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방법 논문

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

10.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54683

⸱

2016년 10월 28일

 , 
1Institute for Medical Virology, University of Zurich, 2Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

이 논문에서

요약

이 논문은 비변성 PAGE와 웨스턴 블롯 분석의 조합을 사용하여 인간 세포의 용해물에서 다이나민 유사 GTPase MxA 단백질의 올리고머 상태를 평가하는 간단하고 빠른 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

올리고머 복합체의 형성은 많은 단백질의 적절한 구조와 기능을 위한 중요한 전제 조건입니다. 인터페론에 의한 항바이러스 효과기 단백질인 MxA는 많은 바이러스에 대해 광범위한 항바이러스 활성을 발휘합니다. MxA는 다이나민과 같은 GTPase이며 더 높은 차원의 올리고머 구조를 형성할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 그러나 MxA의 올리고머화가 항바이러스 활성에 필요한지 여부는 논쟁의 여지가 있습니다. 여기에서는 웨스턴 블롯 분석과 함께 비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 통해 인간 세포주의 세포질 분획에서 내인성 또는 외환성 발현 MxA의 올리고머 상태를 평가하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 효소 활성을 방해하지 않으면서 특히 MxA와 같은 세포막과 관련된 단백질의 응집 및/또는 침전을 방지하기 위해 세제를 선택하는 것입니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 단백질의 인위적인 상호 작용을 방지하기 위해 요오드아세트아미드에 의해 시스테인 잔기의 유리 티올 그룹을 비가역적으로 보호하는 것입니다. 이 프로토콜은 MxA의 올리고머 상태에 대한 간단한 평가에 적합하며, 나아가 MxA 계면 돌연변이체의 항바이러스 활성과 각각의 올리고머 상태의 직접적인 상관관계를 허용합니다.

서론

단백질의 구조는 많은 급 세포 과정에서 중요한 역할을한다. 신호 전달 경로, 유전자 발현, 효소의 활성화 / 비활성화는 모두 단백질 복합체 1-4의 적절한 조립에 의존한다. 또한, 단일 - 또는 헤테로 올리고머라고도이 프로세스는 공유 비가역 또는 가역 정전 소수성 단백질 - 단백질 상호 작용에 기인한다. 올리고머는 게놈 크기를 증가시키지 않고 상이한 세포 과정을 다양 화하지만, 단백질 변성, 열화 (5)을 향해 더 내성 안정한 착물을 구축에도 전략을 제공 아닙니다. 올리고머에 결함이 단백질의 기능에 영향을 미치는 질병의 개발로 이어질 수있다. 예를 들어, 효소 페닐알라닌 수산화이 량체 복합체를 형성한다. 단백질 단지 내 일부 돌연변이는 사량 형성을 약화시키고 질병 페닐 케톤뇨증 (6)으로 이어질 수 있습니다.

인간의 MXA 단백질은 바이러스 다양한 RNA에 대한 광범위한 항 바이러스 활성을 발휘 이펙터 단백질과 DNA 바이러스 7을 유도 된 인터페론 (IFN)입니다. 그것은 dynamin 같은 대형 GTP 아제의 슈퍼 패밀리에 속한다 체외 8 큰 올리고머 구조를 형성 할 수있는 능력을 갖는다. 올리고머는 급속한 저하 9,10에서 MXA을 보호하기 위해 제안되었다. 많은 연구 그룹에 의해 집중적 노력에도 불구하고, 액션의 분자 메커니즘은 크게 어려운 유지 및 바이러스 기능 MXA의 올리고머 화 상태의 역할은 논쟁 9,11,12 중이다. 이와 관련하여, 가오와 동료 MXA 큰 링형 올리고머 구조 (11)의 형태 nucleoproteins 바이러스와의 상호 작용에 의해 항 바이러스 활성을 발휘하는 모델을 제안 하였다. 그러나,보다 최근에는 MXA 이량 체는 항 바이러스 활성을 나타내는 인플루엔자 바이러스 (12)의 핵 단백질과 상호 작용하는 것을 보여 주었다. 비MXA의 결정 구조에 ased 가오 동료는 시험 관내에서의 올리고머 및 바이러스 11,13 기능에 중요한 인터페이스 영역의 몇 아미노산 잔기를 확인 하였다. 따라서, 항 바이러스 활성을 나타낸다 MXA의 올리고머있는 상태 규명하기 위해, 우리는 급속 내인성 MXA는 IFNα 자극 후 발현뿐만 아니라 인간 세포에서 발현 MXA 인터페이스 돌연변이 oligmeric 상태를 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설정하기 위해 노력했다.

일반적으로 이러한 분할 녹색 형광 단백질과 같은 단백질 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용되는 많은 방법이 있지만 (분할-GFP) 상보성 분석 (14), 표면 플라스 몬 공명 (15) 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) (16)들은 제공하지 올리고머 단백질 복합체의 정확한 화학 양론의 정보를 제공합니다. 이 특정 측면의 조사, 기술 등멀티 앵글 광 산란 (MALS) 17 및 분석 초 원심 (18)는 매우 유용합니다. 일반적으로 이러한 방법을 사용하여 분석 한 단백질은 정제 된 단백질이다. 올리고머 화 공정은 또한 다른 세포 인자에 의존 할 수있다. 이러한 요인을 알 수있는 경우, 분석은 더욱 곤란하다. 또한, 일부 단백질은 E.에서 표현하기 어려운 대장균 및 정화. 따라서,이 방법은 세포 환경에서 단백질 올리고머를 분석 할 수있는 최적의 선택되지 않습니다. 또한, 이러한 기술은 용이하게 사용할 수있는 고가의 장비를 필요로한다.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE), 크기 배제 크로마토 그래피 또는 종래의 도데 실 황산나트륨 (SDS) -page 뒤에 화학적 가교 세포 용 해물 2,19,20에서 올리고머 형성의 특성을위한 유용한 도구이다. 이러한 방법은 전문 장비가 필요하지 않습니다 쉽게 체육 될 수 있습니다표준 실험실에서 rformed. 우리는 처음에 가변되지 않은 특정 집계와 MXA의 침전되었다 다양한 화학 가교 프로토콜을 평가 하였다. 따라서, 우리는 다음 비 변성 PAGE 프로토콜을 테스트했다. 비 - 변성 PAGE는 SDS의 사용을 배제 같이, 단백질의 이동은 그 나라의 전하에 의존한다. 블루 기본 페이지는 SDS 유사한 전반적인 음전하와 단백질을로드 쿠마 빛나는 푸른 G250을 사용하지만 단백질 (21) 변성하지 않습니다. 불행하게도, 높은 염 종종 용해 버퍼에 포함되는 가의 양이온 (예를 들어 Mg를 2+)의 존재 브릴리언트 블루 침전물을 쿠마. 사용 된 버퍼에 따라, 올리고머 단백질 복합체에 영향을 미칠 수있는 단계를 더 최적화없이 샘플을 분석하기 어려울 수있다.

여기에서 우리는의 올리고머를 결정하기 이전에 발행 된 방법 (22)에 기초한 간단한 프로토콜을 제시비 - 변성 PAGE를 사용하여 세포 용 해물로부터 유도 된 인간 MXA 단백질.

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프로토콜

주 :이 프로토콜은 이전에 발행 된 비 - 변성 PAGE 프로토콜 (12)에 기초한다. 이 연구에서, MXA 단백질 올리고머 상태 내인성 MXA 표현 MXA 과발현 베로 세포 또는 IFN-α 자극 A549 세포를 사용하여 평가 하였다. 후술되는 프로토콜 MXA 이외에 어떤 단백질 올리고머 상태를 분석하는데 사용될 수있다. 그러나, 더 최적화가 필요할 수 있습니다.

비 변성 페이지에 대한 세포 용 해물 1. 준비

주 : 하나 또는 베로 A549 세포에서 인간 MXA 단백질 올리고머 상태를 분석하기 위해, 1.0 × 106 세포를 수확 하였다. 세포 유형 또는 분석하는 단백질 풍부에 따라, 세포 수를 조정해야한다. 이는 곧 감광 요오도 아세트 아미드를 첨가 한, 노광에서 용해 완충액을 보호하는 것이 중요하다.

  1. 잘 당 종자 0.3 × 10 6 A549 또는 베로 세포에서6 잘 요리한다. 웰 당 2 ml의 성장 배지에서 세포를 유지하고 (표 1 참조). 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 세포 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2).
  2. 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖로 세척하여 세포를 수확하고, 0.5 ml의 0.25 % 트립신 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 실온에서 약 5 분 동안 1X 용액을 첨가하여 분리.
  3. 즉시 세포가 접시에서 분리로, 0.5 ml의 성장 매체를 추가하고 조심스럽게 피펫 팅 아래로 섞는다.
  4. 잘 한 2 ML 튜브에 각각의 세포를 전송하고 테이블 톱 원심 분리기 (5,000 XG, 4 ° C, 5 분)를 사용하여 펠렛.
  5. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 피펫으로 상층 액을 제거합니다.
  6. 심하게 상하 세포 현탁액을 피펫 팅에 의해 1 ml의 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다.
  7. 테이블 위에 원심 분리기에서 펠렛 세포 (5,000 XG, 4 ° C, 5 분).
  8. 조심스럽게 위스콘신 피펫 팅하여 상층 액을 제거세포 펠렛을 분리 사전 통 보없이.
  9. 로 pipetting 아래 얼음에 넣어 200 ㎕의 빙냉 용해 완충액 (표 1 참조)에 재현 탁 된 세포.
  10. 즉시 주석 호일을 사용하여 얼음에 30 분 동안 품어 튜브를 덮어 빛 해물를 보호합니다.
    참고 : 무료 티올 그룹의 보호를 되돌릴 수 있기 때문에 얼음에 30 분 동안 배양 한 후에는 더 이상 빛에 노출에서 해물을 보호하기 위해 필수적이다.
  11. 미리 냉장 테이블 탑 원심 분리기 (13,000 XG, 4 ° C, 20 분)에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
  12. 원심 분리 단계에서 20 분 동안 4 ℃에서 냉각 실의 투석 완충액 (표 1)에서 투석 열 평형. 10,000 잘라 분자량 열을 사용합니다.
    1. 플로트 부표에 열을 연결하고 투석 버퍼 가득 비커에 넣어. 부드러운 교반을 보장하기 위해, 자석 교반기를 사용합니다. 멤브레인을 만지지 마십시오.
      참고 : Dialys열은 구입 또는 FIALA 및 동료 (19)에 의해 기술 된 프로토콜에 따라 1.5 ml의 튜브로부터 제조 될 수있다.
  13. 투석 버퍼와 플로트 부표에서 열을 제거합니다. 멤브레인을 건드리지 않고 피펫 팅에 의해 제조 된 투석 열로 삭제 해물을 전송합니다. 플로트 부표에 열을 연결하고 투석 버퍼로 가득 비커에 다시 넣어.
  14. 신중 자기 교반기를 사용하여 교반하면서 4 ℃에서 적어도 4 시간 (바람직 밤새) 미국 빙냉 투석 완충액 (표 1)을 함유하는 비이커에 해물을 투석. 200 μl의 용 해물 적어도 100 ㎖ 투석 버퍼를 사용합니다.
  15. 1.5 ML 튜브로 투석 샘플을 전송합니다. 테이블 탑 원심 분리기 (13,000 XG, 4 ° C, 20 분)에서 원심 분리하여 침전물을 제거합니다. 단지 바로 투석 후 프로토콜 (섹션 2) 계속 올리고머 단백질의 분해를 방지합니다. 냉동하지 마십시오준비된 해물.

2. 전기 영동

참고 : 일부 수정 (22) 전술 한 바와 같이 전기 영동을 실시 하였다. 후술 프로토콜, 프리 캐스트 구배 겔 (4 % -15 % 구배)을 사용 하였다. 대안 적으로, 겔은 실험실에서 제조 될 수있다. 이는 SDS는 올리고머 단백질 복합체의 해리를 방지하는 등의 임의의 변성제를 배제하는 것은 매우 중요하다. 전기 영동시 인간 MXA 단백질의 상이한 올리고머 상태에 대해 최적화되었다. 그러나, 올리고머 복합체의 크기뿐만 아니라 복잡한 분석을 달성 할 것으로 예상되는 분리의 범위에 따라, 다른 단백질에 대해 변할 수있다. 따라서, 전기의 최적 시간은 경험적으로 결정되어야한다. 올리고머의 최적 해상도를 분석하기 위해서는 전류가 25mA를 초과 할 수 없습니다.

  1. 겔 챔버 내의 비 - 변성 PAGE 겔을 조립한다. t 채우기미리 냉각 주행 완충액 (표 1)와 그 내부 및 외부 챔버.
  2. 4 ℃에서 추운 방에서 15 분 동안 젤 당 25mA에서 미리 냉장 실행 버퍼 젤을 미리 실행합니다.
  3. 4X 샘플 버퍼 5 μl를 (표 1)를 상기 제조 된 용 해물 15 μL를 혼합한다. 샘플을 끓여하지 마십시오.
  4. 15 샘플의 μL 겔에 선택의 천연 단백질 표준을 넣습니다. 4 ℃에서 추운 방에서 4 시간 동안 25mA에서 젤을 실행합니다.
    주 : 반 정량 분석을 위해, 단백질 정량화 프로토콜 (예를 Bradford 단백질 분석 23) 레인 당 총 단백질의 동일한 양의 부하를 보장하기 위해 수행 될 수있다.

3. 서양 얼룩

참고 : 아래 설명은 젖은 웨스턴 블롯 시스템의 프로토콜입니다. 상관 블 롯팅 막을 사용할 수있다. 버피 블 롯팅으로 평형화 전에 100 % 메탄올, 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 활성화FER. 반 건조 웨스턴 블랏 기술은 대안 적으로 사용될 수 있지만, 큰 올리고머 성 복합체에 대해 최적화되어야한다.

  1. 젤을 분해 조심스럽게 SDS 버퍼 (표 1)로 전송합니다.
  2. 부드럽게 진탕하면서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
  3. 이 스폰지 4 셀룰로오스 필터 종이 시트 당 겔 블롯 막을 제조. 버퍼 (표 1) 모래 바닥에서 그들을 만끽 해보세요.
  4. 한 스폰지,이 셀룰로스 여과지 시트, 막, 겔,이 셀룰로오스 필터 종이 시트 일 스폰지 (상하로)를 다음과 같이 샌드위치를 ​​조립한다.
  5. 블로 팅 탱크에 샌드위치를 ​​넣습니다. 젤은 마이너스 극에 직면하면서 막 플러스 극에 직면 해 있는지 확인합니다.
  6. 사전 냉장 블로 팅 버퍼로 블로 팅 탱크를 채우십시오.
  7. 최고의 단백질 전송 결과를 4 ℃에서 하룻밤 90mA에서시킨다.
  8. 샌드위치를 ​​분해 Ponc의 막을 배양함으로써 단백질 표준을 시각화실온에서 5 분 동안 오 S 용액.
  9. 명확 단백질 표준의 밴드를 볼 수있을 때까지 조심스럽게 탈 이온수 폰소 s를 세정 막 Destain.
  10. 펜을 사용하여 단백질 표준의 밴드를 표시한다.
    참고 : 잔류 폰소 s는 면역 염색을 방해 할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 상기 멤브레인은 탈 이온수로 1 분 이후의 세정에 0.1 M NaOH로 인큐베이션하여 상기 탈색 될 수있다.
  11. 버퍼 블로킹 멤브레인을 차단하고 실온에서 적어도 1 시간 또는 밤새 39 ° C에 대해 (표 1 참조).
  12. 분석하고자하는 단백질에 대한 항체를 이용한 면역 염색으로 관심 단백질 (들)을 가시화.
    주 : 완충액 (표 1)은 블록 1000 : 인간 MXA 단백질이 인간 MX1 특정 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 시각화 하였다 (1) 희석 하였다. 항체 용액을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 대안 적으로, 단일 클론NTI-MXA 항체 (클론 143) (24) (데이터는 도시하지 않음)이 사용될 수있다.

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결과

비 - 변성 PAGE를 사용하여, 우리는 인간 야생형 MXA, 다이머 인터페이스 돌연변이의 MXA (R640A)와 MXA (L617D)뿐만 아니라, 세포 용 해물 (12)로부터의 단량체 인터페이스 돌연변이 MXA (M527D)의 올리고머 상태를 분석했다. 세포를 1 % octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) 및 요오도 아세트 아미드는 단백질의 가용화 및 유리 티올 기의 보호를 보장하기를 함유하는 완충액에 용해시켰다 (도 1 참조). 앞서 설명한 바와 같이, 소금, 작은 대사 산물은 투석 (19)에 의해 제거 하였다. 단백질 분리는 비 변성 PAGE에 의해 행했다. 효율적인 웨스턴 블로 팅을 용이하게하기 위해, 겔 블롯 전에 SDS 완충액 하였다. MXA 단백질은 MXA 향한 토끼 폴리 클로 날 항체를 이용한 면역 염색으로 가시화 하였다. 워크 플로는 그림 2에 설명되어 있습니다.

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토론

여기에서 우리는 웨스턴 블롯 분석 한 다음 비 변성 PAGE에 의해 포유 동물 세포에서 발현 된 단백질의 올리고머 상태의 빠른 결정을 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 중요한 이점은 주어진 단백질의 올리고머 상태 전에 단백질 정제없이 전체 세포 용 해물로부터 결정될 수 있다는 것이다. 이 올리고머 또는 보조 요인과 관련하여 그 기능을 발휘 단백질 중요 할 수있다. 또한, 단백질은 천연 상태로되어 있고, 상기 겔로부터 추출하는 경우, 효소 활성 또는 다른 단백질의 기능을 결정 올리고머 상태로 상관 될 수있다.

이 프로토콜의 중요한 측면은 샘플 준비하는 동안 세제의 선택입니다. 이것은 세포막과 관련된 단백질 특히 중요하다. MXA 주로 평활 소포체 (25)의 막과 연관되는 것으로 보인다 . 세포 용해를 들어, 비이 온성 세제는 NP40 MXA의 석출을 방지하는 최적이었다. 이전 19 바와 같이 버퍼 교환 및 투...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 스위스 국립 과학 재단(Grant nr. 31003A_143834)이 JP에 제공하는 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Slide-A-Lyzer MINI 투석 유닛, 10K MWCO, 0.5 mlThermo Fisher Scientific69570투석 완충액에서 사전 평형 (글리세롤 제거가 필요한 경우)
Fiala et al. 2011
4&ndash에 따라 자체 제작 가능; 15% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 젤, 10-well,Bio-Rad456-1083버퍼 시스템을 조정하기 위해 실행 중인 버퍼에서 Pre-run 실행 중
미니, EDTA-freeRoche 1183617000150 ml
PBS, pH 7.4 당 1 정을 사용하십시오. 500 ml GibcoThermo Fisher Scientific14190-094
Ponceau S 용액Sigma-AldrichP7170TOXIC 장갑을 착용하고 눈을 보호하십시오
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µ lInvitrogenP/N 57030로드 5 &마이크로; l/well
A549 세포ATCCATCC CCL185성장 배지에서 성장(표 1 참조)Vero
세포ATCC ATCC CCL81성장 배지에서 성장(표 1 참조)
anti-Mx1 항체Novus BiologicalsH00004599_D01P1:1,000 희석에서 사용
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody(from 당나귀)GE-HealthcareNA934V1:10,000 희석
0.5% Trypsin-EDTA (1x)              Life TechnologiesThermo Fisher15400-054
요오도아세트아미드    5 gSigma-AldrichI-6125재고  100 mM
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologiesThermo Fisher Scientific41966-029
Pen  연쇄상 구균 100 x        100ml                            생명 기술Thermo Fisher Scientific15140 - 130
Glutamax 100x 재고, 100 ml        생명 기술Thermo Fisher Scientific350500-038
태아 소 혈청, 투석, 미국 원산지 500 ml Gibco Lot:42G9552KThermo Fisher Scientific10270-106
셀룰로오스 여과지Bio-Rad1703965
PVDF 블로팅  막GE-Healthcare10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneBiosolve0020092391BS
나트륨 플루오라이드 (NaF)Sigma AldrichS-7920
NP-40Calbiochem492015
cOmplete, Mini, EDTA-freeRoche 
11836170001 트윈 20Calbiochem6555204
CHAPS 10% 용액AmrescoN907
DL-디티오트레이톨(DTT)시그마 알드리치43819
글리신바이오솔브0007132391BS
오르토바나데이트 나트륨(Na3VO4)시그마 알드리치450243
글리세롤시그마 알드리치G7757
β-글리세로포스페이트시그마 알드리치G9422
분유Migros/Switzerland
메탄올밀리포어1.06009
클로라이드나트륨(NaCl)시그마 알드리치71380
염화마그네슘(MgCl2)Amresco288
나트륨 도데 실 황산염 (SDS)시그마 알드리치L4509
수산화 나트륨 (NaOH)시그마 알드리치S-8045
, .

참고문헌

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