방법 논문

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

DOI:

10.3791/54722

⸱

2016년 12월 23일

 ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, University of California, Davis, 2UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis

이 논문에서

요약

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특이성이 높고 부작용이 적은 암 약물을 종양 부위에 전달하려면 나노 입자를 기반으로 하는 새로운 방법이 필요합니다. 여기에서는 과산화수소 매개 산화에 의해 쉽게 준비될 수 있고 종양이 감소하는 환경에서 효율적으로 해리되어 페이로드를 방출할 수 있는 이황화 가교 미셀에 대해 설명합니다.

초록

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나노 의학은 생물 의학 응용 프로그램에 대한 규모 나노 미터 입자의 고유 한 특성을 이용합니다 치료의 새로운 형태이다. 치료 결과를 극대화하고, 약물과 관련된 부작용을 감소시키는 약물 전달을 향상 오늘날 나노 의학의 초석 일부이다. 특히 나노 입자는 암 치료의 다양한 응용 프로그램을 발견했다. 디자인, 응용 프로그램 및 종양 미세 환경에 따라 생산에 높은 수준의 유연성을 제공 나노 입자는 임상 적으로 신속한 번역 더 효과적 일 것으로 예상된다. 고분자 미셀 나노 캐리어는 약물 전달 응용 프로그램에 대한 인기있는 선택입니다.

이 글에서, 우리는 잘 정의 된 양친 선형 수지상 공중 합체 (telodendrimer, TD)의 자기 조립 (self-assembly)에 따라 약물로드, 이황화 가교 미셀을 합성하는 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다. TD는 폴리에틸렌 GL 구성된다친수성 세그먼트 용액 계 펩티드 화학 제를 사용하여 아민 종결 된 PEG에 코어 형성 용 소수성 잔기에 부착 단계적 같은 티올 콜산 클러스터와 ycol (PEG). 파클리탁셀 (PTX)과 같은 화학 요법 약물은 표준 용매 증발 법을 사용하여로드 될 수있다. 오 2 - 매개 산화는 이전에 TDS 농도에 무료 티올 그룹에서 내 미셀 이황화 가교를 형성하기 위해 사용 하였다. 그러나 반응이 느리고 대규모 생산에 가능하지 않았다. 최근는 H 2 O 2 - 매개 산화법 더 가능하고 효율적인 방식으로 탐구하였으며, 이는 96 배 빠른 속도로 이전에보고 된 방법보다이었다. 이 방법을 사용 PTX로드, 이황화 가교 나노 입자 50g을 성공적으로 좁은 입자 크기 분포와 높은 약물 적재 효율로 생산되고있다. 얻어진 미셀 용액의 안정성은 그러한 w 공동 배양 같은 방해 조건을 이용하여 분석또는 환원제없이 세제, 도데 실 황산나트륨, 제 i. 이들 비 - 가교 상대 비교할 때 약물로드 디설파이드 가교 미셀 적은 용혈 활성을 보여 주었다.

서론

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나노 기술은 생물 의학 분야 (1)의 수를 도움이되고 빠른 신흥 분야이다. 나노 입자는 기존 치료제의 다른 유형 가능하지 않은 특성을 설계 및 튜닝을위한 기회를 제공한다. 나노 담체는 약물 순환 시간을 연장, 생분해에 대한 약물의 안정성을 향상시키는 약물 용해도 문제를 극복하고, 미세 조정 표적 약물 전달 및 공동 전달 조영제 1.2이 될 수있다. 나노 입자 기반 배달 시스템은 암 이미징 및 치료에 약속을 개최합니다. 종양 vasculatures는 거대 분자에 누설하고 향상된 침투성 및 보존 (EPR) 효과 3를 통해 종양 부위에 나노 입자를 순환의 우선 축적으로 이어질 수 있습니다. 적극적으로 항암 약물 캐리어로 추진되고있는 여러 가지 나노 캐리어 (예를 들어, 리포좀, 하이드로 겔 및 고분자 미셀) 중 고분자 미셀은 일을 통해 폭 넓은 인기를 얻고있다전자 지난 십 4,5.

고분자 미셀은 정맥 내 투여에 잠재적으로 그들의 unimers 해리 선도의 임계 미셀 농도 (CMC) 미만으로 희석 할 수 있고, 열역학 시스템이다. 가교 전략에 unimers 미셀 해리를 최소화하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 과도하게 미셀 안정화시켜 전체 치료 효과를 감소 대상 부위에서 방출로부터 약물을 방지 할 수있다. 여러 가지 화학적 방법은 수 있도록 탐구 된 가교 산화 환원에 대한 응답으로 또는 환원 이황화 결합 6,7 및 pH의 절단 (8) 또는 가수 분해 가능한 에스테르 결합 9,10와 같은 외부 자극에 분해.

우리는 이전에 telodendrimers (TD)이라고 설계 및 수지상 콜산 (CA) 및 블록 선형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공중 합체로 이루어진 미셀 나노 입자의 합성을보고 11-15 SUP. 이 TDs를은 (N = 분자량 킬로 달톤 (K)에서, y는 콜산의 수 (CA) 단위 =) PEG NK -CAy로 표시됩니다. 그들은 이러한 소수성 코어 파클리탁셀 (PTX)과 독소루비신 (DOX)로 캡슐화 약물에 작은 크기, 긴 수명, 높은 효율을 특징으로한다. 이러한 PEG, 리신, 및 CA 등 TD의 빌딩 블록은 생체 적합성 및 PEG 코로나의 존재는 망상 내피 시스템에 의해 미셀 나노 입자의 비특이적 흡수를 방지하는 "은폐"나노 입자의 특성을 부여 할 수있다.

티올 선형 덴드리머 용이 우리 표준의 TDS 수지상 올리고 라이신 백본에 시스테인을 도입함으로써 생성 될 수있다. 이 문서의 TDS 소수성 코어에 이황 가교 (도 1)을 도입함으로써 가역적 가교 미셀 약물 전달체의 제조를위한 손쉬운 프로토콜을 제공한다.

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프로토콜

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윤리 문 : 여성 무 흉선 누드 마우스 (민 / 뉴 주) 6-8 주령은 구입 후 AAALAC 지침에 따라 무균 상태에서 보관하고 실험하기 전에 적어도 4 일 동안 순응시켰다되었다. 모든 동물 실험은 기관의 지침에 따라 수행 캘리포니아 데이비스 대학의 동물 사용 및 관리 관리 자문위원회에 의해 승인 된 프로토콜 번호 07-13119 호 및 제 09-15584에 따라되었다.

TD PEG 5K -Cys 1. 합성 4 -Ebes 8 -CA (8)

  1. 둥근 바닥 플라스크에, 얼음에 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 및 냉기의 10 ~ 20 ml의 MEO-PEG 5K -NH 2 (2g, 0.4 밀리몰)을 녹인다.
  2. 유리 비이커에 3 당량을 용해. 1- 히드 록시 -6- 클로로 - 벤조 트리아 졸, 벤조 트리아 졸 (HOBt), 3 당량의. N의 N '이소 프로필 카보 다이이 미드 (DIC), 3 당량. 무수 D에서의 (FMOC) 2리스-OHMF (10-15 mL)을 첨가 하였다. 자기 볶음 접시에 15 ~ 20 분 동안 교반한다.
  3. 메오 5K-PEG -NH 2. 얼음 욕을 제거하고 실온에서 밤새 반응 혼합물을 교반 함유하는 반응 플라스크에 혼합물을 추가한다.
  4. 박막 크로마토 그래피 (TLC) 16 카이저 테스트 (17), 반응의 완료를 확인 (황색 무연 NH 2의 부재를 나타낸다). 반응 플라스크에 빙냉 에테르 약 200 ml에 첨가하여 중합체 생성물 1 (MEO 5K-PEG -Lys (NH-FMOC)를 2) 침전물. 원심 분리를 통해 침전 된 폴리머 (6 6,000 XG에 분, 4 ° C)를 분리합니다.
    1. TLC를 수행 실리카겔 코팅 TLC 플레이트 상에 시료를 발견. 디클로로 메탄 / 메탄올을 사용하여 (9 : 1)을 이동상으로서. TLC 판을 개발 한 후 UV 램프 아래 지점을 관찰한다. 하나는 핫 플레이트 아민 반점을 가시화 염색 시약을 닌히 드린 사용할 수있다.
    2. 카이에 대한산이의 테스트는, 카이저의 시약을 포함하는 유리 튜브의 샘플을 조금 넣습니다. 5 분 동안 100 ℃에서 가열 한 상기 색상 변화 (용액의 색이 노란색 남아있는 경우, 다음 반응이 완료 될 때)을 찾는다.
  5. 무수 DMF (10-20 mL) 중의 생성물을 재용 해하고, 침전 및 원심 분리를한다 (단계 1.4 참조)를 반복한다.
  6. 다음 반복 단계 1.5 및 빙냉 에테르 중합체 침전물을 세 번 세척 하였다.
  7. 깨끗한 반응 플라스크에 폴리머 석출 한 전송 잔류 에테르를 제거 고진공 소스로 플라스크를 연결한다.
  8. 준비하고 20 %의 약 20 ~ 30 ml에 추가 (v / v)의 DMF 4 메틸 피 1 중간을 중합체. 완전히 용해 될 때까지 저어. 3 시간 동안 반응을 실행합니다.
  9. TLC 16 수행하고 황제의 시험 (청색 무료 NH 2의 존재를 확인) (17) (단계 1.4 참조) completio을 확인합니다반응 없음. 반응이 완료되면 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이, 에테르 침전를 진행합니다.
  10. 고분자 제품 2 (MEO-PEG 5K -Lys (NH 2) 2) 진공에서 건조.
  11. (1.1-1.7 단계) 제품 3을 생성하는 중간 2 상 (FMOC) 2리스-OH 결합 하나 더 라운드를 수행 (MEO-PEG 5K -Lys (리스 (NH-FMOC) 2) 2). (1.8-1.10 단계)를 FMOC 그룹 (4, MEO-PEG 5K -Lys (리스 (NH 2) 2) 2) 커플 (FMOC)리스 (BOC) (1.1-1.7 단계) -OH로 드 보호 3 세대 수지상 폴리 라이신 생성 (5, MEO-PEG 5K -Lys-리스 2 - ((FMOC)리스 (BOC)) 4) PEG 사슬의 한쪽 끝에서 네 BOC 및 FMOC 그룹이 종료되었습니다.
  12. 반응 플라스크에 중간체 얻어진 중합체 5 옮긴다. 에서와 같이디클로로 메탄 (DCM)에서 1 (v / v)의 트리 플루오로 아세트산 (TFA) : eparate 반응 플라스크 1을 준비합니다. 폴리머 (5) 중간에 1 TFA / DCM (v / v)의 혼합물 : 1의 15 ~ 20 ML을 추가합니다. 중합체가 완전히 용해 될 때까지 혼합물을 교반한다. 추가로 3 시간 동안 교반한다.
  13. TLC 16 카이저의 수행 및 시험 반응 종료를 확인하기 위해도 17의 (단계 1.4 참조) (청색 무연 NH (2)의 존재를 확인한다). 반응이 완료되면 점성 용액이 얻어 질 때까지 공기와 중합체 인 TFA / DCM 혼합물을 증발시켰다. 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이, 에테르 침전를 진행합니다. 진공에서 - (((FMOC)리스 (NH 2)) 4 -Lys-리스 2 MEO-PEG 5K) 고분자 제품 (6)을 건조.
  14. 반응 플라스크에 6 중간 전사 중합체. 8 당량을 포함하는 무수 DMF의 약 40 ml를 사용합니다. N의 N의 -diisopropylethylami네브라스카 (DIEA)는 폴리머 (6) 중간을 용해한다. 유리 비이커에, 12 당량을 용해. 의 HOBt, 12 당량. DIC, 12 당량의. 무수 DMF의 20 ~ 25 ml의의의 (FMOC) 시스테인 (트리트) -OH. 10 ~ 15 분 동안 진탕 한 후 (6)을 함유하는 반응 플라스크에 반응 혼합물을 추가한다. 밤새 반응을 실행합니다.
  15. TLC (16)와 카이저의 시험과 반응의 완료를 확인합니다 (단계 1.4 참조; 황색 무료 NH 2의 부재를 나타내는) 17. ((FMOC) 라이신 - - ((FMOC) Cys 또는 반응이 완료되면 제품 1 (단계 1.4-1.6)에 대해 언급 된 바와 같이, 제품 7 (MEO 5K-PEG -Lys-리스 2 분리, 에테르 침전 진행 (트리트))) 4.
  16. 제품 8 얻기 위해, 단계 1.8에 설명 된대로, 7 FMOC 탈 보호를 수행합니다 (- (리스 (NH 2) - PEG 5K -Lys-리스 2 (시스테인 (NH 2) (트리트을))) 4). 커플 (FMOC) -PEG 2 -Suc-OH ( "Ebes"링커, 24 당량.)를의 HOBt에 대해 위에서 설명 된 절차를 사용하여 중간 고분자 / DIC 매개 커플 링에 중간 9 (MEO-PEG 5K -Lys-리스 2 -Lys 4 얻기 - (시스테인 (트리트을) ) 4 (Ebes (NH-FMOC)) 8).
  17. 중간 10 얻을 수 FMOC 탈 보호 한 번 더 라운드 (1.6-1.8 단계) 수행 (MEO-PEG 5K -Lys-리스를 2 -Lys 4 - (시스테인 (트리트)) 4 (Ebes (NH 2)) 8).
  18. 반응 플라스크에 폴리머 중간층 (10)을 전송하고 용해 무수 DMF (30-40 ml)로 추가한다. 또 다른 반응 플라스크에서 24 당량을 용해. 무수 DMF에 (이전에 게시 된 절차에 따라 제조) CAOSu (20 ~ 30 ㎖) 18. 48 당량을 추가합니다. 및 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민으로는 10 ~ 15 분 동안 교반 할 수 있습니다. 10을 함유하는 반응 플라스크에 콘텐츠를 전송하고, 반응 런 O하자vernight.
  19. TLC 16 카이저의 테스트로 반응 종료를 확인하고 (단계 1.4 참조, 황색 무연 NH 2의 부재를 나타내는) 17. (Cys이고 (트리트)) 4 -Ebes - 반응이 완료되면 제품 1 (1.4-1.6 단계) 제품 (11)을 분리 (MEO 5K-PEG -Lys-리스 2 -Lys 4 바와 같이, 에테르 침전 진행 8 -CA 8). 탈 이온수를 투석하고, 백색 분말을 수득 샘플을 동결 건조.
  20. 반응 플라스크에 중간 폴리머 (11)를 놓습니다. 준비하고 고분자 용액에 TFA / 1,2- 에탄 (EDT) / 트리 에틸 실란 (TIS)의 20 ㎖ / H 2 O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, v / v)의 혼합물을 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 혼합물을 저어. 4 시간 동안 반응을 실행합니다. TLC (16)에 의해 반응 종료를 확인한다.
  21. 흄 후드 아래에 공기를 불어 폴리머 TFA / EDT / TIS / H 2용액까지 O 혼합물의 점성이된다. 제품 1 (1.4-1.6 단계)에 대해 언급 한 바와 같이 최종 제품, 12 (PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8)를 분리, 에테르 침전를 진행합니다. 아세토 니트릴에 용해하고, 백색 분말을 수득하여 동결 건조.

PTX로드 미셀 2. 준비

  1. 표준 증착 방법을 사용하여 PTX로드 PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 미셀을 준비합니다.
    1. 클로로포름 1 ㎖ (클로로포름)에서 PTX의 다른 양 (1-9 mg)을 함께 TD 20 mg을 녹이고. 균질 건조한 중합체 필름을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거한다. 필요한 경우 약물로드 미셀의 형성을 허용하도록, 40 kHz에서 30 분 동안 초음파 처리 하였다 와류에 의한 인산 완충 용액 (PBS) 1 ㎖로 필름을 재구성한다.
    2. 3 %의 (w / w) H 2 O 2 (1 당량 6 μl를 추가합니다. 호텔 fr하기TD를에 티올기를 산화) 티올기를 EE. 엘만 (Ellman) 테스트 (19)에 의해 지시 된 바와 같이 유리 티올 그룹의 레벨이 일정하게 낮은 값으로 유지되면 추가 특성에 대한 미셀 솔루션을 사용합니다.
    3. 샘플을 살균 할 수있는 0.22 μm의 필터 솔루션을 필터링합니다. 9 번 아세토 니트릴을 첨가하고, 초음파 처리를 10 분간 수행하여 미셀의 약물 방출 후 HPLC 시스템 (20)의 미셀에로드 된 약물의 양을 분석한다. 이동상으로 아세토 니트릴 / 물 HPLC의 C18 컬럼을 사용합니다.
    4. HPLC로 면적 값과 11 표준 약물 농도의 검량선에 따라 약물 로딩을 계산한다.
      주 : 적재 효율이 초기 약물 함량 미셀에로드 약물의 비율로 정의된다.

미셀 3 요소 특성 분석

  1. 제 m의 크기 및 크기 분포를 측정동적 광산란 (DLS) 악기 (29)와 icelles. 실온에서 측정을 수행하고 ㎖ / 1 밀리그램의 미셀 농도를 유지한다.
    주 : 입자 크기 분석을 수행 빈으로 PBS를 사용하고 실제 샘플 입자 크기를 기록한다. 샘플에 대한 세중의 측정을하고 측정 값을 평균.
  2. 이전에 13,21 바와 같이, 이전과 소수성 형광 프로브로 피렌와 가교 후 PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA (8)의 임계 미셀 농도 (CMC)을 측정하는 형광 스펙트럼을 사용합니다.
    참고 : 일반적으로, 미셀 농도는 5 × 10-7 5 × 10 -4 M. 범위

또는 환원제없이 SDS에서 미셀 4. 안정성

  1. 소듐 도데 실 설페이트 스톡 용액 (SDS) 용액 (7.5 ㎎ / ㎖) 및 PBS에서 이황화 가교 미셀 (1.5 ㎎ / ㎖)을 준비한다. 다음, U를최종 SDS 농도로 된 혼합 용액을 상기 원액을 2.5 ㎖의 노래 밀리그램 / 및 미셀 농도가 1.0 ㎎ / ㎖이다.
  2. 또는 10 mM의 글루타치온 (GSH)의 존재없이 소정의 시간 간격으로 미셀 용액 (단계 3.1에서 언급 한 바와 같이) 크기 및 크기 분포를 측정한다.

5. 용혈 분석

  1. 로부터 수집 이전에 발행 절차 (11)와 누드 마우스에서 신선한 구연산 혈액을 사용하여 PTX-로드 가교 미셀 (PTX-된 DCM)에 따라 제조 PTX-로드, 비 가교 미셀 (PTX-NCMs)의 용혈성 잠재력을 평가 꼬리 베일.
    1. 2 %의 최종 농도로 PBS로 세포 펠렛을 다시 정지 후, 10 분간 1,000 XG에서 혈액 샘플 (1.0 mL)을 원심 분리하여 적혈구를 모아서 PBS로 세 번 세척하고.
  2. 서로 다른 농도 (0.2 및 1.0 적혈구 현탁액 200 μl를 혼합mg의 PTX-NCMs 및 PTX-된 DCM,의 / ㎖)을 각각 및 인큐베이터 통에 37 ° C에서 4 시간 동안 배양한다.
  3. 5 분 동안 3,000 XG에서 미셀 적혈구 혼합물을 원심 분리기. 96 웰 플레이트의 모든 샘플의 상등액 100 ㎕를 옮긴다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 상층 액의 헤모글로빈의 흡광도를 측정한다.
    주 : 트리톤-100 (2 %) 및 PBS와 함께 배양 된 RBC를 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하여야한다. 적혈구의 퍼센트 용혈는 다음과 같은 공식으로 계산된다 적혈구 용혈 = (OD 샘플 - OD 대조군) / (OD 양성 대조군 - OD 대조군) × 100 %입니다.

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결과

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약물로드, 이황화 가교 미셀의 제조 및 특성

양친 매성 고분자 5K PEG -Cys -Ebes 4 8 8 -CA 암 약물 전달 디설파이드 가교 미셀 시스템을 형성 할 수있는 수지상 중합체. 구조적으로, 이는 분지 된 폴리 (라이신 시스테인 Ebes) 백본을 통해 선형 PEG 분자 (친수성 도메인 분자량 5K)의 일단에 연결된 콜릭 산 (소수성 도메인)의 수지상 올리고머로서 정의된다. 다른보고 미셀 시스템을 통해 이러한 블록 공중 합체를 사용하여 여러 가지 이점이있다. 첫째, 용이 단계적 용액 상 축합 반응을 통해 합성 될 수있다. 둘째, 잘 확립 된 용액 상 펩티드 단계적 FMOC 화학을 통해 제조 된 몇몇 다른보고 된 양친 성 중합체, 티올 중합체 시스템에 비해, 잘 정의 된 구조물의 있습...

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토론

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여러 가지 나노 입자는 약물 전달에 잠재적 인 사용을 위해 조사되었다. 리포좀 독소루비신과 파클리탁셀 (PTX)는 인간 혈청 알부민 나노 집계가 암 치료에 대한 FDA의 승인을 nanotherapeutics 중입니다 -loaded. 임상 적 효과가 있지만, 그러나, 이러한 nanotherapeutics 모두는 상대적으로 크기가 "큰"이며, 그들은 간과 폐에 축적되는 경향이있다. 상대적으로 작은 입자 크기와 높은 약물 적재 용량 고분자 미셀 약물 전달을위한 nanocarriers을 부상하고있다. 고유 한 코어 - 쉘 구조의 '용해'물리적 캡슐화 수성 조건 하에서 소수성 약물 분자. 약물 봉입 긴 저장 수명 및 높은 효율을 갖는 연구실 형태 단 분산 나노 입자 제조 TDs를 잘 정의 된 (10 내지 50 nm의 입자 지름)으로 구성된 고분자 미셀. 강인한 TD 플랫폼의 많은 장점 중 하나는 고분자의 다양성이다.많은 약물, 형광 염료 및 타겟팅 리간드 용이 TD 13,15,24 플...

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공개 사항

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Y. Li와 KSL은 가역적 가교 미셀 시스템에 대한 출원 중인 특허(미국 특허 출원 61/485,774)의 발명가입니다. KSL은 원고에 설명된 나타페우틱스를 개발할 계획인 LamnoTherapeutics Inc.의 창립 과학자입니다. 나머지 저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 편집에 도움을 준 Alisha Knudson에게 감사를 표합니다. 그들은 또한 NIH/NCI(3R01CA115483, K.S.L.), DoD PRMRP Award(W81XWH-13-1-0490, K.S.L.), NIH/NCI(1R01CA199668, Y.L.) 및 NIH/NICHD(1R01HD086195, Y.L.)의 재정적 지원에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MeO-PEG5K-NH2Rapp Polymere125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OHAaptecAFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OHAnaspecAS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OHAapptecAAC105
디메틸포름아미드Fisher ScientificBP1160-4
에틸 에테르Fisher ScientificE134-20
N,N-DiisopropylethylamineSigma AldrichD125806
Trifluoroacetic acidSigma AldrichT6508부식성, 조심스럽게 다루십시오
4-methyl piperidineAlfa-AesarL-02709
Ebes 링커AnaspecAS-61924
콜산Sigma AldrichC1129
1,2-EthanedithiolSigma Aldrich02390흄 후드 내부 손잡이. 사용 후 장갑을 표백하십시오.
트리 이소 프로필 실란시그마 알드리치233781
클로로포름 (무수)시그마 알드리치288306
과산화수소 용액 30 %Aaron IndustriesNA
HoBt-ClAaptecCXZ096
DIC시그마 알드리치D125407
여성 흉선 누드 마우스 (Nu / Nu 균주), 6– 8주 령할란(캘리포니아주 리버모어)

참고문헌

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