처리된 폐수 유출수 및 지표수(수신)수를 포함한 물 샘플의 유기 추출물에서 내분비 활성을 스크리닝하기 위한 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 분할 정지("동결 및 해동") 체외 형질 전환 생물 검정을 사용하여 조정되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
체외 전이 활성화 생물 검정에서 그러나 자신의 채택 및 광범위한 응용 프로그램으로 인해 표준화 된 방법과 강력하고 사용자 친화적 인 기술의 가용성의 부족으로 부분적으로 방해하고있다, 수질 모니터링 도구로 약속을 보여 주었다. 본 연구에서는 시판 부문 체포 세포주 정량적으로 환경 품질 전문가에게 관심의 물 샘플에 존재하는 화학 물질의 내분비 활동을 선별하기 위해 사용되었다. 포괄적 인 품질 보증 / 품질 관리를 포함 하나, 표준화 된 프로토콜 (QA / QC) 검사 셀 기반 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석을 사용하여 (각각, ER 및 GR) 에스트로겐과 글루코 코르티코이드 수용체의 활동을 위해 개발되었다. 캘리포니아 (미국) 담수 시스템에서 처리 된 하수 폐수 및 지표수의 샘플은, 고상 추출을 사용하여 추출하고, 표준화 된 프로토를 사용하여 내분비 활동을 분석 하였다안부. 배경 및 엔드 포인트 별 기준 화학 물질에 대한 용량 - 반응은 신뢰할 수있는 측정을 위해 필요하다고 인정 QA / QC 가이드 라인을 만났다. 표면 물 샘플에 대한 생물 검정 심사의 반응은 크게 감지되지 않았습니다. 대조적으로, 2 차 처리 공장에서 폐수 샘플 ER 392 ng를 덱사메타손 GR에 대한 / L 및 17 ng를 17β-에스트라 디올 / L까지 추정 된 생물 검정 등가 농도 (BEQs)로, 가장 높은 측정 활동을했다. 급 유출 샘플에 대한 생물 검정 응답은 고도 처리 후 내분비 활성 화학 물질의 낮은 잔류를 나타내는 보조 폐수를 측정보다 낮았다. 이 프로토콜은 시판 활용 체외 전이 활성화 생물 검정에, 분할 체포 셀 "키트"물에 내분비 활동에 대한 선별 적용 할 수 있음을 보여 주었다.
서론
현재 수질 모니터링은 정확하고 정밀 야생 동물 및 인체 노출 프록시로 화학적 오염 물질의 발생을 측정하는 능력을 전제한다. 그러나,이 화학 물질 별 화학 물질 모니터링 및 평가 패러다임은 우리가 직면 끊임없이 변화하는 화학 우주와 보조를 맞출 수 없습니다. 우리가 운명 합성 및 천연 화학 물질의 효과에 대한 자세한 내용은, 우리는 생물학적 영향을 예상 다루도록 측정 도구를 검색을 계속하고, 동시에 그 화학 물질의 생산, 사용 및 환경 입력의 변화에 면역이다. 이러한 도구는 알 수 없거나 새로운 화학 물질 및 변환 제품은 우리의 관심을받을 자격이 있는지 이해에 특히 적합하다. 또한, 물에 존재하는 화학 물질의 복잡한 혼합물이 잘못 개별 화학 물질 모니터링에 의해 해결된다. 따라서, 우리는 더 나은 주소로 지표수 그쪽에서 이러한 문제를 기존의 모니터링 도구 상자를 현대화의 도전에 직면t이 처리 된 폐수 유출 및 도시 / 강우 유출수의 방전을받을 수 있습니다.
최근, 생물 분석 기법 수질 평가 스크리닝 도구로서 가능성을 보여 주었다. 알려진 통해 작용하는 화학 물질에 반응 특히, in'vitro 생물 검정에서, 행동 1,2의 특정 모드는 환경 모니터링 지역 3 큰 관심이다. 다수....
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프로토콜
1. 수집 및 처리 물 샘플 (에셔 등의 수정. 9)
- 관심의 물 샘플 정상에 1g 나트륨 아 지드 50 mg의 아스코르브 산을 포함하는 깨끗한 1 L 황색 유리 병을 채 웁니다. 72 시간 내 매장 4 ° C에서 샘플 및 프로세스.
주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이주의를 처리해야합니다. 보호 장비 (눈 / 얼굴, 장갑, 의류)을 사용하고, 제대로 작동 흄 후드에 무게. 계량 금속 주걱을 사용하지 마십시오. - 1.6 μM 유리 섬유 필터를 통해 다음 50-10 ml / 분의 유속에서 컨디셔닝 고체상 추출 (SPE) 카트리지를 통해 샘플을 통과한다. 유량을 제어하기위한 진공 펌프의 압력을 조정한다.
- 진공을 15 분 동안 카트리지를 건조.
- 아세톤 10 ㎖ 다음 메탄올 10 ㎖와 카트리지 용리 : 헥산 (1 : 1, V / V).
- 고순도 질소의 부드러운 흐름하에 ~ 1 mL의 용출액을 농축시킨다. 용제디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 500 μl를 첨가하고, 다운 500 μL에 추출물을 증발시켜 교환.
- 황색 유리 오토 샘플러 바이알에 추출물을 전송합니다. -20 ° C에서 보관하십시오.
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결과
본 연구에서는, 처리시 폐수 유출의 4 배 24 시간 복합 샘플, 남부 캘리포니아에서 담수 시스템의 지표수 6 잡아 샘플 및 초순수로 구성된 필드를 비워는이 프로토콜을 설명하기 위해 선정되었다. 4 유출 물 샘플 3은 기존의 활성 슬러지 폐수 처리 시설 ( "보조 유출"), 모래 / 탄소 여과 추가 후 생물학적 처리 ( "차 유출")와 고급 폐수 처리 공장에서 네 번째로 하였다. 표면 물 샘플 (개방, 농업 및 도시) 다른 토지 이용을 나타내는 유역에서 수집 하였다.
물 추출물의 희석은 DMSO 컨트롤 (표 1)에 비해 관찰 된 20 % 미만의 세포 사망률 명백한 세포 독성을 보이지 않았다. 무 세포 (배지만) 배경이 낮고, 그리고 C셀만 및 DMSO 반응 셀들 사이 omparison 용매는 형.......
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토론
이러한 17β-에스트라 디올 (E2), NG /의 L 농도 23, 24에서 이러한 화학 물질에 대한 보증 심사 등의 환경 에스트로겐의 잘 문서화 힘. 본 연구에서는 폐수 유출 물에 대한 ER 응답 (BEQ 범위 : 2.3-17 ng의 E2 / L)이 E2 / L NG 4 0.5 <지표수 (대한 BEQs 반면, 호주 WWTPs 20 차 유출에 대해보고보다 다소 높았다 ) E2 NG 11 / L) (16)에 다른 표면과 우수 (<1에 대해보고 된 범위 내에 있었다. 표면 물 샘플에서 측정 ER 활성의 낮은 수준에도 불구하고,이 분석 물의 품질 평가를위한 중요한 검사 포인트를 나타낸다. 비스페놀 A 및 알킬 페놀 계면 활성제와 같은 에스트로겐은 종종 수생 환경에서 발견되지만, 기존의 분석 화학을 사용하여 정량화하기가 어려울 수 있습니다. 코지마 등의 알 같이 ER-세포 분석은 또한, 현재 및 새로 등록 된 농약의 검사를위한 유용 할 수있다25........
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
자금은 주 수자원 관리 위원회(협정 번호 10-096-250 및 14-090-270)에서 제공했습니다. 우리는 S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi 및 J. Printen에게 감사드립니다. 저자는 이해 상충이 없음을 선언하며, 상표명에 대한 언급이 보증을 의미하지는 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| GeneBLAzer ER alpha DA 분석 키트 | ThermoFisher | K1393 | 키트에는 ER 분할 체포(DA) 세포와 LiveBLAzer FRET 로딩 키트가 포함되어 있습니다. |
| GeneBLAzer GR DA 분석 키트 | ThermoFisher | K1391 | 키트에는 GR 분할 체포(DA) 세포와 LiveBLAzer FRET 로딩 키트가 포함되어 있습니다. |
| PrestoBlue 세포 생존 시약 | ThermoFisher | A-13261 | |
| 트리판 블루, PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | ThermoFisher에서도 사용 가능 |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individual-wrapped, sterile with lid |
| Whatman 유리 섬유 필터, GF/A, 1.6 µ M | 시그마-알드리치 | ||
| 마이크로플레이트 알루미늄 밀봉 필름 | E& K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc 카트리지, 200 mg 흡착제 | Waters | WAT106202 | |
| 17β 에스트라디올 | 시그마-알드리치 | E2758 | CAS #50-28-2 |
| 아스코르브산 | Fisher Scientific | A61-100 | Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone에서도 사용 가능 | 시그마-알드리치 | D4902 | CAS #50-02-2 |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | 시그마-알드리치 | D8418 | 분자 등급 |
| 용매 (아세톤, 헥산, 메탄올) | Fisher Scientific | HPLC 등급 | |
| 아지드 나트륨 | 시그마-알드리치; | S2002 | 화학 물질은 독성이 강하므로 주의해서 취급해야 합니다. 보호복을 착용하고 흄 후드 아래에서 체중을 측정하십시오. EMD Millipore에서도 사용할 수 있습니다. |
| 자동 세포 계수기 또는 혈구계 | 다양한* | 공급업체로는 Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich 및 ThermoFisher가 있습니다. | |
| 클래스 II 생물 안전 캐비닛 | 다양한* | ||
| CO2 인큐베이터 | 다양한* | ||
| 극저온 냉동고 | 각종* | 액체 질소 저장 듀어를 권장합니다. | |
| 형광 마이크로플레이트 리더 | 다양한* | 리더에는 하단 읽기 기능이 있어야 합니다. | |
| * 권장 출처 없음, 이 장비의 선택은 예산, 사용 빈도 및 실험실 공간에 따라 다릅니다. |
참고문헌
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrin....
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재인쇄 및 허가
