ImageJ에 플러그인을 사용하여 셀 카운팅 절차의 자동화 된 정량 및 분석

Summary

이 논문은 두 개의 새로운 오픈 소스 ImageJ 플러그인인 Cell Concentration Calculator 및 Migration Assay Counter를 통해 혈구계 및 이동/침입 현미경 사진의 정량화에 대해 설명합니다. 또한 이미지 획득 및 보정 프로토콜에 대해 설명하고 플러그인의 입력 요구 사항에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

건강의 ImageJ에 국립 연구소는 강력하고 자유롭게 사용할 이미지 처리 소프트웨어 제품군입니다. ImageJ에 다양한 생물학적 입자를 계산하기 위해 효과적으로 사용할 수있는 포괄적 인 입자 분석 알고리즘을 보유하고 있습니다. 세포 샘플들의 다수를 카운트하면 혈구 시간 관련하여 병목 현상을 나타낸다. 마찬가지로, 상기 ImageJ에 플러그인 셀 카운터와 마이그레이션 / 침공 분석에서 막을 계산 정확하지만, 손목 통증을 일으키는 매우 노동 집약적 주관적인, 그리고 악명입니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 자동 혈구 (또는 알려진 볼륨) 및 마이그레이션 / 침략 세포 계수의 유일한 작업 ImageJ에 내 두 개의 플러그인을 개발했다. 두 플러그인 최소 배경 고품질 현미경 사진을 획득 할 수있는 능력에 의존한다. 그들은 사용하기 쉽고 카운트 교정에 도움 내장 된 분석 도구와 큰 샘플 크기의 빠른 계산과 분석에 최적화되어 있습니다. 핵심 원리를 결합하여자동화 된 계산 알고리즘 및 사후 분석 계산 셀 카운터 (S)이 크게 이동 분석 정확도의 손실없이 처리 될 수있는 용이성을 증가시킨다.

Introduction

시험 관내 세포 카운트에서 조직 배양 실험의 넓은 범위의 중요한 기본 기술이다. 정확하게 배양 세포의 수를 결정하는 실험 재현성 표준화 ^1,2- 필수적이다. 세포는 혈구 계산을 사용뿐만 아니라 자동화 된 방법의 다양한 고유의 장점과 단점 ^3,4,5- 각을 사용하여 수동으로 수행 될 수있다. 세포 계수에 대한 자동화 된 방법의 대부분은 두 개의 클래스, 콜터 원리를 사용하거나 유동 세포 계측법이 그 중 하나에 속한다. 콜터 카운터는 세포 수와 크기를 결정하기 위해 셀의 전기 저항을 이용한다. 이들은 유동 세포 계측기보다 빠르고 정확하고 저렴하다. 그러나, 이들은 거의 수동 계산 ³ 비교 인해 상당한 비용 만 세포 카운팅에 사용되지 않는다. 한편, 세포 계측기 흐름 비싸다 있지만 휴대 계산, 셀 형상, 명세서의 분석과 같은 많은 응용 분야를 가지고ructure 측정 내부 셀은 ^{4,5 마커.} 이 두 원칙 중 하나를 사용 기계는 많은 제조 업체에서 사용할 수 있습니다. 자동화 된 방법은 수동 계산에 필요한 시간의 일부와 함께하지만 비싼 기계 ^{(6)을 사용하는} 동안 수동 계산은 저렴하지만 시간과 바이어스의 적용을받습니다.

Protocol

1. 복합 현미경과 카메라 설정 (세포 농도 계산기)

1. 빛 조절 노브 전체에 전구의 밝기를 높이 4 배 대물 렌즈로 전환하고, 위상차 필터가 선택되어 있는지 확인.
   참고 : 어두운 배경과 조직 문화에 대한 모든 역 위상차 현미경, 예를 들어, PHP는 위상차, 표준 현미경 카메라 절차에 따라 사용할 수 있습니다.
2. 현미경의 소프트웨어 내에서 기본값으로 이미지 캡쳐 설정을 설정합니다.
   참고 : 이러한 설정의 위치를 ​​찾기 위해 현미경의 사용 설명서를 참조하십시오.
   1. '밝기', '대비', 그리고 100 % '포화'와 '감마'및 1.0 '이득'을 설정합니다.
      참고 : 소프트웨어에 따라, '밝기'와 '대비'는 0 %의 값 대신 100 %로 기본 수 있습니다.
   2. 설정 이미지는 검은 색과 흰색이 가장 높은 해상도 availabl를 사용하여 캡처 할전자 (1,600 X 1,200 픽셀 (픽셀) 이상).
      참고 : 흑백 설정을 사용할 수없는 경우 0 %의 '포화'충분하다.
3. 현미경 스테이지로 표준 혈구를 배치하고 (....

Results

세포 농도 계산기

그림 1은 CCC의 교정 및 가산 이미지 수집의 전체 프로세스를 제공합니다. 도 1a와 1b는 픽셀 P-평방 길이의 P-광장 교정 이미지와 계산을 묘사한다. CCC는 식을 이용하여 소정의 부피로 세포 농도를 결정

혈구의 P-광장은 100 거리 nL의 볼륨 (1 mm × 1 mm X 0.1 mm) 및, 전체 이미지 볼륨이 mm로 픽셀을 변환 한 후이 상수 계산 될 수있다 주어진 있습니다.

Discussion

중요한 단계, 문제 해결 및 제한 사항

자동화 된 계산 방법의 특성상 입자 분석의 상세들은, 이들 입자를 정의하는 수학적인 기능을 필요로한다. 따라서, 세포 농도 계산기 마이그레이션 분석 계수기 모두의 정확도는 상기 캡쳐 된 이미지는 세포 샘플 또는 마이그레이션 분석 막과 유사한 방법에 가깝게, 즉 이미지 충실도 majorly에 의존한다. 따라서 가능한 한 가장으로 현미경 및 관련 소프트웨어 보정 프로토콜을 수행 할 수있는 최상의 중요하다. 이는 배경 잡음을 제한 불필요한 입자를 감소 밝고 균일 합초 이미지 캡처 및 TIFF와 같은 비 손실 파일 형식으로 저장 포함한다. 따라서, 두 플러그인은 이러한 요건이 충족되지 않은 경우에 잘못된 결과를 생성 할 가능성이있다. 퍼펙트 세포 수에 따라서 항상 좋은 연습 때 두 í에 그들은 시각적 인 기대와 일치하는지 확인하는 것입니다티. 만약 참 결과가 문제 (10.4 주)를 명료하게 도움이 될 바이너리 이미지와 원본 이미지를 비교하여 일치하지.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone 클래식 액체 매체: RPMI 1640 - L-글루타민	피셔 사이언티픽	SH3002702	세포 배양 배지 포함
태아 보비안 혈청(FBS)	GIBCO BRL	P00015	배지 공급
HTR8/SVneo 영양막 세포주 세포는	Charles Graham 박사(Queen' s University, Kingston, Canada)소프트웨어는		모든 세포주와 함께 작동하도록 설계되었습니다.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	10 µ에서 0.20%(w/v)로 제조; M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm 세포 배양 플레이트	SARSTEDT	833902	어떤 조직 배양 처리된 플레이트도 적합할 것입니다
Transwell 폴리에스터 막 삽입물 - 8.0  &마이크로; m 기공 크기	Costar 3422는 Fisher Scientific 7200150에서 주문했습니다		24웰 플레이트용; 기공 크기: 8.0 &마이크로; m; 직경 6.5mm; 0.33 cm2 성장 영역
HARLECO 혈액학 염색 및 시약, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore 및 VWR	65044A, B, & C	Hemacolor 염색 세트는 3개의 500ml(16.9oz.) 폴리 병으로 구성되며 메탄올 고정제(용액 1), 에오신 또는 산 염색(용액 2) 및 메틸렌 블루 또는 염기성 염색(용액 3)
면 팁 애플리케이터	Puritan Medical	806-WC
단일 가장자리 산업용 면도날	VWR	55411 - 055	두께: 0.30mm(0.012")
현미경 슬라이드 - 사전 청소/일반	Fisher Scientific	12550A3	치수: 25mm x 75mm x 1.0mm
Fisherbrand 커버 안경 - 직사각형 번호 1	Fisher Scientific	12-545E	두께: 0.13 - 0.17mm; 크기: 50mm x 22mm
Fisher Chemical Permount 마운팅 매체	Fisher Scientific	SP15-500
Leica 스테레오 해부 현미경	Leica Microsystems		마이크로소프에는 Leica 현미경 카메라 모델 MC170 HD 및 카메라 소프트웨어가 장착되어 있습니다. Leica App. Suite (LAS E2) 버전 3.1.1 [Build: 490]. 현미경 부품:  LED3000 스포트라이트 조명 모델: MEB126, Leica M80 광학 캐리어 모델 M80, 목표 아크로맷 1.0X, WD=90  mm 모델: MOB306 & 대물렌즈 아크로마트 0.32X, WD=303  mm 모델: MOB315, 비디오 목표 0.5X 모델: MTU-293
혈구계	보조 독일		0.100mm 깊이 - 0.0025mm2
Olympus 도립 광 현미경	Olympus Corporation	CKX41SF	마이크로소프에는 Lumenera Infinity 1-2 2.0 메가픽셀 CMOS 컬러 카메라가 장착되어 있으며 카메라 소프트웨어는 Infinity 분석 버전 6.5.2
층류 캐비닛 1300 시리즈 A2	Thermo Scientific입니다.	모델: 1375	세포 배양 작업을 위한 모든 층류 캐비닛이 적합할 것입니다
세포 배양 인큐베이터	Thermo Scientific	모델: 370	모든 세포 배양 인큐베이터가 적합합니다 - 세포는 습도 환경, 5% CO2, 37 °에서 배양되었습니다. 씨
ImageJ	NIH	버전 1.50e	최소 버전 필요
Java Runtime Environment	Oracle	버전 1.8.0_66	최소 버전 필요