방법 논문

검출 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei 변형 표면 당 단백질 전환

DOI:

10.3791/54715

⸱

2016년 10월 19일

 ,  ,  , 
1Laboratory of Lymphocyte Biology, Rockefeller University, 2Department of Biology, Harvey Mudd College, 3Masters School

이 논문에서

요약

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in vitro에서 성장한 아프리카 트리파노좀은 낮은 비율로 항원 변이를 겪으며, 개체군은 우성 변이 표면 당단백질(VSG) 유형을 발현하는 기생충과 "전환된" 변이체의 작은 집단으로 구성됩니다. 이 프로토콜은 이러한 개체군을 검출하고 정량화하는 빠른 방법을 설명합니다.

초록

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Trypanosoma brucei, 인간과 동물의 아프리카 트리파노소마증(각각 수면병과 나가나로 알려짐)을 일으키는 원생동물 기생충으로, 체체 매개체와 포유류 숙주 사이를 순환합니다. 포유류 숙주 면역 체계는 표면을 덮고 있는 조밀하고 변이한 표면 당단백질(VSG)을 주기적으로 전환하여 포유류 숙주 면역 체계를 회피합니다. Trypanosoma brucei에서 항원 변이를 감지하는 것은 번거롭고 노동 집약적일 수 있습니다. 여기에서는 주어진 개체군에서 새로운 VSG를 발현하기 위해 '전환'된 기생충의 수를 정량화하는 방법을 제시합니다. 기생충은 먼저 시작 VSG에 대한 항체로 염색된 다음 자기 비드에 부착된 2차 항체로 염색됩니다. 시작 VSG를 발현하는 기생충은 자석에 부착된 기둥 위로 기생충을 이동시켜 나머지 개체군과 분리됩니다. 우점인 시작 VSG를 발현하는 기생충은 컬럼에 유지되는 반면, 플로우 스루(flow-through)에는 새로운 VSG를 발현하는 기생충과 시작 VSG를 발현하는 일부 오염 물질이 포함되어 있습니다. 이 플로우 스루 집단은 오염 물질을 라벨링하기 위해 시작 VSG에 대해 형광 표지된 항체와 죽은 세포를 라벨링하는 프로피듐 요오드화물(PI)로 다시 염색됩니다. 유세포 분석으로 볼 수 있는 알려진 수의 절대 계수 비드가 flow-through 모집단에 추가됩니다. 수집된 세포 수에 대한 비드의 비율은 전체 샘플의 세포 수를 외삽하는 데 사용할 수 있습니다. 유세포 분석은 시작 우성 VSG에 대해 양성으로 염색되지 않는 PI 음성 세포의 수를 계산하여 스위처의 모집단을 정량화하는 데 사용됩니다. 그런 다음 모집단에서 switcher의 비율은 유세포 분석 데이터를 사용하여 계산할 수 있습니다.

서론

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원생 동물 기생충, 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei는 사하라 사막 이남의 아프리카 전역 (트리파노소마 (Trypanosoma) brucei brucei를 통해)과 동물 (트리파노소마 (Trypanosoma) brucei의 gambiense 및 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei의 rhodesiense를 통해) 인간에 영향을 미치는 질병의 원인이되는 에이전트입니다. 이것은 체체 파리 벡터의 타액을 통해 포유 동물 숙주에 전달된다. 인간과 동물 아프리카 트리파노소마 증은 모두 발병 지역에서 심각한 경제적 부담을 야기하고, 몇 가지 약물을 사용할 수 또는 두 질병을 치료하기 위해 개발에 있습니다. 면역 회피의 메커니즘을 이해하는 것은 트리파노소마 증에 대한 약물의 개발을위한 중요합니다. 기생충을 포함 밀도, 변형 표면 당 단백질 (VSG) 코트의 항원 변화는 주요 수단 중 하나입니다에 의해 T. brucei는 포유류 항체 반응을 기피한다. ~ 15 EXPRES을 VSG 유전자 약 2,000 변형은 트리파노소마 게놈에 존재하지만, 단지 하나의 하나에서 임의의 주어진 시간에 전사되는시온 사이트. 발현 VSG의 '전환'는 활성 발현 사이트에 VSG 유전자를 복사하여, 또는 (1 검토) 이전에 침묵 식 사이트의 전사 활성화에 의해 하나 발생할 수 있습니다.

많은 작업은 T.에 대한 이해 항원 변화에 헌신하고있다지만 brucei, 스위칭 주파수에 영향을 미치는 요인은 여전히 저조한 이해된다. 현재까지 연구 전환 체외에서 확률 적으로 발생하지만, 스위칭 주파수는 약 106 개 세포를 2 일 정도의 매우 낮다는 사실에 의해 저해되었다. 이 전환은 처음에 검출하기 어렵다 이후 소정 계수가 증가하거나, 스위칭 주파수를 감소 여부를 측정하는 것이 곤란한다. 2009 년 이전에, 주어진 인구 스위처를 분리하는 방법은 긴했고, 노동 집약적. 이 포함 된 지배적 인 VSG 예방 접종을 마우스를 통해 트리 파노 솜을 계대 후 수확 세포하루 이상 3, 면역 4,5에 의해 세포의 수백 계산. 약물 내성이 스위처 (6)를 분리하는 또 다른 전략은 선택에 의존한다. 시험 관내에서 재배 아프리카 트리 파노 솜은 일반적으로 하나의 주요 변형 및 대체 변형을 표현 스위처 훨씬 작은 인구를 표현하는 많은 인구로 구성되어 있기 때문에, 우리는 지배, 시작 VSG 본 논문을 통해 주요 변형을 참조하십시오. 이 과정에서 우리는 결코이 주요 변형 인구의 다른 변종보다 큰 체력을 가지고 있다는 것을 의미하고 싶습니다.

4 시간 - 여기를 확실하게 3에 주어진 집단에서 비 우세 VSG를 나타내는 트리 파노 솜의 개수를 측정 할 수있는 방법을 설명한다. 이 방법은 하나의 주어진 유전자 조작 또는 약물 치료 집단을 전환 세포의 수를 증가 여부를 확인하고자 할 때 특히 유용하다. 대신에 할 일을 발현하는 세포의 인구를 면하게의minant는 약물을 통해 VSG를 시작하거나 면역에 의해,이 세포는 먼저 자기 열을 분리 한 다음 지배적 VSG에 대해 항체에 결합 자석 구슬로 코팅에 의해 제거된다. 스위치드 인구는 플로우를 통해 수집하고, 오염 물질을 식별하기위한 형광 표지 항 VSG 항체 다시 염색된다. 정량 세포 구슬의 비를 구한 인구 7 스위처 수를 정량화하는데 사용될 수 있도록 각각의 샘플 절대 계수 비드 정의 번호를 추가함으로써 달성된다.

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프로토콜

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주 : 절차를 통해,이 얼음에 세포를 유지하는 것이 필요하다. 콜드 매체는 또한 전체에 사용되어야한다.

1. 샘플 수확

  1. 100 만 / ㎖ - 0.5의 밀도에 리스터 427 변형 혈류의 trypanosomes에 성장. 이 기생충의 소수 문화를 시작하는 것이 가장 좋습니다. 1500 x g에서 10 분 동안 50 × 106 세포 / 샘플을 스핀. 이상과 같은 긍정적이고 부정적인 항체 컨트롤을 사용하기위한 문화 1 × 10 6 세포를 남겨해야합니다.
    참고 :이 프로토콜은 동물의 피 (자세한 내용은 설명을 참조)에서 분리 trypanosomes에 사용할 수 있습니다.
  2. 피펫 또는 상층 액의 대부분을 부어 (약 750 μl를 떠나). 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송합니다.
  3. 미세 원심에서 5,200 XG에서 4 분 동안 4 ° C에서 세포를 스핀과 상층 액을 제거합니다.

2. 자기 라벨링

  1. 를 Resuspend 세포 150 ㎕를 배지에서 (HMI-9 위스콘신적절한 희석 예를 들어 제 혈청) + 기본 안티 VSG 항체.
    참고 : 안티 - VSG 항체 집에서 만든 1시 50분의 희석에 사용된다. 이는 형광으로 표지되지 않은 기본 항 VSG 항체를 사용하는 것이 중요하다.
  2. 10 분 동안 4 ° C에서 추운 방에서 8 - 속도 6에서 소용돌이 어댑터-60을 사용하여 소용돌이 세포. 1000 μl의 차가운 HMI-9 혈청 - 800 씻으십시오.
  3. 5,200 XG에 4 분 4 ° C에서 원심과 뜨는을 대기음. 혈청 1ml를 HMI-9로 세척하고, 상기 회전. 뜨는을 대기음. 혈청와 HMI-9 100 ㎕의를 Resuspend 펠릿.
  4. (MSC) 마이크로 비드를 정렬 자기 활성화 셀의 110 μl를 추가합니다. 기본 안티 VSG 항체에 적절한 항 - 마우스, 항 - 토끼, 또는 안티 - 비오틴 구슬을 사용합니다. 잘 섞다. 10 분 동안 4 ° C에서 추운 방에 소용돌이 세포.
  5. 세포가 텍싱하는 동안, 분리 자석에 하나의 자기 활성화 분리 컬럼 / 샘플을 설정합니다. 재를해야합니다컬럼 아래 ceptacle (우리는 15 mL의 원심 분리 튜브를 사용하여)를 통해 유동을 수집한다. 추운 방에서 장치를 설정합니다.
  6. 주요 항목에 대한 혈청 HMI-9의 2 ML을 추가합니다. 흐름을 통해 각각의 샘플에서 수집 열에서 15 ML의 원심 분리기 튜브 장소를 프라이밍 후.
  7. 단계 2.4에서 10 분 부화 후, 800-1,000 μl의 차가운 HMI-9 혈청을 추가합니다. 5,200 XG에 4 분 4 ° C에서 원심과 뜨는을 제거 언 바운드 항체를 제거합니다. 혈청 및 반복 상층 액 100 μl를 떠나와 HMI-9의 1 ㎖로 세척 할 것.
  8. 적극적으로 시각적으로 원심 분리기 튜브를 가볍게 펠렛 완전히 재현 탁되어 있는지 확인하기 위해 튜브를 검사합니다. 세포가 잘 재현 탁되어 있는지 확인 위아래로 혈청 피펫 HMI-9의 1 ML을 추가합니다.

3. 자기 분리

  1. 상술 한 바와 같이 열 준비가 끝났다되어 있는지 확인합니다. 열에 셀을 적용합니다. 세포를 비 - 지배적 인 VS를 표현하는 관류 모아서컬럼을 통과하기 위해 7 분 - G. 1 매체 ml의 + 트리 파노 솜은 일반적으로 6 걸립니다.
  2. 워시 1 ml의 HMI-9 혈청과 함께 배와 단계 3.1에서와 같이 흐름을 통해 동일한 튜브를 수집합니다.
  3. 나누기 관류 ​​(3 mL) 중 두 가지를 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에.
    주의 : 이러한 나중에 결합 될 수 있거나 절반 등의 RNA를 분리하는데 사용될 수있다
  4. 자석에서 열을 제거합니다. 열에 혈청 HMI-9 3 ㎖를 추가하고 시작, 지배 VSG를 발현하는 세포를 얻기 위해 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 열을 뛰어. 나중에 분석을 위해 용출 물질의 300 μl를 제거합니다. 얼음이 세포 보관하십시오.
  5. 양성 및 음성 대조군으로 사용하기 위해, 37 ℃에서 성장 대조군 세포의 시작 배양에서 약 1 백만 셀을 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로하고 피펫 (그 자주 전환 할 것으로 예상되지 않음).
    참고 : 양성 대조군 세포 단계 4.1에서 형광 표지 항체로 염색됩니다. 대조군 세포 REMA프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 흠이다.
  6. 스핀 흐름을 통해 샘플 및 5,200 XG에 4 분 4 ° C에서 긍정적 인 항체 제어 샘플 및 상층 액을 제거합니다.
    주 : 용출 다른 셀 300 μL 분취 안티 VSG 염색에 대한 양성 대조군으로 사용할 수있다.

4. 염색은 오염 물질 및 스위처를 확인하는

  1. 재현 탁 플로우 스루 샘플 100 ㎕ HMI -9- 적절한 희석 혈청 + 일차, 형광 표지 된, 항 VSG 항체 양성 대조군 세포.
    참고 : 표지 항 VSG 항체 집에서 만든 1의 희석에 사용됩니다 : 1000. 형광 표지는, 안티 VSG는 step.There 단계 3.5 다음과 같은 두 가지의 microcentrifuge 튜브의 흐름을 통해 샘플의 3 ㎖ 있어야 MACS 분리에 레이블이없는 항체와 같은 소스에서 할 수있다.
  2. 다시 SUS 동안 두 마이크로 원심 튜브의 펠렛을 결합, 유동 세포 계측법에 의해 관통 흐름 모두를 분석100 ㎕ HMI-9 세럼 + 안티 VSG 항체의 샘플을 보류. 잘 섞다.
  3. 10 분 동안 4 ° C에서 추운 방에 소용돌이 세포. 1000 μl의 차가운 HMI-9 혈청 - 800을 추가합니다. 4 분 4 ° C에서 회전 샘플 상층 액 5,200 XG에 제거는 언 바운드 항체를 제거합니다.
  4. 혈청와 HMI-9의 1 ml의 세포를 씻으십시오. 4 분 4 ° C에서 회전 샘플 상층 액 5,200 XG에 제거합니다. 이 마지막 스핀 동안 단계 3.4과 음성 대조군 시료에서 용출-샘플을 스핀 다운.
  5. 148.5 μL HMI-9 혈청 25 ㎕를 절대 계산 구슬과 1.5 μL 프로피 디움 요오드 용액 (175 μl의 총을) 염색 : 모든 흐름 통해 용출 샘플을 재현 탁. 175 μL에 긍정적이고 부정적인 항체 제어 샘플을 재현 탁 HMI-9 혈청. 절대 계산 비즈 / 사용되는 특정 많은 25 μL의 수를 기록해야합니다.
  6. 사이토의 흐름을 통해 모든 샘플을 실행하고 데이터를 수집합니다. PI로 얼룩 죽은 세포 +. 오염 물질은 PI로 얼룩 - VSG +를. VSG - - 스위처는 PI로 얼룩 8.
  7. 데이터 유동 세포 계측법을 사용하여 스위칭 주파수를 계산합니다.
    주 : 스위칭 주파수를 계산하는 방법에 대한 자세한 내용은 보충 파일을 참조하십시오 유동 세포 계측법 Calculations.docx 표 1.

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결과

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여기에 기재된 방법은 인구 8 스위처의 수를 증가 VSG 발현 사이트 내에서 해당 이중 가닥 나누기를 입증 하였다. 여기서는 마찬가지로 발현 부위에 이중 가닥 브레이크를 생성하도록 유도 된 트리 파노 솜의 인구에서 대표적인 결과를 나타낸다. 우리는 이중 가닥 휴식을 생성하는 유도되지 않은 것과 이러한 trypanosomes에 비교. 1은 흐름을 통해 자기 활성화 셀 정렬 열에서 수집-유엔 유도 유도 된 세포에서 플롯 세포 계측법 대표 흐름을 보여줍니다. 이 특정 실험 지배적 시작 VSG는 VSG2했다. 도 1a의 좌측 패널은 앞으로 보여 게이트 살아있는 세포의 특징 인 전방 및 측면 산란 서명을 보여 절대 계산 구슬과 세포 주위에 그려 질 수 있도록 측면 산란. 참고 게이트 수죽은 세포를 PI 염색법으로 제거 할 수 있기 때문에 더 많은 세포를 포함하는 그릴;...

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토론

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실험 방법에 대하여, 프로토콜의 가장 중요한 요소는 차가운 모든 샘플을 유지하고있다. 트리 파노 솜은 매우 빠르게 그 표면 (9)에 결합 된 항체를 내재화하지만,이 프로세스는 운동성 의존하고, 셀 4 ° C에서 유지되는 한 상기 분석에 영향을 미치지 않는다. 모든 샘플은 항상 얼음에 보관해야하고, 피펫은 25 ° C 랩 환경에의 노출을 최소화하기 위해 신속하게 수행해야합니다. 콜드 HMI -9- 혈청은 실험의 시작에서 사용할 수 있어야하고 얼음에 걸쳐 유지되어야한다. 컬럼을 통해 1 ml의 샘플을 실행하는 데 7 분 - 그것은 5 걸립니다 열 이상을 실행하여 trypanosomes에의 분리, 추운 방에서 수행해야합니다. 가능한 자기 분리 장치보다 샘플이있는 경우 적극적으로 분리되지 않는 샘플을 얼음에 보관 될 때, 자기 격리만큼 순차적으로 수행 될 수있다.

이 샘플이 잘 혼합 된 AF 것이 또한 중요하다자석의 마이크로 비드 전에 분리에 함께 배양 한 다음 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 트리파노소마 생물학에 대한 일반적인 조언 조지 크로스를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 또한 DS, MRM에 NSF 대학원 연구 활동 (DGE-1325261)와 FNP에 대한 NIH / NIAID (허가 번호의 AI085973)에 빌과 멜린다 게이츠 재단 GCE 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 I-SCEI 유전자 및 인식 사이트를 포함하는 균주의 사용 갈라드리엘 오두막집 - 광부 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
unlabeled anti-VSG antibodyn/a/aVSG 항체는 사내에서 제조되며
형광단 표지된 anti-VSG 항체n/a해당 없음 VSG 항체는 사내에서 제조
HMI-9 매체n/a없음HMI-9는 자체 제조
Propidium IodideBD Pharmingen556463
CountBright 절대 계수 비드Thermofisher ScientificC36950
LD 컬럼Miltenyi Biotech130-042-901
MACS 자석Miltenyi Biotech130-042-303
MACS 자기 분리기Miltenyi Biotech130-042-302
와류 어댑터-60ThermoFisher scientificAM10014
유세포 분석기Coultern/a
유세포 분석기 분석 소프트웨어FloJon/a
n, 해당

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
  2. Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
  3. Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).
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