방법 논문

물 사용에 내분비 활동에 대한 선별 시판 체외 전이 활성화 생물학적 정량

DOI:

10.3791/54725

⸱

2016년 12월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Southern California Coastal Water Research Project Authority, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

처리된 폐수 유출수 및 지표수(수신)수를 포함한 물 샘플의 유기 추출물에서 내분비 활성을 스크리닝하기 위한 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 분할 정지("동결 및 해동") 체외 형질 전환 생물 검정을 사용하여 조정되었습니다.

초록

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체외 전이 활성화 생물 검정에서 그러나 자신의 채택 및 광범위한 응용 프로그램으로 인해 표준화 된 방법과 강력하고 사용자 친화적 인 기술의 가용성의 부족으로 부분적으로 방해하고있다, 수질 모니터링 도구로 약속을 보여 주었다. 본 연구에서는 시판 부문 체포 세포주 정량적으로 환경 품질 전문가에게 관심의 물 샘플에 존재하는 화학 물질의 내분비 활동을 선별하기 위해 사용되었다. 포괄적 인 품질 보증 / 품질 관리를 포함 하나, 표준화 된 프로토콜 (QA / QC) 검사 셀 기반 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석을 사용하여 (각각, ER 및 GR) 에스트로겐과 글루코 코르티코이드 수용체의 활동을 위해 개발되었다. 캘리포니아 (미국) 담수 시스템에서 처리 된 하수 폐수 및 지표수의 샘플은, 고상 추출을 사용하여 추출하고, 표준화 된 프로토를 사용하여 내분비 활동을 분석 하였다안부. 배경 및 엔드 포인트 별 기준 화학 물질에 대한 용량 - 반응은 신뢰할 수있는 측정을 위해 필요하다고 인정 QA / QC 가이드 라인을 만났다. 표면 물 샘플에 대한 생물 검정 심사의 반응은 크게 감지되지 않았습니다. 대조적으로, 2 차 처리 공장에서 폐수 샘플 ER 392 ng를 덱사메타손 GR에 대한 / L 및 17 ng를 17β-에스트라 디올 / L까지 추정 된 생물 검정 등가 농도 (BEQs)로, 가장 높은 측정 활동을했다. 급 유출 샘플에 대한 생물 검정 응답은 고도 처리 후 내분비 활성 화학 물질의 낮은 잔류를 나타내는 보조 폐수를 측정보다 낮았다. 이 프로토콜은 시판 활용 체외 전이 활성화 생물 검정에, 분할 체포 셀 "키트"물에 내분비 활동에 대한 선별 적용 할 수 있음을 보여 주었다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 수질 모니터링은 정확하고 정밀 야생 동물 및 인체 노출 프록시로 화학적 오염 물질의 발생을 측정하는 능력을 전제한다. 그러나,이 화학 물질 별 화학 물질 모니터링 및 평가 패러다임은 우리가 직면 끊임없이 변화하는 화학 우주와 보조를 맞출 수 없습니다. 우리가 운명 합성 및 천연 화학 물질의 효과에 대한 자세한 내용은, 우리는 생물학적 영향을 예상 다루도록 측정 도구를 검색을 계속하고, 동시에 그 화학 물질의 생산, 사용 및 환경 입력의 변화에 ​​면역이다. 이러한 도구는 알 수 없거나 새로운 화학 물질 및 변환 제품은 우리의 관심을받을 자격이 있는지 이해에 특히 적합하다. 또한, 물에 존재하는 화학 물질의 복잡한 혼합물이 잘못 개별 화학 물질 모니터링에 의해 해결된다. 따라서, 우리는 더 나은 주소로 지표수 그쪽에서 이러한 문제를 기존의 모니터링 도구 상자를 현대화의 도전에 직면t이 처리 된 폐수 유출 및 도시 / 강우 유출수의 방전을받을 수 있습니다.

최근, 생물 분석 기법 수질 평가 스크리닝 도구로서 가능성을 보여 주었다. 알려진 통해 작용하는 화학 물질에 반응 특히, in'vitro 생물 검정에서, 행동 1,2의 특정 모드는 환경 모니터링 지역 3 큰 관심이다. 다수의 연구는 음주, 표면 및 폐수 4 -6의 내분비 활동을 정량화하는 체외 생물 검정에 사용하고있다. 또한, 생물 검정의 수가 분자 개시 이벤트 (예, 수용체 활성화) 잠재적으로 불리한 결과 경로를 통해 악영향 연결될 수 -7,8- 분석 대상.

수질 평가를위한 bioscreening의 진화에 대해 평가 된 시험 관내 생물 검정 엔드 포인트에서 다른 수백, 상대적으로 신속하고있다 그들의유틸리티 9,10. 현재 생물 검정의 소수는 수질 5,6-를 구별하는 능력을 보여주는 반면 (실험실 내에서) 양호한 측정 정밀도를 달성하는 것으로 나타났다. 특히 처리 된 폐수 유출의 경우, 에스트로겐과 글루코 코르티코이드 스테로이드의 발생은 성공적이었다 체외 전이 활성화 분석 (11, 12)에서 사용하기를 차지했다. 누구의 세포 라인 독점 (때문에 널리 사용되지 않음)입니다 그러나 지금까지 대부분의 연구가 고용 한 생물 검정은, 지속적인 관리 및 조작, 또는 두 가지 모두를 필요로한다. 그 결과, 능력은 사회가 장애 된 남아있는 물 자원이 선별 기술을 전송하는 궁극적 프로토콜을 표준화 간 실험실 교정 연습을 수행하고 있습니다.

미국 ToxCast 프로그램을 통해 심사 체외 생물 검정 중 적어도 하나의 공급 업체는 "동결과 해동을 사용하기 쉬운 13 상업적으로 사용할 수 있습니다4; 형식. 이러한 분할 셀 구속 "키트"는 처리 (14)의 서로 다른 레벨을 나타내는 물로부터 추출 된 화학 물질의 활성을 측정하는 강력한 것으로 나타났다. 공급 프로토콜은 개별 화학 물질 또는 이들의 혼합물의 생활 성을 스크리닝 할 수 있지만 이들이 물 샘플에 적용하기 전에, 그들 중 일부는 변경이 필요하다. 처리 된 폐수 유출 (15), 우수 유출 (16), 수신 물은 17, 18 그리고 최근 재활용 물 (19, 20) 수질 커뮤니티에 관심있는 수성 매질의 주요 예입니다.

이 연구는 시판 사용하여 물 샘플에서 내분비 활동을 측정하는 하나의 표준화 된 프로토콜을 제시 분할 체포 체외 전이 활성화 생물 검정에. 우리는 TW에 대한 응답의 배경, 복용량 응답 성 및 반복성의 포괄적 인 평가를 통해 프로토콜의 견고 함을 보여 주었다특히 관심의 에스트로겐과 글루코 코르티코이드 수용체의 전이 활성화 (ER 및 GR, 각각)의 오 엔드 포인트. 이 프로토콜은 캘리포니아에서 담수 시스템에서 처리 된 폐수 유출 및 지표수의 화면 샘플에 적용 하였다.

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프로토콜

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1. 수집 및 처리 물 샘플 (에셔 등의 수정. 9)

  1. 관심의 물 샘플 정상에 1g 나트륨 아 지드 50 mg의 아스코르브 산을 포함하는 깨끗한 1 L 황색 유리 병을 채 웁니다. 72 시간 내 매장 4 ° C에서 샘플 및 프로세스.
    주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이주의를 처리해야합니다. 보호 장비 (눈 / 얼굴, 장갑, 의류)을 사용하고, 제대로 작동 흄 후드에 무게. 계량 금속 주걱을 사용하지 마십시오.
  2. 1.6 μM 유리 섬유 필터를 통해 다음 50-10 ml / 분의 유속에서 컨디셔닝 고체상 추출 (SPE) 카트리지를 통해 샘플을 통과한다. 유량을 제어하기위한 진공 펌프의 압력을 조정한다.
  3. 진공을 15 분 동안 카트리지를 건조.
  4. 아세톤 10 ㎖ 다음 메탄올 10 ㎖와 카트리지 용리 : 헥산 (1 : 1, V / V).
  5. 고순도 질소의 부드러운 흐름하에 ~ 1 mL의 용출액을 농축시킨다. 용제디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 500 μl를 첨가하고, 다운 500 μL에 추출물을 증발시켜 교환.
  6. 황색 유리 오토 샘플러 바이알에 추출물을 전송합니다. -20 ° C에서 보관하십시오.

2. 분석 특정 참조 화학 물 추출물의 희석을 준비합니다

  1. 교정 곡선 (9) 희석을 준비합니다.
    1. 100 % DMSO의 분석 특정 기준 화학 물질의 원액을 확인합니다. 최종 농도는 ER 분석 2 μM 17β-에스트라 디올 및 GR 분석 100 μM 덱사메타손해야합니다. -20 ° C에서 재고 솔루션을 저장합니다.
    2. 멸균 튜브에 분석 매체의 285 μL에 대한 적절한 기준 화학 주식의 15 μl를 추가 (튜브 # 1). 상하로 피펫 팅하여 샘플을 섞는다.
    3. 8 추가 튜브 (튜브 # 2-9)에 분석 배지에서 5 % DMSO 용액 200 μl를 추가합니다.
    4. 욕조 통해 튜브 # 2 관 # 1에서 100 μL 나누어지는 이동예 # 9는 3 배의 일련의 희석을 수행한다. 각각의 희석 시료를 분취 량을 복용하고 다음 튜브에 추가하기 전에 피펫 충분히 혼합해야합니다.
  2. 분석 배지 190 μL의 DMSO 10 μL를 혼합 한 용매 대조군 샘플을 준비한다.
  3. 각각의 물 추출물에 대한 네 희석을 준비합니다.
    1. 제 1 튜브에 분석 배지 95 μL의 물 추출물 5 μL를 첨가하고 잘 혼합한다. 다른 세 튜브에 분석 매체에 5 % DMSO의 50 μl를 추가합니다.
    2. 다음에 하나의 튜브에서 용액 50 μl를 전송하여 2 배 희석을 수행합니다.

3. FRET 생물 검정을 실시하기 위해 세포 현탁액을 준비합니다

  1. 제조업체의 지침에 따라 분석 특정 매체를 준비합니다. 분석 매체는 4 ° C에서 보관 및 사용 전에 물을 욕조에 37 ° C로 예열해야합니다.
  2. 극저온 무료에서 ER 또는 GR 분할 체포 세포의 유리 병을 가지고ZER 부드러운 교반 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 배치하여 신속하게 세포를 해동합니다. 70 % 에탄올로 유리 병의 오염을 제거하고 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
  3. 무균 기술을 사용하여 유리 병을 열고 분석 배지 10 ㎖에 세포를 옮긴다.
  4. 5 분 동안 200 X g에서 원심 분리기.
  5. 멸균 유리 피펫을 사용하여 상등액을 흡인하고 분석 배지 6 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁.
  6. 중요한 얼룩 솔루션의 5 μL와 세포 현탁액의 5 μl를 혼합하고 계산 챔버로 나누어지는을 추가합니다.
  7. 광학 현미경 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포의 개수를 계산하고, 세포 현탁액의 생균의 농도를 추정한다. 분석 배지 1 ㎖ 당 550,000 생균의 최종 농도를 얻기 위해 필요한 경우 희석.

4. 플레이트 96 웰 블랙 벽 클리어 바닥 플레이트의 세포 및 희석 물 추출물 추가

  1. 접시 만들기각각의 물 추출물에 대한 9 점 분석 특정 교정 곡선, QA / QC 샘플과 다수의 희석을 포함 레이아웃. 96- 웰 플레이트 레이아웃의 예는도 1에 도시되어있다.
  2. 복제 무 세포 제어 우물에 분석 매체의 90 μl를 추가합니다.
  3. 멸균 피펫 저수지에 세포 현탁액을 붓고 멀티 채널 피펫을 사용하여 다른 우물에 세포 현탁액의 90 μl를 추가합니다.
  4. 적절한 우물 2 단계 동안 준비 희석 된 샘플의 10 μl를 추가합니다. 웰 당 DMSO의 최종 농도는 0.5 %의 최대해야합니다.
  5. 뚜껑 접시를 덮고 16 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에 넣습니다.

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그림 1. 96- 웰 플레이트 레이아웃 예제 멀티 웰 플레이트 분석법 특정 검량선 3 유형을 포함하도록 설계QA / QC 컨트롤의 물 추출물 당 4 희석 (미디어 만, DMSO 깨끗한 배지에서 세포와 세포 매체 아군). 각각의 제어 및 물 추출물의 희석이 세중의 우물에서 분석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5.로드 솔루션을 준비하고 각 음에 추가

  1. 인큐베이션 후, 플레이트를 실온으로 평형을 허용한다. 이 FRET의 생물 검정의 경우, 5.6을 통해 5.2 직접 빛의 부재에서 수행되어야 단계를 반복합니다.
  2. 제조자의 지시에 따라 6X 로딩 용액을 제조 하였다.
  3. 각 웰에 6 배 로딩 용액 20 μl를 추가합니다.
  4. 희석 물 추출물의 세포 독성을 평가하기 위해 각 웰에 세포 생존 시약 10 μL를 추가한다.
  5. 알루미늄 접착 필름 접시를 밀봉.
  6. 2 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 접시를 품어.

6. 측정 세포 독성 및 내분비 활동 응답

  1. 제조업체의 지침에 따라 하단 판독 기능을 갖춘 마이크로 플레이트 리더를 설정합니다.
  2. 프렛 전이 활성화 생물 검정법를 들어, 파란색 형광 (460분의 409 nm의 여기 (예) / 방출 (엠) 파장)과 녹색 (409 예 / 530 엠 ㎚) 채널을 측정한다.
  3. 세포 독성 분석의 경우, 560 예 / 590 엠 nm에서 형광을 측정한다.

7. 데이터의 품질을 결정하는 QA / QC 검사 평가

  1. 셀 전용 (클린 분석 배지에서 세포)를 제어하여 무 세포 (전용 미디어)의 평균 원시 형광을 비교합니다. 미디어 전용 배경 형광은 세포 전용 제어의 응답보다 25 % 이상 낮아야한다.
  2. 원시 FRET 데이터를 처리합니다. 모두 '파란색'과 '녹색'데이터 세트의 경우, 잘가 포함 된 모든 세포에서 세포가없는 대조군 웰의 평균 형광을 뺍니다. 을 계산각 실험 아니라 블루 / 그린 비율.
  3. DMSO 컨트롤 만 세포 및 세포의 파란색 / 녹색 비율을 비교. 이러한 컨트롤의 형광 값은 15 %의 상대 표준 편차 (RSD)이어야한다.
  4. 로그 분자량 (M 로그)로 표현 샘플 농도에 대해서 청색 / 녹색 비율로 특정 분석 검량선을 그린다. 기울기, R 2을 계산하고 EC 50 (50 % 영향 농도)를 기록합니다. 교정 파라미터는 표 1에 열거 된 예상 범위 내이어야한다.
  5. 모든 세중 우물의 RSD를 계산합니다. 복제 중 변동성은 20 % 이하이어야한다.
  6. 세포 독성 데이터 (560 예 / 590 엠 ㎚)의 경우, 모든 세포 함유 우물에서 무 세포 제어 평균 (즉, 미디어 배경)를 뺍니다.
  7. 각 샘플의 평균 배경-감산 형광을 계산합니다. DMSO를 제어의 비율로 얻어진 형광 데이터를 플롯. 샘플 희석하지 말아야셀 전용 및 DMSO 대조군에 비해 20 % 이상의 세포 치사율을 나타낸다.

8. 데이터 분석

  1. 최소 교정 응답을 더한 그 응답의 평균의 두 표준 편차로 검출 (LOD)의 분석 한계를 계산합니다.
  2. 투여 량 반응을 나타낸 샘플의 경우, EC (50) 도출   기준 화학적 10 50 % 효과 농도의 보정 곡선의 선형 회귀의 기울기를 이용하여 물 추출물.
  3. / EC 물 샘플의 50 참조 화학 물질의 BEQ = EC 50 : 수식을 사용하여 생체 시료 분석 등가 농도 (BEQ)를 계산합니다.

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결과

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본 연구에서는, 처리시 폐수 유출의 4 배 24 시간 복합 샘플, 남부 캘리포니아에서 담수 시스템의 지표수 6 잡아 샘플 및 초순수로 구성된 필드를 비워는이 프로토콜을 설명하기 위해 선정되었다. 4 유출 물 샘플 3은 기존의 활성 슬러지 폐수 처리 시설 ( "보조 유출"), 모래 / 탄소 여과 추가 후 생물학적 처리 ( "차 유출")와 고급 폐수 처리 공장에서 네 번째로 하였다. 표면 물 샘플 (개방, 농업 및 도시) 다른 토지 이용을 나타내는 유역에서 수집 하였다.

물 추출물의 희석은 DMSO 컨트롤 (표 1)에 비해 관찰 된 20 % 미만의 세포 사망률 명백한 세포 독성을 보이지 않았다. 무 세포 (배지만) 배경이 낮고, 그리고 C셀만 및 DMSO 반응 셀들 사이 omparison 용매는 형광 측정에는 측정 가능한 영향이 없다...

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토론

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이러한 17β-에스트라 디올 (E2), NG /의 L 농도 23, 24에서 이러한 화학 물질에 대한 보증 심사 등의 환경 에스트로겐의 잘 문서화 힘. 본 연구에서는 폐수 유출 물에 대한 ER 응답 (BEQ 범위 : 2.3-17 ng의 E2 / L)이 E2 / L NG 4 0.5 <지표수 (대한 BEQs 반면, 호주 WWTPs 20 차 유출에 대해보고보다 다소 높았다 ) E2 NG 11 / L) (16)에 다른 표면과 우수 (<1에 대해보고 된 범위 내에 있었다. 표면 물 샘플에서 측정 ER 활성의 낮은 수준에도 불구하고,이 분석 물의 품질 평가를위한 중요한 검사 포인트를 나타낸다. 비스페놀 A 및 알킬 페놀 계면 활성제와 같은 에스트로겐은 종종 수생 환경에서 발견되지만, 기존의 분석 화학을 사용하여 정량화하기가 어려울 수 있습니다. 코지마 등의 알 같이 ER-세포 분석은 또한, 현재 및 새로 등록 된 농약의 검사를위한 유용 할 수있다25....

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자금은 주 수자원 관리 위원회(협정 번호 10-096-250 및 14-090-270)에서 제공했습니다. 우리는 S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi 및 J. Printen에게 감사드립니다. 저자는 이해 상충이 없음을 선언하며, 상표명에 대한 언급이 보증을 의미하지는 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GeneBLAzer ER alpha DA 분석 키트ThermoFisherK1393키트에는 ER 분할 체포(DA) 세포와 LiveBLAzer FRET 로딩 키트가 포함되어 있습니다.
GeneBLAzer GR DA 분석 키트ThermoFisherK1391키트에는 GR 분할 체포(DA) 세포와 LiveBLAzer FRET 로딩 키트가 포함되어 있습니다.
PrestoBlue 세포 생존 시약 ThermoFisherA-13261
트리판 블루, PBSSigma-AldrichT8154ThermoFisher에서도 사용 가능
Corning 96-well black wall, clear-bottom plateCorning3603Individual-wrapped, sterile with lid
Whatman 유리 섬유 필터, GF/A, 1.6 µ M시그마-알드리치 
마이크로플레이트 알루미늄 밀봉 필름E& K ScientificT592100
Oasis HLB 6 cc 카트리지, 200 mg 흡착제WatersWAT106202
17β 에스트라디올시그마-알드리치 E2758CAS #50-28-2
아스코르브산Fisher ScientificA61-100Sigma-Aldrich
Dexamethasone에서도 사용 가능 시그마-알드리치 D4902CAS #50-02-2
디메틸 설폭사이드 (DMSO)시그마-알드리치 D8418분자 등급
용매 (아세톤, 헥산, 메탄올)Fisher ScientificHPLC 등급
아지드 나트륨시그마-알드리치;S2002화학 물질은 독성이 강하므로 주의해서 취급해야 합니다. 보호복을 착용하고 흄 후드 아래에서 체중을 측정하십시오. EMD Millipore에서도 사용할 수 있습니다.
자동 세포 계수기 또는 혈구계다양한*공급업체로는 Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich 및 ThermoFisher가 있습니다.
클래스 II 생물 안전 캐비닛다양한*
CO2 인큐베이터다양한*
극저온 냉동고 각종*액체 질소 저장 듀어를 권장합니다. 
형광 마이크로플레이트 리더다양한*  리더에는 하단 읽기 기능이 있어야 합니다.
* 권장 출처 없음, 이 장비의 선택은 예산, 사용 빈도 및 실험실 공간에 따라 다릅니다.
에서 0.4% WHA1820025

참고문헌

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