Method Article

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

DOI:

10.3791/54692

⸱

November 23rd, 2016

 ,  , 
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

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엽록체의 표면에서 뻗어 있는 스트로마로 채워진 세뇨관인 엽록체 스트로뮬의 역학을 조사하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

Abstract

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Stromules 또는 "stroma-filled tubules"는 엽록체 표면에서 좁고 관 모양으로 뻗어 있는 것으로, 식물 세포에서 보편적으로 관찰되지만 그 기능은 여전히 신비로 남아 있습니다. 스트레스에 대한 식물 반응을 조정하는 엽록체의 역할에 대한 관심이 높아짐에 따라, 스트로뮬 역학을 빠르고 정확하게 시각화할 수 있는 형광 현미경 및 단백질 형광단의 발전에 힘입어 스트로뮬 및 엽록체 신호 역학과의 관계에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 증가했습니다. 여기에서는 엽록체 스트로뮬 생물학을 조사하기 위한 우수한 모델 시스템인 Nicotiana benthamiana의 표피 엽록체에서 스트로뮬 빈도를 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 잎에서 엽록체를 추출하여 엽록체 스트로뮬을 체외에서 시각화하는 방법도 제공합니다. 마지막으로, 환경 스트레스, 화학적 처리 또는 유전자 침묵과 같은 자극에 대한 반응으로 스트로뮬 빈도의 차이를 분석하기 위한 샘플링 전략과 통계적 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 연구원들은 이러한 프로토콜을 시작점으로 사용하여 엽록체가 스트로뮬을 만드는 방법과 이유를 탐구하기 위한 혁신적인 실험을 위한 새로운 방법을 개발할 수 있습니다.

Introduction

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엽록체는 광합성과 다른 많은 대사 과정을 담당하는 식물 세포의 동적 소기관입니다. 엽록체의 신호 경로는 또한 식물의 생리학 및 발달에 상당한 영향을 미치며, 환경 스트레스, 병원균 및 심지어 잎 모양1-6에 대한 식물의 반응을 조정합니다. 최근 생물학자들은 엽록체 구조에 대해 잘 이해되지 않은 측면, 즉 엽록체7의 표면에서 뻗어 있는 매우 얇은 기질로 채워진 세뇨관인 스트로뮬(stromules)에 관심을 갖게 되었습니다.

스트로뮬의 생물학적 기능은 아직 알려져 있지 않으나, 스트로뮬의 빈도는 환경적 자극7-9에 대한 반응으로 변하는 것으로 알려져 있으며, 스트로뮬은 세포소기관6 간에 신호 분자를 전달할 수 있다. 모든 유형의 플라스티드(녹색, 광합성 엽록체뿐만 아니라 투명 류코플라스트, 전분으로 채워진 아밀로플라스트, 색소 염색체, 몇 가지 유형의 플라스티드)가 스트로뮬을 만들며, 스트로뮬은 현재까지 조사된 모든 육상 식물 종에서 발견됩니다. 스트로뮬은 동적으로 확장 및 축소되어 몇 초 내에 나타나거나 사라지거나 오랫동안 상대적으로 정지해 있을 수 있습니다. 스트로뮬 생물학자들이 직면한 주요 장애물 중 하나는 스트로뮬이 종종 극적으로 다른 방법, 조직 및 종을 사....

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Protocol

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참고 :이 프로토콜을 위해, 우리는 N의 표피에 stromule 주파수을 분석에 초점을 맞추고있다 benthamiana 나뭇잎. FNRtp : EGFP 13 NRIP1 6 세룰 리안 여러 안정한 형질 전환 라인 35S PRO 포함하여 이러한 목적을 위해 사용될 수있는 생성되었다. 이 라인은 모두 광범위한 조건 하에서 성장 잎의 엽록체 기질의 형광의 강력한 표현을 보여줍니다. 대안 적으로, 엽록체 표적 형광체는 일시적 N. 표현 될 수있다 benthamiana하여 아그로 13 변형. 아그로 박테 리움이 침입 N. 일부 기초 방어 반응을 유도하기 때문에 이것은 트랜스 제닉 라인보다 적합 아그로 박테 리움과 benthamiana과 상호 작용 가능성이 결과의 해석을 복잡하게 잎 14 stromule 주파수를 변경할 수 있습니다. 마지막으로, 시험 관내에서 stromule 형성을 시각화하기 위해,아래의 섹션 5에 기술 된 바와 같이 엽록체는 유전자 코드 형광체 또는 형광 염료를 사용하여, 임의의 ....

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Results

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이 프로토콜은 젊은 N.의 자엽에서 하루 밤에 stromule 주파수를 시각화하는 데 사용 된 benthamiana 모종. Z- 스택에서 슬라이스는 하나의 이미지 (그림 1A)에 병합되었다. 시각적 인 목적을 위해, 그 이미지는 흐릿한과 기질 블랙 (그림 1B)를 나타나도록 반전했다. 엽록체는 하나 더 stromules (녹색 별표)를 갖지 않는 또는 적어도 하나 stromule (마젠타 별표)을 갖는 것으로 분류되었다. 시각 87 표피 엽록체 중 33 stromules 있습니다. 따라서,이 판의 stromule 주파수는 37.9 %이다.

이 분석을 이용하여, 프로토콜은 밤낮 24 식물 총 21 중에 다른 식물 (식물 당 리프)에 대해 반복 하였다. 하.......

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Discussion

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stromules을 조사 할 때, 세 가지 중요한 요인 전반에 걸쳐 고려되어야한다 : 절대 최소로 유지해야 식물 조직의 (ⅰ) 조작, (ⅱ) 실험 시스템은 일관성을 유지해야하며, (ⅲ) 샘플링 전략은 신중을 계획해야합니다 강력한 보장, 재생 가능한 데이터 분석된다.

Stromules는 매우 동적 : 그들은 확장하고 현미경 관찰자의 눈 앞에 빠르게 철회 할 수 있습니다. 또한 stromule 주파수 (예 : 잎 상처 등) stromules를 시각화하기 위해 피할 수없는 자극 치료를 포함하는 넓은 범위에 대응하여 크게 변화한다. 여기에 설명 된 프로토콜로 해결되는이 문제에 대한 주요 솔루션은 일관성있는 모든 변수를 유지, 잘 조절 된 실험을 수행하는 것입니다. 이것은 바로 현미경으로 데리고 전에 시각화를위한 각 샘플의 제조, 예를 들어, 포함하고; 식물이 손상되지 않아야시각화 직전까지. 잎을 제거하거나 손상시키지 않고 이상적으로, 치료는 어떤 식물에 직접 적용한다 :이 문제의 제.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.O.B.와 A.M.R.은 국립과학재단(National Science Foundation)의 박사 전 펠로우십의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HepesSigma-AldrichH3375
NaOHFischer-ScientificS320-1
소르비톨시그마-알드리치S1876
EDTA피셔-바이오테크BP121
MnCl2Sigma-Aldrich221279
MgCl2Sigma-AldrichM0250
KClSigma-AldrichP3911
NaClSigma-AldrichS9625
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 Carl Zeiss Inc모델: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)Sigma-Aldrich21879 
디메틸 설폭사이드 (DMSO)EMDMX1458-6
Waring 블렌더Waring 모델: 31BL92
피지fiji.sc생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
  2. Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucl....

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Stromule FrequencyFluorescence MicroscopyChloroplast IsolationConfocal MicroscopyStromule VisualizationNicotiana BenthamianaChloroplast StromulesStromule AnalysisStromule FormationStromule Dynamics

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