 각 슬라이드에서 초과 PBS를 제거 합니다. 실시간, 3-5 분에 대 한 슬라이드를 건조 하 고 불꽃을 통해 각 슬라이드 세 번 전달 하 여 준수 박테리아를 고치십시오.
      2. 얼룩 쟁반에 두 손가락으로 가장자리에서 슬라이드를 누른 다음 3-4 방울 (200-300 µ L) 2.3% 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가. 대기 60 s, 다음 슬라이드 탭의 부드러운 스트림 아래 물 3-4 s에 대 한 세척.
      3. 슬라이드에 0.33% 요오드 솔루션의 3-4 방울을 추가 합니다. 1 분을 기다려 다음 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어. 조심 스럽게 압 지에 의해 슬라이드 건조.
      4. 75%가 소 프로필 알코올 및 25% 아세톤 슬라이드에 포함 된 탈색 솔루션의 3-4 방울을 추가 합니다. 5-10 s 후 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어.
      5. 기본 carbolfuchsin 솔루션의 3-4 방울 (200-300 µ L)를 추가 합니다. 1 분을 기다려 다음 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어. 압 지를 사용 하 여 슬라이드를 건조.
      6. 시각화 선택 확대18X 100에는 기름 침수 렌즈 가벼운 현미경 박테리아. Hif WT 및 Vn HSA 코팅 유리 표면에 돌연변이 박테리아의 부착을 비교 합니다.
  2. 상피 세포에 박테리아의 Vn 종속 부착의 연구
    참고:이 효율적인 준수 분석 결과 우리의 이전 연구4,7에 사용 되었다.
    1. 문화 A549 세포 (유형 II 치조 상피 세포) 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FCS) (완전 한 매체) 및 5 µ g/mL gentamicin 보충 F12 매체와 75 cm2 조직 배양 플라스 크에. 80% 합칠 때까지 3 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 플라스 크를 품 어 (confluency 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 셀에 의해 표면 범위를 시각화 하 여 예상할 수 있는). 다음 4 단계 분석 결과19,20대 한 상피 세포를 준비 하는 방법을 설명 합니다.
      1. 부드러운 소용돌이 의해 20 mL의 PBS로 두번 플라스 크에 세포 단층을 씻어. 플라스 크 표면에서 세포를 분리, 세포 분리 효소 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 플라스 크를 품 어 모든 플라스틱 표면에서 세포를 분리 하려면 손바닥으로 플라스 크를 누릅니다. 몇 번 위아래로 플라스틱 셀 덩어리를 분산.
      2. F12 완전 한 매체의 18 mL 플라스 크에 추가 하 고 전체 세포 현 탁 액 50 mL 메 마른 팔 콘 튜브를 전송. RT에서 200 x g 에 5 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 및 삭제는 상쾌한. F12 완전 한 매체의 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
      3. 10 µ L 세포 현 탁 액의 제거 및 Eppendorf 관에 다음 Trypan 블루 솔루션의 90 µ L를 추가 합니다. hemocytometer 샘플 로드 (깊이 0.1 m m)는 coverslip 배치 후.
      4. 지역 A, B, C 및 D에에서 모든 가능한 셀 (16 사각형 이루어져 각 필드 및 각 광장 0.0025 m m2의 면적을가지고), 다음 셀의 평균 수를 계산 ([A + B + C + D] / 4). 다음 수식을 사용 하 여 밀리 리터 당 세포의 수를 계산.
        실행 가능한 셀/mL = 평균 세포 수 × 104 × 희석 요인20.
        참고: 여기, 희석 요인은 10 이다.
      5. 103 셀/mL 사용 하 여 완전 한 중간 포함 5 µ g/mL gentamicin x 5.0에 세포 현 탁 액을 희석. 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 500 μ를 분배. 셀 90% 합칠 때까지 5% CO2 에서 37 ° C에서 접시를 품 어.
    2. 세균 감염, 이전 우물에서 매체를 제거 (FCS), 없이 F12 매체 추가 그리고 37 ° c.에서 밤새 품 어
    3. 실시간 장소 얼음 판에서 세 번 PBS의 500 µ L로 세포 단층을 세척 하 고 1 시간에 4 ° C에서 v n. 품 판의 10 µ g/mL를 포함 하는 미리 냉장된 F12 매체의 100 µ L를 추가. 제어 우물만 F12 매체를 추가 합니다.
    4. 부 화, 후 pipetting으로 솔루션을 삭제 하 고 갓 재배 Hif M10 문화 실시간 Resuspend에 1 mL의 PBS로 두 번 셀 레이어를 세척 (단계 1.1.1) F12 매체 (2 × 108 CFU/mL). 각 잘에이 세균 현 탁 액의 100 µ L을 추가 하 고 2 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
      참고: 각 잘 약 2 × 105 A549 세포를 포함합니다. 감염, 세균성 CFU 추가 된 2 x 107 을 위한 100의 감염의 다양성에 대응 합니다.
    5. Pipetting으로 매체를 제거 하 고 세 번 PBS 가진 A549 상피 세포를 씻어. 세포 분리 솔루션의 50 µ L/잘 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 접시를 품 어
    6. 다음, 효소 반응을 중지를 잘 당 F12 완료 중간의 50 µ L를 추가 합니다. 각 우물에서 포함 된 4 개의 유리 구슬 6 mL 유리 관 상피 세포 (≈100 μ [즉, 전체 볼륨])를 전송. 2 분 동안 vortexing에 의해 RT에서 셀 lyse
    7. 10 µ L 세포 lysate의 약 희석 10 µ L lysate의 F12 매체의 990 µ L을 추가 하 여. 초콜릿 한 천 배지로 희석된 샘플의 10 µ L 플레이트.
    8. 하룻밤, 초콜릿 한 천 배지에서 37 ° C를 품 어 다음 식민지를 계산 합니다. 각 식민지는 하나 CFU를 나타냅니다.

3. Vn 종속 저항 인간 혈 청의 살 균 활동을 분석

  1. 상업적인 소스에서 구매 NHS입니다. 앞에서 설명한12VDS를 준비 합니다. 180 VDS 보충 nM Vn 해당 Vn 보 건국에 존재 하는.
  2. 보충 단백질을 비활성화 하기 위해 30 분 동안 56 ° C에서 NHS를가 열 하 여 열 비활성화 혈 청 (HIS)를 준비 합니다.
    참고: 최적의 혈 청 농도 (5%)와 단계 3.3-3.7에서에서 설명한 분석 결과 대 한 보육 시간 (15 분)는 Hif15에 대 한 경험적으로 결정 했다;이 매개 변수는 다른 세균성 병원 체에 대 한 다 수 있습니다.
  3. 중간 로그 단계로 (이 경우, Hif M10 돌연변이 Hif M10Δlph에) 박테리아 문화 (OD600 0.3 =). 10 분 동안 3500 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은.
  4. 우선 당 젤라틴 Veronal 버퍼 (DGVB ++, pH 7.3) 포함 2.5% (w/v) 포도 당, 2 mM MgCl2, 0.15 m m CaCl2및 0.1% (wt/vol) 젤라틴의 1 볼륨 세균 펠 릿 resuspend
  5. 1.5 x 10을 추가3 5% 혈 청을 포함 하는 DGVB ++ 의 100 µ L 박테리아의 CFU (보 건국, 그, VDS 또는 VDS + 180 nM Vn). 300 rpm에서 떨고와 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
  6. 0 분 (T0 샘플) 및 15 분 (Tt 샘플)와 초콜릿 한 천에 접시에 반응 혼합물에서 10 µ L aliquot를 제거 합니다. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
  7. 부 화, 후 접시에 식민지를 계산 합니다. 박테리아의 비율 살해12 다음 수식을 사용 하 여 계산: (TtCFU) / (T0에서 CFU) × 100.

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결과

박테리아의 표면에 Vn 바인딩 cytometry에 의해 결정 되었다. 이 연구에서 임상 격리 된 테스트 모든 Hif 셀 표면에 Vn을 채용. 세포 표면에 Vn의 상호 작용은 대장균 부정적인 제어 스트레인 (그림 1A)에 대 한 관찰 되었다. 그림 1B와 같이 PH Hif 세포의 표면에 주요 Vn-바인딩 단백질 이다. WT Hif 긴장에 의해 Vn의 바인딩 M10 발생 변화는 인구에서 Hif M10Δlph Vn 바인딩되지 않은 고는 컨트롤과 유사 하 게 나타났다.

PH와 Vn 간의 단백질-단백질 상호 작용은 ELISA와 씨에 의해 견적 되었다. 재조합 PH 인간의 요소...

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토론

세균성 병원 체 세포 표면에 Vn 모집를 보완 요인의 증 착 및 막 공격 복잡 한2의 완료를 방지 하기 위해이 보완 레 귤 레이 터. Vn 또한 기능 다리 분자 세균 표면 단백질 사이의 호스트 세포 표면 수용 체, 상피 세포의 표면에 고착 하 고 이후 국제화 중재 하 병원 체를 활성화 합니다. 이 연구에서 혈 청 저항 및의 향상을 제공에 i) 바인딩 Vn의 세균성 세포, ii) 단백질 단백질 상호 작용 및 선호도 상수의 표면 및 iii) Vn의 기능적 역할을 추정 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜 설명 호스트 세포의 표면에의 준수

Cytometry는 일반적으로 박테리아가 Vn 바인딩할 확인 하는 데 사용 하는 양적 기술입니다. 그러나, Vn 농도 Vn 바인딩 (용량과 다양 한 수용 체) 세균성 종에 따라 다를 수로, 낙관 되어야 한다. 여기서 설명 하는 분석 결과에 1-100 µ g/mL Vn의 선형 바인딩 및 채도 매개 변수 추정에 사...

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공개 사항

저자는 금융 충돌의 관심 있다.

감사의 글

이 작품 안 나 재단 에드윈 버거, Lars Hierta, O.E. 및 Edla 요한슨 재단, 스웨덴 의학 연구 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (부여 번호 K2015-57-03163-43-4, www.vr.se), 대학에서 암 재단 말 뫼, Physiographical 사회 (Forssman의 기초), 및 스 코 네 카운티 위원회의 연구 및 개발 재단에 병원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL thermomixterEppendorf5355dry block heating and cooling shaker
5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브 BD Falcon60819-13812 × 75 mm 스타일
5% CO2 공급 인큐베이터 써모 사이언티픽 
6 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브 VWR89000-47812 × 75 mm 스타일 캡
24-웰 플레이트BD Falcon08-772-1H세포 배양 등급
30% 과산화수소 (H2O2) 용액Sigma-AldrichH1009-100ML실험실 분석 등급
75 cm2 조직 배양 플라스크BD FalconBD353136Vented
96 웰 블랙 플랫 바닥 플레이트Greiner Bio-One655090조직 배양 처리 &마이크로; 투명 검은 판
A549 세포주 인간Sigma-Aldrich86012804-1VL
세포 분리 효소 (Accutase) Sigma-AldrichA6964-500ML세포 배양 등급
AR2G 센서Pall Life Science18-5095아미노 커플링에 의한 고정 단백질에 센서 
아세톤VWR97064-786분석 등급
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA2058세포 배양에 적합
바이뷸러스 종이 VWR28511-007
바이오 레이어 간섭계Pall Life ScienceFB-50258이중층 간섭계 측정 장비
크리스탈 바이올렛 용액Sigma-AldrichHT90132-1L
C4BP (C4b 결합 단백질)Complement Technology, Inc.A109냉동 액체 형태로 구입
: 염화칼슘 (CaCl2< / sub>)Sigma-AldrichC5670-500G
Carbol-fuchsin 용액Sigma-AldrichHT8018-250ML
구연산Sigma-Aldrich251275-500GAmerican Chemical Society (ACS) 등급
탈색 용액Sigma-Aldrich75482-250ML-F
E. coli 호스트 (E. coli BL21)Novagen69450-3단백질 발현 호스트
F12 매체Sigma-AldrichD6421세포 배양 등급
유세포 분석기 BD Biosciences651154연구 응용을 위한 세포 분석 등급 
태아 송아지 혈청 (FCS)Sigma-Aldrich12003C세포 배양에 적합
Normal human serum (NHS)Complement Technology, Inc.NHS풀드 인간 혈청
FITC-conjugated donkey anti-sheep 항체 AbD SerotecSTAR88FPolyclonal
GentamicinSigma-AldrichG1397세포 배양 등급
포도Sigma-AldrichG8270-1KG
젤라틴Sigma-AldrichG9391세포 배양에 적합
혈구 분석기Marienfeld640210
HRP-conjugated anti-His tag 항체Abcamab1269다클론
인간 인자 H보체 기술, Inc.A137은
C4BPComplement Technology, Inc.A109냉동 용액
인간 혈청 알부민Sigma-AldrichA1653-10G동결 건조 분말
히스티딘 친화성 수지 컬럼 (HisTrap HP)GE Health Care Life Science17-5247-01Ni Sepharose로 사전 포장
된 컬럼 His-tagged PH실험실에서 재조합 발현 및 정제
오드 용액Sigma-AldrichHT902-8FOZ
메탄올VWRBDH1135-1LP분석 등급
  현미경OlympusIX73반전 현미경
현미경 슬라이드Sigma-AldrichS8902평면, 크기 25 mm × 75 mm 
마그네슘 클로라이드 (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-1KG
플라스미드는 C 단자를 포함하고 있습니다. 백본에 6x His-tag (pET26(b))Novagen69862-3DNA 벡터
Polysorb microtitre plates Sigma-AldrichM9410ELISA용
수산화칼륨 (KOH)Sigma-Aldrich6009American Chemical Society (ACS) 등급
양 항인간 Vn 항체AbD SerotecAHP396Polyclonal
Shaker 스튜어트 사이언티픽STR6플랫폼 쉐이커
조직 배양 플라스크BD 팔콘317516775 cm2
  써모믹서 Sigma-AldrichT3317드라이 블록 가열 및 냉각 쉐이커
테트라메틸벤지딘Sigma-Aldrich860336-100MGELISA 등급
Sigma-AldrichV8379-50UG세포 배양 등급Vitronectin(Vn)
BBD6220당 의 냉동 액체로 구입했습니다. 요인간 플라즈마

참고문헌

  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709(2016).
  3. Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
  4. Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
  5. Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
  6. Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
  7. Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
  8. Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615(2017).
  9. Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
  10. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  11. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
  12. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
  13. Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
  14. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  15. Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
  16. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  17. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  18. McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4(2005).
  19. Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
  20. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
  21. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
  22. Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
  23. Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
  24. Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).

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