방법 논문

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

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DOI:

10.3791/54698

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2016년 11월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

이 논문에서

요약

많은 실험 시스템은 면역 반응의 T 세포의 발달 및 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하는 데에 이용되고있다. 여기 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전 적 접근 경로를 규정하는 식별 경제적 시간 효율적이고, 무엇보다도 매우 유익하다 설명한다.

초록

도우미 T세포의 발달과 기능은 특정 병원체를 제거하면서도 자가면역을 막는 적절한 면역 반응을 유도하기 위해 엄격하게 조절되어야 합니다. 보조 T 세포 발달 및 기능을 제어하는 메커니즘을 이해하기 위해 다양한 모델 유기체를 포함하는 많은 접근 방식이 활용되었습니다. 그러나 마우스 모델을 사용한 연구는 유전학, 세포 및 생화학 시스템의 가용성으로 인해 매우 유익한 것으로 입증되었습니다. 많은 실험실에서 사용되는 생쥐의 한 가지 유전적 접근법은 1차 보조 T 세포의 레트로바이러스 형질도입을 포함합니다. 이는 상대적으로 쉽기 때문에 강력한 접근 방식으로, 분자 생물학 및 면역학의 기본 기술을 갖춘 거의 모든 실험실에서 사용할 수 있습니다. 그러므로, 야생형 또는 돌연변이 형태의 여러 유전자는 도움 T 세포의 기능에 대해 쉽게 테스트하여 그 중요성과 작용 메커니즘을 이해할 수 있습니다. 당사는 이 접근법을 최적화했으며, 여기에서 고역가 레트로바이러스의 생산, 1차 쥐 보조 T 세포의 분리, 레트로바이러스에 의한 형질도입 및 다른 보조 하위 집합으로의 분화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 이 접근법의 사용은 보조 T 세포 발달 및 기능을 제어하는 경로를 조절하기 위해 microRNA(miRNA)가 사용하는 메커니즘을 밝히는 데 설명되어 있습니다.

서론

면역 반응은 감염을 제거하기 위해 고도로 조절되어야 하지만 자가면역으로 이어지는 자가조직에 대한 공격을 예방해야 합니다. 보조 T 세포는 면역 반응을 조절하는 데 필수적인 역할을 하며, 이들의 발달과 기능을 이해하기 위해 많은 노력이 기울여져 왔습니다(최근의 여러 리뷰 1-3에 설명되어 있음). 그러나 많은 의문이 남아 있으며, 보조 T 세포의 발달과 기능을 제어하는 메커니즘을 연구하기 위해 많은 접근법이 활용되어 왔습니다. 이는 체외 세포 배양 시스템의 사용에서 전체 동물에 이르기까지 다양합니다. 세포 배양 시스템, 특히 세포주를 사용하는 시스템은 사용이 간편하고 정교한 생화학 분석을 수행하기 위해 많은 양의 물질을 생성할 수 있는 기능을 제공합니다. 그러나 그들은 면역 반응에서 발생하는 실제 상태를 재현하는 능력이 제한되어 있습니다. 이와는 대조적으로, 전체 동물 실험은 관련성의 이점을 제공하지만, 큰 비용과 윤리적 함의뿐만 아니라 조작의 어려움과 정확한 통제를 수행할 수 있는 능력으로 어려움을 겪을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 오늘날 대다수의 보조 T 세포 연구는 세포주가 전체 동물에서 발생하는 정확한 단계를 복제할 수 없기 때문에 여전히 1차 T 세포를 포함하는 전체 동물 실험을 필요로 합니다. 따라서 매우 유익한 비용 효율적인 접근 방식을 활용하는 것이 필수적입니다.

Genetics는 보조 T 세포의 발달과 기능을 연구하는 강력한 도구 중 하나이지만, 유전자 knockout이나 transgenes와 관련된 전통적인 방법은 시간과 비용이 많이 들기 때문에 종종 소규모 실험실의 손이 닿지 않는 곳에 있습니다. 그러나 레트로바이러스 형질도입은 특정 유전자 산물의 메커니즘을 연구하기 위한 강력하고 빠르며 비용 효율적인 유전적 접근 방식을 제공합니다. 따라서 보조 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 논문에서 일반적으로 사용됩니다.

우리는 보조 T 세포의 레트로바이러스 형질주입을 위한 절차를 최적화했습니다. pMIG(Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) 레트로바이러스 발현 벡터를 활용하며, 관심 유전자를 클로닝하여 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR) 4에서 발현할 수 있습니다. 또한, 삽입된 관심 유전자의 다운스트림에는 내부 리보솜 진입 서열(IRES)과 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자가 이어지므로 형질도입된 세포는 GFP의 발현을 쉽게 따를 수 있습니다. 이 벡터는 원래 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV) 벡터에서 유래했으며, 이 벡터는 LTR의 억제 인자 결합 부위에 돌연변이를 포함하여 침묵에 저항하므로 보조 T 세포 5,6를 포함한 많은 세포 유형에서 높은 발현을 제공합니다. 고역가 레트로바이러스를 생산하려면 MIG 벡터와 레트로바이러스 GAG, Pol 및 Env 유전자를 발현하는 도우미 바이러스 벡터를 가진 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포의 간단한 일시적 transfection 프로토콜이 필요합니다. 이를 위해 pCL-Eco helper virus vector 7은 고역가 복제, 무능한 레트로바이러스를 생산하는 데 효과적입니다.

여기에서는 1차 쥐 T 세포의 레트로바이러스 생산 및 형질도입을 위한 이러한 프로토콜에 대해 설명하며, 이 접근법을 사용하여 보조 T 세포 분화를 제어하는 유전자 발현의 miRNA 조절을 연구하는 데 사용한 일부 결과에 대해 설명합니다. miRNA는 약 22개의 뉴클레오티드 길이를 가진 작은 RNA로, 전령 RNA를 암호화하는 단백질에서 상동 염기서열을 표적으로 하고 번역을 억제하고 유도함으로써 전사 후 유전자 발현을 조절합니다. 메시지 불안정 8,9. miRNA는 발달 유전자 조절에 중요한 역할을 합니다. miRNA를 생산할 수 없는 배아는 매우 초기 단계에서 죽기 때문에 발달의 초기 단계에서 필수적입니다 10. 또한 miRNA는 나중에 많은 조직의 발달에서 중요합니다. 그들은 발달 프로그램에 필요한 유전자의 발현을 미세 조정하여 기능하는 것으로 생각됩니다 1. 보조 T 세포에서 miRNA는 여러 역할을 하며 조절 T 세포(Treg) 발달에 필요합니다 11-14. Treg 분화의 miRNA 조절 메커니즘을 해부하기 위한 수단으로 레트로바이러스 형질도입을 사용했습니다 15. 이러한 연구를 통해 중요한 개별 miRNA는 레트로바이러스 매개 과발현에 의해 결정되었습니다. 그 후, 보조 T 세포 분화에서 miRNA에 의해 조절되는 분자 경로를 이해하기 위해 이러한 miRNA에 의해 조절되는 관련 유전자를 확인했습니다.

프로토콜

이러한 프로토콜에서 수행되는 모든 마우스 작업은 동물 프로젝트 라이센스 6천9백65분의 70에서 동물 과학적인 절차 법, 영국에 따라 수행 하였다.

1. 레트로 바이러스 생산

이전 절차와 유전자 변형 유기체 포유 동물 세포의 레트로 바이러스의 사용을 제조하기위한 모든 필요한 승인을 얻었다.

  1. HEK 293T 세포의 성장
    1. 10cm 조직 배양 HEK 293T 배지에서 요리를하는 HEK 293T 세포 성장 (10 % 소 태아 혈청을 가진 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) (FBS), 100 단위 / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 글루타민) . 일반적으로 세포 통로를 들어, 분할 세포 1:10 그들은 매체를 제거하고 신선한 HEK 293T 매체와 함께 접시 떨어져 세포를 피펫 팅으로 합류에 도달했을 때.
      참고 : 세포 2-3 일 합류에 도달해야한다. 293T HEK 세포는 그렇게 트립신이 필요하지 않은 판에 느슨하게 연결합니다.
    2. 24 시간은 형질 전환 이전하는 conflue을 분할다음날 세포가 ~ 50 %의 합류 연결되도록 10cm 플레이트 (형질 전환 당 하나의 판)에 세포 1:10 NT 판.
  2. 인산 칼슘의 침전에 의해 형질
    1. 약 1 시간 전에 형질로, 세포에서 매체를 제거하고 조심스럽게 접시에서 분리 세포를 방지하기 위해 신선한 HEK의 293T 매체의 9를 가하여.
    2. 배 헤 페스 완충 식염수 (배 HBS) 표 1에 설명 된대로 신선한 2.5 M CaCl2를 솔루션을 준비합니다. DNA의 주식을 녹여. 가장 효율적인 형질에 대한 플라스미드 준비 품질 DNA를 사용합니다.
    3. 6 ml의 둥근 바닥 또는 15 ml의 원뿔 튜브 5 레트로 바이러스 DNA (pMIG) 4 μg의, 도우미 바이러스 DNA (PCL-에코) (7)의 5 μg의, 그리고 H 2 O 420 μl를 추가합니다. 500 μL에 최종 볼륨을 가져 오는 2.5 M CaCl2를 80 μl를 추가합니다.
      참고 :이를 다음 단계 (2 배 HBS의 추가)와 함께 일반적인 아이돌만큼 정기적 벤치에 수행 할 수 있습니다ILE 기술이 사용된다.
    4. 이 솔루션은 지속적으로 혼합하고 카포 4도 크기의 결정에 침전되도록 부드럽게 텍싱하면서 천천히 위의 DNA 혼합물에 드롭으로 2 배 HBS 드롭의 500 μl를 추가합니다.
    5. 지속적으로 부드럽게 판을 소용돌이 치는 동안 세포를 포함하는 매체의 9 ml의에 카포 4 DNA 혼합물 (1 ml)을 적가을 추가 서서히 조직 문화 후드로 이동합니다. 다시 한번 판에서 세포를 분리하지 않도록주의하십시오. 다시 인큐베이터로 세포를 놓습니다.
      참고 :이 시점에서 카포 4 침전물 박테리아의 크기에 대한 작은 결정으로 현미경 쉽게 볼 수 있습니다. 결정이 판의 바닥에 정착 할 수있는 기회가있을 때이 쉽게 30 ~ 60 분 후에 볼 수 있습니다.
  3. 문화 상층 액에서 바이러스의 컬렉션입니다.
    1. (어디 형질 전환 후 12 ~ 24 시간에서) 다음 날은 매체를 제거하고 10 ml의 세포를 공급신선한 HEK의 293T 매체의 다시 한 번 판에서 셀을 제거하지 않도록주의.
      주 : 이것은 HEK 293T 세포의 형질 감염이 동안 배지에 분비 림프구 저해 물질을 희석시킨다.
    2. 둘째 날 (~ 24 시간 후 형질)의 저녁 신선한 HEK의 293T 매체의 3.5 ml의와 세포를 공급. 한 쪽이 건조 왼쪽되지 않도록 판은 인큐베이터에서 정확히 수준을 배치되도록주의해야합니다.
    3. ~ 12 시간 이상 (4 ℃에서 저장) 및 신선한 HEK의 293T 매체의 3.5 ml의 먹이 매체를 수집합니다. 반복 회수 2 회 이상 대략 중간의 약 10 ㎖가 수집되도록 12 시간 간격. 이 바이러스 재고입니다.
    4. 5 분 동안 600 XG에 원심 분리하여 잔류 HEK의 293T 세포와 세포 파편을 스핀. 대안 적으로, 0.45 μm의 바인딩 낮은 단백질 주사기 필터를 사용하여 필터링. 역가 천천히 4 ° C에서 감소하므로 저장 4 ° C에서 바이러스, 최고의 역가에 대해는 하루 이틀 내에 사용합니다. 호텔 fr하지 마십시오이 크게 감소 역가로서 eeze.

차 나이브 CD4 + T 세포의 2. 분리

  1. 백혈구 세포의 분리
    1. 자궁 경부 전위, CO 2 질식 또는 기관의 동물 취급 규칙에 적합한 다른 인간 프로토콜에 의해 쥐를 안락사.
    2. 갓 안락사 쥐를 해부하고 비장을 제거하고 원하는 림프는 15 노드. R10 배지 (10 % FBS 비활성화 열, 100 유닛 / ㎖의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 글루타민, 및 0.1 % β 메르 캅토 에탄올로 RPMI 배지)을 포함하는 6 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 장기 배치 . 문화 오염의 가능성을 최소화하기 위해 마우스와 이후의 모든 조작의 해부에 대한 세포 배양 후드를 사용합니다.
      참고 : 감기 R10 매체를 유지하고 4 ℃에서 모든 다운 스트림 정화 단계를 수행합니다.
    3. 5에 70 μm의 세포 배양 여과기를 배치0 ml의 R10 매체의 약 5 mL를 포함하는 원뿔 튜브를. 최대 세 생쥐의 비장과 림프절에 대해 하나의 여과기를 사용합니다.
    4. 셀 스트레이너에 비장과 림프절을 추가하고 5 ML의 주사기 플런저의 끝 부분을 사용하여 담가서 부드럽게. R10 매체의 1-2 ㎖로 씻어.
    5. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 R10 14 ml의 최대 볼륨을 가지고. 4 ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않도록 한 깨끗한 이동로를 부어 상층 액을 버린다.
    6. 각 튜브에 감기 (4 ° C) 붉은 세포 용해 버퍼 (표 1) 2 ㎖를 추가합니다. 조심스럽게 얼음에 튜브를 유지, 3.5 분 동안 혼합한다.
      주 : 붉은 세포 용해의 타이밍이 림프구의 죽음을 방지하는 것이 중요하다. 따라서, 적혈구 용해 완충액의 각 배치의 정확한 타이밍을 최적화 할 필요가있다.
    7. R10 매체의 ≈12-13 ML을 추가합니다. 즉시 원심 분리 단계 2.1.5에서와 같이 상층 액을 버린다. 더 위트 배 세척 단계를 수행H R10 매체는 셀로부터 임의의 잔류 적혈구 용해 완충액을 제거하고 림프구의 사멸을 방지한다.
    8. 생존 세포의 수율을 결정 트리 판 블루로 1:20 희석 혈구 세포 카운트. 마우스 당 약 8 ~ 10 × 10 7 세포를 기대합니다.
  2. 자석 구슬에게 키트를 사용하여 CD4 + T 세포의 분리는 CD8 +, CD11b를 +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC 클래스 II +와 테르-119 + 세포를 제거하는 방법.
    1. 나누어지는 단계 8-10 × 10 7 세포 2.1.8 (15) 당 ML 원뿔 튜브와 4 ° C에서 5 분 600 XG에 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않도록 한 깨끗한 운동 상층 액을 붓는다. FBS는 다음 키트에서 항체 믹스 100 ㎕를 추가 열 불활 100 ㎕의 각 튜브에 세포를 재현 탁. 롤러에 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
    2. 상기 세포를 배양하는 동안 비드 준비.
      1. > 30 초 동안 볼 텍싱하여 유리 병에 재현 탁 비즈는 15 ML 원뿔 관에 8 ~ 10 × 10 (7) 제조 셀 당 구슬 1 ㎖를 전송합니다. 구슬 ml의 당 R10 매체의 2 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다.
      2. 다음 상층 액을 버린다 1 분 자석에 튜브를 놓습니다. R10 매체의 4 ㎖에 자석과에 resuspend 구슬에서 튜브를 제거합니다. 구슬이 금액은 부화 두 차례에 충분하다.
    3. 튜브 당 R10 배지 10 ㎖를 첨가하여 항체 인큐베이션 (단계 2.2.1)의 마지막에 세포를 세척 하였다. 부드럽게 4 ° C에서 5 분 동안 600 XG에 튜브와 원심 분리기 세포의 소용돌이와 잘 섞는다. 세포 펠렛을 방해하지 않도록 한 깨끗한 운동 상층 액을 붓는다. R10 배지 1 ㎖에 재현 탁 된 세포.
    4. 항체를 처리 한 세포의 각 튜브 (각 튜브를 준비 양 ½) 단계 2.2.2.2에서 세척 구슬 2 ㎖를 추가하고 소유주에 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 30 분 동안 배양크 로스.
    5. 부드럽게 좁은 선단 개구를 포함하는 피펫으로 5 회 피펫 팅하여 세포 - 비드를 재현 탁 혼합물. 발포하지 마십시오. 다음 새 튜브에 부정적인 선택 세포를 포함 뜨는을 전송 2 분의 구슬 자석에 튜브를 놓습니다. 그들은 CD4 + 인구만큼,이 세포를 보관하십시오.
    6. 부정적인 선택을 한 번 더 반복합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 600 XG에 단계 2.2.5에서 세포를 스핀. R10 배지 1 ㎖의 단계 2.2.3과에 resuspend과 상등액을 따르십시오. 팔로우 다시 2.2.4와 2.2.5 단계를 반복합니다. 최종 자기 비드 선택 후, (일반 수율 10 8 백혈구 당 15 ~ 20 × 10 6 세포 인) 복구를 결정하기 위해 세포를 계산합니다.
  3. 세포 분리 열을 사용하여 - 나이브 CD4 + T 세포 (CD62L 및 높은 CD25)의 분리
    1. 의 150-200 μL에서 원심 분리기 CD4 + T는 4 ° C에서 5 분 600 XG에 세포에 resuspend10 8 셀 당 R10 매체. 재고 비오틴 CD25 단클론 항체 (클론 7D4)의 2 μl를 추가합니다. 롤러에 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
    2. 세포 분리 컬럼 완충액 (표 1) 10 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 4 ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 최대한 상등액을 제거하고 남은 버퍼 / 세포의 양을 추정한다. 107 세포 당 90 ㎕의 최종 부피로 재현 탁.
    3. 10 7 세포 당 스트렙 타비 딘 구슬의 20 μl를 추가하고 부드러운 제스처와 함께 섞는다. 4 ℃에서 15 분 동안 품어.
    4. 세포 배양 동안 수동 접근 매체 세포 분리 (MS) 컬럼을 준비한다. 각 MS 열은 10 7 세포를 유지하고, CD25 + 세포는 일반적으로 총 CD4 + 세포의 약 10 %를 차지하기 때문에, 10 8 CD4 + T 세포 당 1 열을 사용합니다. 열에 세포 분리 컬럼 완충액 500 μL를 추가과를 통해 흐를 수 있습니다. 2 번 더 반복합니다.
    5. 셀 / 비드 인큐베이션 마지막에 세포 분리 컬럼 완충액 10 ㎖를 첨가하고, 4 ℃에서 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리하여 세포를 세척 하였다. 10 8 셀 당 세포 분리 컬럼 버퍼의 500 μl의 세포를 재현 탁하지만, 적은 수의 세포가있는 경우 여전히 500 μl를 사용합니다.
    6. 컬럼에 셀 / 비드 서스펜션의 500 μl를 적용하고를 통해 흐름을 수집합니다. 열 1 시간 이상이 합격을 다시 한번를 통해 흐름을 수집합니다. 각 수집 된 셀이 린스로부터 흐를 추가 열을 세포 분리 컬럼 완충액 500 μL로 3 회 헹군다. 다음은 CD25 있습니다 - 세포. 수율을 결정하기 위해 세포를 계산합니다.
    7. Tregs (CD25 + 세포)를 원하는 경우 다음과 같이 분리.
      1. 분리기에서 열을 제거하고 불임을 유지하기 위해 열려있는 보편적 인 튜브 돌보는 위를 유지. 신속 COL에 세포 분리 완충액 500 μL 피펫UMN 단단히 열와 함께 제공되는 플런저를 사용하여 긍정적 인 부분을 세척하십시오.
      2. 플러싱 절차를 2 회 이상 반복합니다. 신선한 MS 세포 분리 컬럼을 통해 긍정적 인 부분을 전달하고이 흐름을 통해 폐기하십시오. 단단히 R10 매체의 1 ㎖에 4 ° C.를 Resuspend 세포에서 5 분 동안 600 XG에 이전과 원심 분리기 세포로 양성 세포를 세 번, 물로 씻어 수율을 결정하기 위해 계산합니다.
    8. CD62L 높은 T 세포, 원심 분리기 CD25 - - 10 7 세포 당 R10 매체 150-200 μl를 4 °와에 resuspend에서 5 분 동안 600 XG에 단계 2.3.6에서 위에 고립 된 T 세포 CD25을 구하십시오. 재고 비오틴 CD62L 모노클로 날 항체의 5 μl를 (복제 MEL-14)를 추가하고 이전과 같이 롤러에 부드러운 혼합 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
    9. TREG 분리 프로토콜 (2.3.7)에 기재 한 바와 같이 세척을 수행, 스트렙 타비 딘 바인딩 구슬, 세포 분리 컬럼 준비. 이 시간 사용10 8 셀의 용량이 큰 세포 분리 (LS) 칼럼.
      1. CD62L 높은 T 세포는 일반적으로 CD25의 약 60-70% 표현하기 때문에 - 세포를, 10 8 셀 당 1 LS 세포 분리 컬럼을 사용합니다. 단계 2.3.6에서 설명 된 바와 같이 LS 세포 분리 컬럼 셀 / 비드 혼합물을 추가 - 칼럼 린스 통해서 이번에는 최종 흐름을 폐기. CD25 + 세포 수집 공정 2.3.7에 설명 된 CD62L 높은 T 세포를 수집한다.
      2. R10의 1 ml를 4 ℃에서 재현 탁 세포에서 5 분 600 XG에 원심 분리기 세포 수율을 결정하기 위해 계산합니다. R10 매체에 0.75-1 X10에 ml의 당 6 세포를 희석.
  4. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 세포의 순도를 분석 할 수 있습니다.
    1. FACS 염색 전략
      1. 세포 사전 및 분리의 모든 단계, CD4-FITC, CD8a-를 PerCP-Cy5.5와 얼룩 (도우미 및 세포 독성 T 세포)를 게시하고 MHCI에 대한I-PE (MHC 클래스 II 발현하는 세포).
      2. 세포 사전에 들어하는 CD25 분리, CD4-FITC와 CD25-PE (다른 헬퍼 T 세포 대 Tregs)와 얼룩을 게시 할 수 있습니다.
      3. CD4-FITC, CD62L-PE와 (메모리 및 이펙터 헬퍼 T 세포에 비해 순진) CD44-APC와 사전 세포 및 사후 CD62L 분리 얼룩하십시오.
    2. 각 분석 장소에 대한 96 웰 U 바닥 판의 잘 10 5 세포. 4 ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 매체를 붓고 200 μL의 DPBS 한 번 세포를 씻으십시오. 원심 분리기는 위 DPBS을 붓는다.
    3. 형광 라벨의 탈색을 방지하기 위해 어두운 곳에서 30 분간 실온에서 웰 당 50 μL DPBS 및 (2.4.1로 나타낸 바와 같이) 각각의 항체 0.5 μl를 첨가하고 배양한다.
    4. 세척 세포는 2.4.2에서와 같이 DPBS로 2 배 즉시 손에서 악기로 특정 프로토콜과 가이드 라인을 사용하여 사이토 흐름을 분석 할 수 있습니다.
      주 : 좋은 준비의 최종 분리 단계 후, 세포의 90-95%이됩니다CD62L 높은 T 세포 - CD4 + CD25 될.

3. 레트로 바이러스 활성화 CD4 + T 세포의 형질 도입 및 특정 T 도우미 하위 집합으로 자신의 차별화

  1. 레트로 바이러스 형질 도입
    참고 : 레트로 바이러스 통합 및 유전자의 발현은 세포 분열을 필요로한다. 따라서, T 세포는 O / N를 활성화해야합니다.
    1. 순진한 T 세포를 분리하는 동안, 코트 항 CD3과 DPBS에 희석 항 CD28 항체를 가진 24 잘 조직 배양 플레이트. 물론 당 250 μl를 추가합니다. 1μg / ㎖에서 안티 항 CD3을 사용합니다. 세포가 궁극적으로 TH0,받은 Th1, TH2 및 iTregs 조건에서 차별화 될 경우 2 μg의 / ㎖에서 안티 CD28 사용합니다. TH9과 Th17 조건 10 μg의 / ㎖에서 안티 CD28 사용합니다. 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 ~ 2 시간을 품어.
    2. 직전에 세포를 배양하기 위해, 항체 용액을 제거하고 unbou을 제거 웰당 DPBS ~ 250 μL의 접시를 씻어차 항체. 판 그렇게 한 번에 6 우물의 최대 처리를 건조하게하지 않도록주의하십시오. DPBS 세척 제거하고 ㎖의 당 0.75-1 × 10 6 세포에서 R10 매체에서 순진한 CD4 + T 세포를 1 ㎖를 추가합니다. 세포 O / N (14 ~ 16 시간)을 활성화합니다.
    3. 30 ° C에서 5 분 900 XG에 접시에 다음 날, 원심 분리기 세포는 우물의 바닥에 전지를 연결합니다.
    4. 수집하고 세포를 대체하지 않도록주의 매체를 저장하고 바이러스 생산 프로토콜로부터 제조 된 1 ml의 바이러스 배양 상층 액으로 대체합니다. 세포가 그렇게 한 번에 네 우물의 최대 처리를 건조하게하지 마십시오.
      1. 각각의 잘 바이러스의 흡수를 돕고 다음 원심 분리 동안 주위 CO 2에 상당한 알카리 화를 방지하기 위해 8 ㎎ / ㎖의 폴리 브렌의 1 μL와 1M HEPES 산도 7.5의 10 μl를 추가합니다. 30 ℃에서 90 분 동안 900 XG에 접시에 원심 분리기 세포
  2. 정시로 세포의 분화FIC 하위 집합
    1. 조심 바이러스 배양 상청을 제거하고 IL-2 및 다른 T 세포 성장 인자가 포함 같이, 단계 3.1.4에서 상기 수집 된 배지 1 ㎖로 교체한다. 특정 하위 집합으로 세포를 분화 3-4 일 동안 표 2와 문화를 세포에 표시된 시약을 추가합니다.
  3. 세포의 분석
    1. 세포 내 사이토 카인 염색법 / 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)의 각각을 1 μg의 용액으로 세포들을 처리하고 4 시간 동안 이오 노마 이신. 자극의 마지막 2 시간 동안 brefeldin A의 1 μg의 / ㎖를 추가
    2. 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 각 웰의 바닥에서 재현 탁 세포. 고정 및 염색에 대한 (목 세포의 문화의 1 ml의에서 일반적으로 100 μL) 96 웰 U 바닥 판에 약 10 5 세포를 전송합니다.
    3. GFP의 염색을 위해, GFP A를 표백하는 긴 인큐베이션 시간으로 정확히 5 분 동안 실온에서 2 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎕와 세포를 해결차 Foxp3의 염색을 방해. 5 분 동안 22 ° C에서 600 XG에 잘 원심 분리기 각 DPBS 100 μl를 추가하여 세포를 씻으십시오. 상층 액을 붓는다.
      주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 피부와 눈 보호 흄 후드를 처리합니다.
    4. 다시 Foxp3의 염색 키트 (희석제의 3 볼륨에 고정 버퍼의 1 볼륨) 만든 100 ㎕의 1 배 고정 버퍼를 사용하여 세포를 고정합니다. 실온에서 45 분 동안 세포를 품어 또는 대안으로 16 시간 동안 4 ° C에서 품어.
    5. 정착 후, 동일한 세트로부터 permeabilization 완충액 100 ㎕를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 다음 5 분 동안 22 ° C에서 600 XG에 원심 분리기 30 ~ 45 분 동안 실온에서 품어.
    6. 항체 염색의 경우, 고정 / permeabilization 버퍼를 제거하고 신선한 permeabilization 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 샘플 당 0.5 ㎕의 50 당 μL 버퍼에 permeabilization 버퍼에 희석 필요한 항체를 추가합니다. 독감의 표백을 피하기 위해 어둠 속에서 실온에서 30 ~ 45 분 동안 품어orescent 레이블입니다.
    7. 5 분 동안 22 ° C에서 600 XG에 150 μL의 permeabilization 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. permeabilization 버퍼를 취소하고 200 μL의 DPBS를 추가합니다. 손에서 악기로 특정 프로토콜과 가이드 라인을 사용하여 사이토 흐름을 분석 할 수 있습니다.
      참고 : 등, 비 활성화 또는 TH0 활성화 된 세포를 분석, 이소 제어 항체로 염색 같은 사이토 카인 염색에 대한 적절한 컨트롤을 포함해야합니다

결과

이 실험 시스템의 성공은 T 세포와 고역가 레트로 바이러스 제제의 고순도 집단을 필요로한다. 대표적인 결과가 성공적인 실험 예로서 여기에 도시되어있다.도 1은도 2. 순진한 헬퍼 T 세포 격리 프로토콜의 각 단계에서 전후 선택된 집단의 전형적인 순도를 보여주고도 3은 GFP 발현을 레트로 바이러스 생산의 분석을 도시 형질 감염된 HEK의 293T 세포 (그림 2)와 형질 도입 T 세포 (그림 3). HEK 293T 세포의 형질 전환 효율은 다른 레트로 바이러스 작 제물에 따라 크게 변할 수 있지만, 이것은 종종 GFP + T 세포의 수를 관찰 레트로 바이러스 생산의 수준과 상관 없다. 또한, GFP + T 세포의 숫자는 편광 상태에 따라 달라질 수있다. 또한, mGFP의 발현 수준 EAN 일체화 바이러스 매수에 따라 달라질 수있는 삽입 유전자의 전사에 통합 사이트 효과 및 바이러스 전 사체에 영향을주는 전사 후 조절 기전.

마지막으로, 그림 4의 miRNAs은 miR-15B는 / (16)가 과발현 때 우리는 헬퍼 T 세포 분화 관찰 한 전형적인 결과를 보여줍니다. 이러한 결과 때문에 진정한 효과 헬퍼 T 세포의 다양한 제제를 사용하여 여러 반복 실험의 통계적 분석에 의해 입증되어야 개별 실험에서 발생할 수있는 변화들을 보여준다. 이 실험에서, TH2 반응은 한 Th1 반응하는 경향이 있기 때문에 여기에 사용 된 C57BL / 6 라인 관찰하기가 어려울 수있다. 유사하게, IL-9 염색 배경 위에서 검출하기 어려울 수있다. 따라서, 아이소 타입 컨트롤을하고 올바른 조지아을 보장하기 위해 적절한 보상을 설정하는 데 필수적이다사이토 카인의 발현 팅. 우리의 결과에서 우리는은 miR-15B / 16 구성 요소 Rictor과 mTOR의 15의 발현을 억제을 통해 신호 전달 경로에서 mTOR를 억제함으로써 iTreg 유도을 향상 것으로 나타났습니다. 미르 15B / 16 때때로 개별 실험 TH0,받은 Th1 및 Th17 분화에 영향을 미칠 수 있지만, 다수의 반복 실험에서 시험 큰 영향은 없다. 반면은 miR-15B / 16 과발현이 크게 TH9 차별화를 (참조 18 참조) 억제 않습니다.

figure-results-1
그림 분리의 각 단계에서 헬퍼 T 세포의 1. 일반적인 순도. 표시된 항원의 결과 세포 계측법 대표 흐름은 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 플롯에서 지정한 살아있는 세포의 게이트에서 표시됩니다. (A) 사전 및 사후 CD4 음의 선택. CD4의 발현 프로파일,CD8a 및 MHCII이 표시됩니다. 이러한 헬퍼 T 세포의 보충 및 세포 독성 T 세포의 손실 및 MHC 클래스 II 발현 세포를 나타낸다. 좋은 정화는이 단계에서 90 % CD4 + T 세포 ~ 초래한다. (B) CD25를 선택합니다. 왼쪽에서 CD4, CD8a 및 MHCII의 발현 프로파일, 그리고 오른쪽에있는 CD4이며 CD25 발현 사전 및 사후 선택을 프로필. CD25 부정적인 선택한 셀이 점> 95 %에서 CD4 + CD25해야한다 -. (C) CD62L보세요. CD4, CD8a 및 MHCII 발현 프로파일은 왼쪽에 표시됩니다. 오른쪽에 CD62L과 CD44의 발현 양상은 포스트 선택된 셀의 CD4와 CD62L 식 프로필과 함께 사전 및 사후 CD62L 선택된 셀에 표시됩니다. CD62L 선택되면 거의 모든 메모리 셀 (CD44 +)를 10~15% 이펙터 세포 (CD62L 저)를 함유 나이브 헬퍼 T 세포의 고농축 인구 이탈 제거된다. 모든특정 매개 변수에 대한 FACS 프로필, 동등한 설정 및 저울에 걸쳐 유지 하였다. 숫자는 게이트 집단 내 세포의 비율을 나타낸다. 초기 선택 후 세포의 크기에 약간의 감소는 프로토콜 동안 기계적 스트레스에 아마도 때문이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
도 레트로 바이러스 형질 감염된 HEK 293T 세포에 2. 분석. GFP 발현은 형질 감염되지 않은 또는 형질 감염 및 바이러스 배양 상청액 수집 한 후 분석 하였다 하나의 HEK 293T 세포에 나타낸다. GFP 분석은 첫 번째 패널에서 금융위원회에 게이트와 SSC 플롯에서 살아있는 세포에서 수행되었다. 숫자는 게이트 영역 내의 GFP + 세포의 비율을 나타낸다. 일반적인 transfection 효율이 30~90% 사이의 범위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
도 레트로 바이러스 형질 헬퍼 T 세포 3. 분석. GFP 발현 TH0,받은 Th1, TH2, TH9, Th17에서 분화 후 레트로 바이러스 형질 도입 헬퍼 T 세포에 도시 한 3 일간 TREG 편광 상태이다. 분석은 FSC / SSC 패널에 표시된 라이브 및 활성화 세포에 문이되었다. 전달 효율은 구조 및 편광 상태에 따라 10~75%에 따라 다를 수 있습니다. 마찬가지로, GFP 발현의 평균 형광 강도는 다릅니다. 수있는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

: FO 아가씨 = "jove_content" figure-results-4
그림은 miR-(15b)의 4 효과 / 다른 편광 상태에서 헬퍼 T 세포 분화에 16 과발현. 대표적인 사이토 카인 프로필이 GFP + 그림 3에서 세포의 인구에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
표 1 :.이 프로토콜에 사용되는 버퍼 Excel 스프레드 시트로이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

돕는 사람T 세포 편광 상태
TH0 항 IL-4 5 μg의 / ㎖
안티 IFN-γ 5 μg의 / ㎖
TH1 재조합 IL-12 20 ng를 / ㎖
항 IL-4 5 μg의 / ㎖
TH2 재조합 IL-4 각 40ng / ㎖
안티 IFN-γ 5 μg의 / ㎖
TH9 재조합 TGF-β 2.5 ng를 / ㎖
재조합 IL-4 각 40ng / ㎖
안티 IFN-γ 10 μg의 / ㎖
Th17 재조합 TGF-β 2.5 ng를 / ㎖
재조합 IL-6 50 ng를 / ㎖
안티 IFN-γ 5 μg의 / ㎖
항 IL-4 5 μg의 / ㎖
항 IL-2 5 μg의 / ㎖
Tregs 재조합 TGF-β 2.5 ng를 / ㎖
재조합 IL-2 5 NG / ㎖

표 2 : 헬퍼 T 세포 서브 세트의 편광 상태.

토론

이들 발전과 기능은 종종 키 조정기의 발현에 의해 결정되는 바와 같이 레트로 바이러스 매개 된 유전자의 과발현은 헬퍼 T 세포의 기능을 분석하기위한 강력한 방법이다. 크게 내인성 유전자들 위에서 발현 여러 이슈를 도입 할 수 있기 때문에, 결과의 해석에주의가 필요하다. 따라서,이 기술은 함수의 관련성을 확인하기 위해 다른 조합한다. 예를 들어, 과발현이 가능한 경우 siRNA를 또는 유전자 녹아웃을 사용하여 단축 된 표현에 의해 보완되어야한다. 의 miRNAs, 우리는 miRNA의 15 경쟁력 억제제 행동 사이트를 대상으로 인공 miRNA의를 과발현 바이러스를 사용하여 차단하는 것과 과발현 실험을 보완. 레트로 바이러스 형질 도입 된 세포는 RNA 및 단백질 분석을 포함하는 생화학 적 분석에 이용 될 수있다. 그러나,이 실험의 주요 제한은 입술 전달 효율은형질 도입 및 untransduced 세포의 혼합 인구 ulting. 따라서 이러한 분석은 가능성이 가장 높은 GFP + 인구의 정렬이 필요합니다. 마지막으로, 체외 분화 분석은 생체 내 실험과 결합하고, 이것이 달성 될 수있는 한 가지 방법은 적응 적 마우스로 형질 도입 된 T 세포의 전사 및 분화 및 면역 반응에 미치는 영향에 따라이다한다.

이 시스템의 주요 한계들 중 하나는 레트로 바이러스 캡시드 내로 패키징 될 수있는 RNA 게놈의 크기이다. 우리의 경험에서, 좋은 바이러스 생산을 제공 MIG의 레트로 바이러스 시스템의 최대 삽입 크기는 3-3.5 KB입니다. 이들은 불량 바이러스 역가를 제공 따라서 큰 유전자는이 시스템을 해석 할 수 없다. 이 시스템의 유전자 연구의 다양한 유용하므로 그러나, 대부분의 유전자가이 크기보다 작다.

레트로 바이러스 전달이 protoco 내에서 여러 가지 대안으로LS가 사용되어왔다. 많은 연구자 안정적 레트로 바이러스 유전자 (예 16 참조) 발현 패키징 세포주를 이용했다. 그러나, 우리는 PCL 에코 헬퍼 바이러스 벡터의 공동 형질 표준의 HEK 293T 세포를 사용하여 최고 역가를 얻었다. 나이브 헬퍼 T 세포의 분리는 자성 비드와 세포 분리 컬럼 프로토콜 대신 정렬 셀을 통해 달성 될 수 있지만, 이는 셀 소터에 대한 액세스를 요구하고, 일종의 시간에 대한 비용은 일반적으로 비드 시약보다 더 높다. 마지막으로, 서로 다른 서브 세트에 헬퍼 T 세포를 구별하는 데 사용되는 작동 조건에 변동이있다. 예를 들어, 너무 오래 세포의 TCR 자극은 TREG 유도 조건에 노출하기 전에 유도 (16)을 억제 할 수 있습니다. 레트로 바이러스 발현 세포의 자극에 의해 유도되는 세포의 분열을 필요로하기 때문에 문제가 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 우리는 O / N의 액티브이 프로토콜을 사용하여 효율적인 TREG 유도를 발견레트로 바이러스 전달하기 전에 ATION.

이러한 프로토콜 내에서 성공적인 응용 프로그램은 몇 가지 요소가 필요합니다. 높은 역가 레트로 바이러스 제제는 중요하다 HEK의 293T 세포 때문에 높은 품질의 DNA와 정확하게 준비 배 HBS의 효율적인 형질 전환이 필요합니다. 형질 감염된 DNA를 잘 발현은 세포가 너무 희박한 또는 조밀 한 경우 세포가 활발히 성장하고,이 억제되도록 요구하기 때문에 또한 HEK 293T 세포의 세포 밀도는 형질의 시점에서 약 50 %가 될 필요가있다. 형질 전환시 최적의 농도에서 세포는 바이러스 수집 단계 동안 어떤 시점에서 합류에 도달해야하지만, 그들은 모든 방법 마지막 컬렉션을 통해 높은 역가의 바이러스 주식을 생산하는 것입니다. 헬퍼 T 세포의 효율적인 분화 세포 좋은 품질이되도록 분리 된 세포는도 1에 도시 된 순도되도록 요구한다. 마찬가지로, 셀의 품질은 쥐 FR에 의존그들은 고립 된 엄마. 이러한 연구를 위해, 우리 6-8 주령 C57BL / 6 마우스를 사용하고 있습니다. 이전 마우스는 덜 순진 세포를 가질 수 있고, 다른 균주는 차별화 다를 수 있습니다. T 세포는 TH2 반응을 유도하기 어려울 수 있으며, 상기 C57BL / 6 바와 같이 예를 들어, BALB / c 마우스 그래서 C57BL / 6 마우스 17보다 TH2 반응에 더 쉽다. 또한, 분화 조건들은 실험실 실험실에서 약간 다를 수 있고, 다양한 편광 상태의 사이토 카인 농도는 적정 될 필요가있을 수 있으므로 유전자 과발현의 효과는 서브 - 최적의 조건에서 명백해질 수있다. 마지막으로, 세포 증식의 과발현 유전자의 영향이나 편광 상태는 관심의 유전자의 측정 이렇게 효과 편광 시약의 타이밍 및 농도를 최적화 필요할 수 전달 효율에 영향을 미칠 수있다. 이러한 모든 요소를 ​​최적화하는 것은이 시스템에 유익한 결과를 가져올 것이다.

공개 사항

저자는 이 작품의 출판에 상충되는 이해관계가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 BBSRC(Biotechnology and Biological Sciences Research Council) 보조금(BB/H018573/1) 및 BD Biosciences 보조금의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
페니실린 스트렙토마이신 용액SigmaP4333
L-글루타민SigmaG7513
β-메르캅토에탄올SigmaM3148
DPBSSigmaD8537
MIG 벡터AddgenePlasmid 9094
pCL-Eco 벡터AddgenePlasmid 12371
세포 여과기BD Falcon352350
마그네틱 비드 마우스 CD4 셀 키트 Invitrogen (Dynabeads)11415D
Streptavidin 비드 Miltenyi Biotech130-048-102
MS 세포 분리 칼Miltenyi Biotech130-042-201
LS 세포 분리 칼Miltenyi Biotech130-042-401
CD25 Biotenylated MAb BD Biosciences85059클론 7D4
CD62L Biotenylated MAb BD Biosciences553149 클론 MEL-14
폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)Sigma107689
Anti-CD3eBiosciences16-0031-85클론 145-2C11 
Anti-CD28eBiosciences16-0281-85클론 37.51 
Anti-IL-4BD Biosciences559062클론 11B11
Anti-IFN-gammaBD Biosciences559065클론 XMG1.2
Anti-IL-2BD Biosciences554425cloneJES6-5H4
재조합 IL-12 p70eBiosciences14-8121
재조합 IL-4BD Biosciences550067
재조합 TGF-betaeBiosciences14-8342-62
재조합 IL-6eBiosciences14-8061
재조합 IL-2eBiosciences14-8021
PMA SigmaP8139
IonomycinSigmaI0634
Brefeldin AeBiosciences00-4506
ParaformaldehydeSigma16005Paraformaldehyde는 독성이 있으므로 취급 시 적절한 주의를 사용하십시오 
Foxp3 염색 완충액 세트eBiosciences00-5523
Anti-CD4  FITCeBiosciences11-0041클론 GK1.5 
Anti-CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-80클론 53-6.7 
Anti-MHCII PEeBiosciences12-0920  클론 HIS19
Anti-CD25 PEeBiosciences12-0251-82  클론 PC61.5 
Anti-CD62L PEeBiosciences12-0621-82클론 MEL-14 
Anti-CD44 APCeBiosciences17-0441클론 IM7 
안티-IFN-감마 FITC eBiosciences11-7311-81클론 XMG1.2
Anti-IL-4 PEBD Biosciences554435클론 11B11
Anti-IL-9 PE 또는 APCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104클론 RM9A4
Anti-IL-17a PEBD Biosciences559502클론 TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC 또는 PEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 클론 FJK-16s
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
Na2HPO4-2H2OSigma71643
덱스트로오스/포도당시그마G7021
HEPES, 유리 산SigmaH3375
NH4Cl시그마A9434
디소듐 EDTA시그마D2900000
KHCO3시그마237205
  CaCl2 시그마C5670
럼 럼

참고문헌

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