이 논문은 두 개의 새로운 오픈 소스 ImageJ 플러그인인 Cell Concentration Calculator 및 Migration Assay Counter를 통해 혈구계 및 이동/침입 현미경 사진의 정량화에 대해 설명합니다. 또한 이미지 획득 및 보정 프로토콜에 대해 설명하고 플러그인의 입력 요구 사항에 대해 자세히 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
건강의 ImageJ에 국립 연구소는 강력하고 자유롭게 사용할 이미지 처리 소프트웨어 제품군입니다. ImageJ에 다양한 생물학적 입자를 계산하기 위해 효과적으로 사용할 수있는 포괄적 인 입자 분석 알고리즘을 보유하고 있습니다. 세포 샘플들의 다수를 카운트하면 혈구 시간 관련하여 병목 현상을 나타낸다. 마찬가지로, 상기 ImageJ에 플러그인 셀 카운터와 마이그레이션 / 침공 분석에서 막을 계산 정확하지만, 손목 통증을 일으키는 매우 노동 집약적 주관적인, 그리고 악명입니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 자동 혈구 (또는 알려진 볼륨) 및 마이그레이션 / 침략 세포 계수의 유일한 작업 ImageJ에 내 두 개의 플러그인을 개발했다. 두 플러그인 최소 배경 고품질 현미경 사진을 획득 할 수있는 능력에 의존한다. 그들은 사용하기 쉽고 카운트 교정에 도움 내장 된 분석 도구와 큰 샘플 크기의 빠른 계산과 분석에 최적화되어 있습니다. 핵심 원리를 결합하여자동화 된 계산 알고리즘 및 사후 분석 계산 셀 카운터 (S)이 크게 이동 분석 정확도의 손실없이 처리 될 수있는 용이성을 증가시킨다.
서론
시험 관내 세포 카운트에서 조직 배양 실험의 넓은 범위의 중요한 기본 기술이다. 정확하게 배양 세포의 수를 결정하는 실험 재현성 표준화 1,2- 필수적이다. 세포는 혈구 계산을 사용뿐만 아니라 자동화 된 방법의 다양한 고유의 장점과 단점 3,4,5- 각을 사용하여 수동으로 수행 될 수있다. 세포 계수에 대한 자동화 된 방법의 대부분은 두 개의 클래스, 콜터 원리를 사용하거나 유동 세포 계측법이 그 중 하나에 속한다. 콜터 카운터는 세포 수와 크기를 결정하기 위해 셀의 전기 저항을 이용한다. 이들은 유동 세포 계측기보다 빠르고 정확하고 저렴하다. 그러나, 이들은 거의 수동 계산 3 비교 인해 상당한 비용 만 세포 카운팅에 사용되지 않는다. 한편, 세포 계측기 흐름 비싸다 있지만 휴대 계산, 셀 형상, 명세서의 분석과 같은 많은 응용 분야를 가지고ructure 측정 내부 셀은 4,5 마커. 이 두 원칙 중 하나를 사용 기계는 많은 제조 업체에서 사용할 수 있습니다. 자동화 된 방법은 수동 계산에 필요한 시간의 일부와 함께하지만 비싼 기계 (6)을 사용하는 동안 수동 계산은 저렴하지만 시간과 바이어스의 적용을받습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 복합 현미경과 카메라 설정 (세포 농도 계산기)
- 빛 조절 노브 전체에 전구의 밝기를 높이 4 배 대물 렌즈로 전환하고, 위상차 필터가 선택되어 있는지 확인.
참고 : 어두운 배경과 조직 문화에 대한 모든 역 위상차 현미경, 예를 들어, PHP는 위상차, 표준 현미경 카메라 절차에 따라 사용할 수 있습니다. - 현미경의 소프트웨어 내에서 기본값으로 이미지 캡쳐 설정을 설정합니다.
참고 : 이러한 설정의 위치를 찾기 위해 현미경의 사용 설명서를 참조하십시오.- '밝기', '대비', 그리고 100 % '포화'와 '감마'및 1.0 '이득'을 설정합니다.
참고 : 소프트웨어에 따라, '밝기'와 '대비'는 0 %의 값 대신 100 %로 기본 수 있습니다. - 설정 이미지는 검은 색과 흰색이 가장 높은 해상도 availabl를 사용하여 캡처 할전자 (1,600 X 1,200 픽셀 (픽셀) 이상).
참고 : 흑백 설정을 사용할 수없는 경우 0 %의 '포화'충분하다.
- '밝기', '대비', 그리고 100 % '포화'와 '감마'및 1.0 '이득'을 설정합니다.
- 현미경 스테이지로 표준 혈구를 배치하고 (....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
세포 농도 계산기
그림 1은 CCC의 교정 및 가산 이미지 수집의 전체 프로세스를 제공합니다. 도 1a와 1b는 픽셀 P-평방 길이의 P-광장 교정 이미지와 계산을 묘사한다. CCC는 식을 이용하여 소정의 부피로 세포 농도를 결정
혈구의 P-광장은 100 거리 nL의 볼륨 (1 mm × 1 mm X 0.1 mm) 및, 전체 이미지 볼륨이 mm로 픽셀을 변환 한 후이 상수 계산 될 수있다 주어진 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
중요한 단계, 문제 해결 및 제한 사항
자동화 된 계산 방법의 특성상 입자 분석의 상세들은, 이들 입자를 정의하는 수학적인 기능을 필요로한다. 따라서, 세포 농도 계산기 마이그레이션 분석 계수기 모두의 정확도는 상기 캡쳐 된 이미지는 세포 샘플 또는 마이그레이션 분석 막과 유사한 방법에 가깝게, 즉 이미지 충실도 majorly에 의존한다. 따라서 가능한 한 가장으로 현미경 및 관련 소프트웨어 보정 프로토콜을 수행 할 수있는 최상의 중요하다. 이는 배경 잡음을 제한 불필요한 입자를 감소 밝고 균일 합초 이미지 캡처 및 TIFF와 같은 비 손실 파일 형식으로 저장 포함한다. 따라서, 두 플러그인은 이러한 요건이 충족되지 않은 경우에 잘못된 결과를 생성 할 가능성이있다. 퍼펙트 세포 수에 따라서 항상 좋은 연습 때 두 í에 그들은 시각적 인 기대와 일치하는지 확인하는 것입니다티. 만약 참 결과가 문제 (10.4 주)를 명료하게 도움이 될 바이너리 이미지와 원본 이미지를 비교하여 일치하지.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 캐나다 보건 연구소(Canadian Institute of Health Research)의 지원을 받아 CP(OR 142730 및 OR 89931)로 승인되었습니다. ImageJ에서 이진 입자 분석에 대한 초기 아이디어를 제시한 Jelena Brkic에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HyClone 클래식 액체 매체: RPMI 1640 - L-글루타민 | 피셔 사이언티픽 | SH3002702 | 세포 배양 배지 포함 |
| 태아 보비안 혈청(FBS) | GIBCO BRL | P00015 | 배지 공급 |
| HTR8/SVneo 영양막 세포주 세포는 | Charles Graham 박사(Queen' s University, Kingston, Canada)소프트웨어는 | 모든 세포주와 함께 작동하도록 설계되었습니다. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | 10 µ에서 0.20%(w/v)로 제조; M EDTA 1x PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm 세포 배양 플레이트 | SARSTEDT | 833902 | 어떤 조직 배양 처리된 플레이트도 적합할 것입니다 |
| Transwell 폴리에스터 막 삽입물 - 8.0 &마이크로; m 기공 크기 | Costar 3422는 Fisher Scientific 7200150에서 주문했습니다 | 24웰 플레이트용; 기공 크기: 8.0 &마이크로; m; 직경 6.5mm; 0.33 cm2 성장 영역 | |
| HARLECO 혈액학 염색 및 시약, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore 및 VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor 염색 세트는 3개의 500ml(16.9oz.) 폴리 병으로 구성되며 메탄올 고정제(용액 1), 에오신 또는 산 염색(용액 2) 및 메틸렌 블루 또는 염기성 염색(용액 3) |
| 면 팁 애플리케이터 | Puritan Medical | 806-WC | |
| 단일 가장자리 산업용 면도날 | VWR | 55411 - 055 | 두께: 0.30mm(0.012") |
| 현미경 슬라이드 - 사전 청소/일반 | Fisher Scientific | 12550A3 | 치수: 25mm x 75mm x 1.0mm |
| Fisherbrand 커버 안경 - 직사각형 번호 1 | Fisher Scientific | 12-545E | 두께: 0.13 - 0.17mm; 크기: 50mm x 22mm |
| Fisher Chemical Permount 마운팅 매체 | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica 스테레오 해부 현미경 | Leica Microsystems | 마이크로소프에는 Leica 현미경 카메라 모델 MC170 HD 및 카메라 소프트웨어가 장착되어 있습니다. Leica App. Suite (LAS E2) 버전 3.1.1 [Build: 490]. 현미경 부품: LED3000 스포트라이트 조명 모델: MEB126, Leica M80 광학 캐리어 모델 M80, 목표 아크로맷 1.0X, WD=90 mm 모델: MOB306 & 대물렌즈 아크로마트 0.32X, WD=303 mm 모델: MOB315, 비디오 목표 0.5X 모델: MTU-293 | |
| 혈구계 | 보조 독일 | 0.100mm 깊이 - 0.0025mm2 | |
| Olympus 도립 광 현미경 | Olympus Corporation | CKX41SF | 마이크로소프에는 Lumenera Infinity 1-2 2.0 메가픽셀 CMOS 컬러 카메라가 장착되어 있으며 카메라 소프트웨어는 Infinity 분석 버전 6.5.2 |
| 층류 캐비닛 1300 시리즈 A2 | Thermo Scientific입니다. | 모델: 1375 | 세포 배양 작업을 위한 모든 층류 캐비닛이 적합할 것입니다 |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo Scientific | 모델: 370 | 모든 세포 배양 인큐베이터가 적합합니다 - 세포는 습도 환경, 5% CO2, 37 °에서 배양되었습니다. 씨 |
| ImageJ | NIH | 버전 1.50e | 최소 버전 필요 |
| Java Runtime Environment | Oracle | 버전 1.8.0_66 | 최소 버전 필요 |
참고문헌
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
- Graham, M. D.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
