속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.
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이 논문에서
요약
초록
양이온 선택적 채널의 유전 또는 새로운 돌연변이는 갑작스러운 심장사로 이어질 수 있습니다. 채널 게이팅의 변화 유무에 관계없이 이러한 다중 스패닝 막관통 단백질의 원형질막 이동의 변화는 종종 이 과정에 크게 기여하는 것으로 가정됩니다. 따라서 심장 이온 채널의 상대적인 세포 표면 발현 변화를 대규모로 정량화하는 방법을 개발하는 것이 중요해졌습니다. 본 명세서에서는 2색 형광 세포 분석 분석을 사용하여 tsA-201 세포에서 심장 L형 칼슘 채널 CaV1.2 및 막 관련 소단위체의 상대적 총 및 세포 표면 발현을 결정하기 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 다른 현미경 검사 기반 또는 면역 블로팅 기반 정성적 방법과 비교하여, 유세포 분석 실험은 단일 유동에서 유사한 세포 특성을 가진 살아있는 세포의 대규모 샘플(104 세포에서 106 세포 범위)에서 정량화 가능한 종말점을 제공하는 빠르고 재현 가능한 대용량 분석입니다. 구축물은 세포 내 C-말단에서 mCherry를 구성적으로 발현하고(따라서 총 단백질 발현을 신속하게 평가할 수 있음) anti-HA 형광 접합 항체를 사용하여 막 단백질의 세포 표면 발현을 추정하기 위해 세포 외 대면 헤마글루티닌(HA) 항원결정기를 발현하도록 설계되었습니다. 위음성을 피하기 위해 HA 에피토프의 접근성과 적절한 발현을 확인하기 위해 투과화된 세포에서 실험도 수행했습니다. 세부 절차는 (1) 태그가 지정된 DNA(디옥시리보 핵산) 구축물의 설계, (2) tsA-201 세포에서 구축물의 지질 매개 형질주입, (3) 비투과성 및 투과성 세포의 배양, 수확 및 염색, (4) 형광 신호의 수집 및 분석을 제공합니다. 또한 유세포 분석의 기본 원리를 설명하고 형광단 선택, HA 항체 적정 및 대조군 실험을 포함한 실험 설계에 대해 철저히 논의합니다. 이 특정 접근법은 이온 펌프와 원형질막 수송체를 연구하기 위해 확장할 수 있는 이온 채널의 전체 및 세포 표면 발현에 대한 객관적인 상대적 정량화를 제공합니다.
서론
이 문서는 기존의 유동 세포 계측법 기술을 사용하여 재조합 세포에서 발현 이온 통로와 같은 막 단백질의 상대적인 세포 표면 발현을보고 신뢰성 분석을 제공한다. 이온 채널은 세포막을 가로 지르는 이온의 흐름을 게이팅함으로써 전기 신호를 제어 할 책임이 조공 막 단백질이다. 그들은 활성화 메커니즘, 자연, 그들이 지역화 된 구멍을 통해 환승 이온 종의 선택에 의해 분류된다. 세포 및 조직 수준에서 이온 채널을 통해 거시적 인 이온 플럭스는 생물 물리학 (게이팅 및 침투), 생화학 (인산화) 및 생합성 (합성, 글리코 실화, 인신 매매 및 저하) 특성 (1)의 제품이다. 이러한 프로세스 각각은 이온 채널의 모든 유형에 고유 한 이온 채널의 생리적 역할을 수행하도록 최적화된다. 결과적으로,을 통해 이러한 미세 조정 과정 중 어느 하나의 변경상속 또는 종종 "channelopathy"이라 유전 적 변형은 세포 항상성에 해로울 수있다. 이는 세포 표면에서 이온 채널의 "오른쪽"양을 전달하는 것은 세포의 항상성에 중요한 것을 강조하는 것이 중요하다. 심지어 작은 증가 (기능 획득) 및 이온 채널 활성의 저하가 적은 (기능 상실) 일생 심각한 병리를 유발할 수있다. 성숙한 이온 채널의 세포 표면 전달의 결함은 낭포 성 섬유증 (CFTR 이온 채널) 2 긴 QT 증후....
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프로토콜
1. 이중 태그 DNA 구조
- 사이트 특이 적 변이 (그림 3B) 20 D676 및 R677 사이에 칼슘 V의 α2δ1의 세포 외 링커에서 HA 에피토프 (YPYDVPDYA)를 삽입합니다. 앞으로 프라이머 gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC를 사용하여 프라이머 acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC 역.
- 를 SacI 및 SalI로 위치 (도 3b) (20) 사이 mCherry의 N 말단에 융합 단백질을 발현하도록 설계 포유류 pmCherry-N1 발현 벡터로 태그 HA 칼슘 V의 α2δ1의 cDNA 서열을 서브 클로닝.
주 : 적절한 채널 기능은 표준 전기 생리 학적 방법 (24)을 사용하여 제어 구조에서 테스트되어야한다.
2. 리포솜 매개 과도 형질 (30 분, 모든 단계 층류 후드에서 수행됩니다)
- 1 일 : 플레이트 TSA-201 세포 (또는 HEKT)에서의 50 만이 용액의 베코 높은 글루코스 최소 필수 배지 10 % 소 태아 혈청 (....
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결과
이 문서에서는 분석 세포 계측법 2 색의 흐름에 의해 TSA-201cells로 표현 재조합 이온 채널의 총 세포 표면을 정량화 할 수있는 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 예를 들어, 상대적인 세포 표면 및 총 단백질 발현은 칼슘 V의 α2δ1subunit 대해 정량 하였다. 분석 계측법 2 색 흐름을 수행하기 위해, 칼슘 V의 α2δ1은 이중 항 HA FITC 공액 된 항체 및 항시 형광 세포 mCherry의 형광에 의해 검출 될 수있는 세포 외 비 형광 에피토프 HA를 표현하는 태그로 하였다. FITC와 mCherry의 여기 및 발광 스펙트럼은 FITC는 488 nm의 레이저에 의해 88 %의 효율을 흥분하지만 효율이 561 nm의 레이저를 0 %로 감소 함을 보여줍니다. 561 nm의 레이저하지만 488 nm의 레이저 만 7.6 % (그림 3)과 흥분 때 mCherry가 최대 형광의 63.9.......
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토론
이 유동 세포 계측법 기반 분석은 성공적 전압 게이트 된 칼슘 채널 14,22,26의 조공 - 형광 표지와 연관된 서브 유닛의 상대적 총 세포 표면 수준의 측정에 적용했다. 이것은 유전 적 돌연변이의 영향을 조사 할 때 가장 사용함으로써 표지화 - 형광 태그 야생형 구조체의 내재적 형광 강도는 형광 표지 된 태그가없는 구조의 형광 강도보다 큰 100 배, 적어도 10 인 것이 요구되고 . 이 특정 예에서, 본원에 기재된 mCherry - 칼슘 V의 α2δ1-HA 컨스 잡음비 큰 신호와 이전에 발행 된 칼슘 V 1.2 HA 및 CA V 2.3 HA 구조에 대한 측정보다 더 큰 동적 범위를 수득 하였다. 이 많은 생각할 이유가있다. 이는 추측 할 수있는 칼슘 및 V의 세포 외 도메인의 HA 에피토프의 로컬 환경# 945; 2δ1 단백질은 FITC 접합 항 HA 항체의 신호 대 잡음비를 최대화한다.
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
전문 지식을 공유하고 유세포 분석 및 세포 분류 플랫폼에 대한 액세스 권한을 부여해 주신 Serge Sénéchal과 Jacques Thibodeau 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research)의 운영 보조금 130256, 캐나다 심장 및 뇌졸중 재단(Canadian Heart and Stroke Foundation)의 보조금, 몬트리올 심장 연구소(Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal)의 L.P. 지원으로 완료되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 튜브 1.5 ml | Sarstedt | 72-690-001 | |
| 튜브 15 ml | 사르스테트 | 62-554-002 | |
| 일회용 졸업 Tranfer 피펫 | 폭스바운드 | 160001-192 | |
| 100mm 배양 접시 | Corning | 430167 | HEKT 세포의 표준 배양용. |
| 35mm 배양 접시 | Falcon | 353001 | HEKT 세포의 표준 배양용. |
| 혈청학적 피펫 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| 혈청학적 피펫 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 혈청학적 피펫 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 혈청학적 피펫 25 ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco의 고혈당 매체 | Life Technologies | 12100-046 | Warm in 37 & 도그; C 사용 전 수조. |
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| 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | 리포솜 형질주입용. 인산칼슘 형질주입으로 대체할 수 있습니다. |
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| 1.5 ml 마이크로튜브 | Sarstedt | 72.690.001 | |
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| 항 HA FITC 접합 항체 | Sigma | H7411 | |
| IgG1− FITC 아이소타입 제어 항체 | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션 키트 | BD Biosciences | 554714 | 고정/투과화. 투과화/세척 용액, 4°C에서 보관하십시오. |
| 혈구계 | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | 세포 생존력에 접근합니다. |
| 냉장 마이크로 원심분리기, 5430R | Eppendorf | ||
| Forma Steri-Cycle CO2 인큐베이터 | Fisher | 370 | |
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| 수조 | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | 유세포 분석기. |
| FlowJo 소프트웨어 v10 | FlowJo | FlowJo v10 동글 | 데이터 분석용. |
참고문헌
- Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
- Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defec....
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