방법 논문

여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

DOI:

10.3791/54741

⸱

2016년 11월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

이 논문에서

요약

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필터 카트리지로 물을 여과하고 필터를 제거하기 위해 하우징을 절단하지 않고도 환경 DNA(eDNA)를 추출하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 어류의 eDNA를 메타바코딩하기 위해 개발되었지만 다른 유기체의 eDNA에도 적용할 수 있습니다.

초록

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최근 연구에서는 어류의 환경 DNA(eDNA)를 비침습적 모니터링 도구로 사용하는 것이 적절하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 디스크 섬유 필터를 사용하여 물 샘플에서 eDNA를 수집했지만, 수중 환경에 대한 많은 미생물 연구에서는 카트리지 카트리지를 사용했는데, 그 이유는 카트리지가 많은 양의 물을 수용하고 전반적인 사용 편의성을 가지고 있기 때문입니다. 여기에서는 필터 카트리지를 사용하여 물 샘플을 여과하고 하우징을 절단하지 않고도 필터에서 eDNA를 추출하는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 부분은 1) 물 샘플의 여과 (물의 양 ≤4 L 또는 >4 L)로 구성됩니다. (2) 예열된 인큐베이터에 놓인 롤러 셰이커를 사용하여 필터에서 DNA를 추출하는 단계; 및 (3) 상용 키트를 사용한 DNA 정제. 이 프로토콜과 이전에 사용된 프로토콜을 사용하여 알려진 종 조성으로 거대한 수족관 탱크(7,500m3)에서 채취한 eDNA의 메타바코드 분석을 수행하고 두 프로토콜에서 라이브러리당 검출된 종 수를 대표 결과로 표시합니다. 이 프로토콜은 어류의 eDNA를 메타바코딩하기 위해 개발되었지만 다른 유기체의 eDNA에도 적용할 수 있습니다.

서론

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수생 환경에서 환경 DNA (에드나)는 물 칼럼에서 발견 된 유전 물질을 의미한다. 최근의 연구는, 연못 1-3, 강, 4-8 등 다양한 수생 환경에서 물고기를 검출하는 에드나의 유용성을 입증 9 스트림, 해수 10-14. 최근의 연구는 생선 커뮤니티 7,9에서 여러 종의 동시 검출을 시도하면서 이러한 연구의 대부분은, 3,9 종 단일 또는 소수의 침략 1,4-6,8,14 희귀 또는 위협의 탐지에 초점을 맞춘 12,13,15 및 반 폐쇄 생태계 (11, 12).

후자의 방법은 "metabarcoding"라고하며 에드나의 metabarcoding은 분류 학적으로 다양한 샘플에서 유전자 영역을 coamplify하는 PCR 프라이머의 하나 또는 여러 개의 세트를 사용합니다. 이것은 인덱싱 및 어댑터 첨가 라이브러리를 제조 하였다되고 인덱싱 라이브러리는 높은 처리량 병렬 염기 서열 분석플랫폼. 최근 미야 등. (12) ( "MiFish"라고합니다) 물고기에서 에드나를 metabarcoding에 대한 보편적 인 PCR 프라이머를 개발했다. MiFish 프라이머는 분류 학적 가족, 속 일부 밀접하게 관련 동족체를 제외하고 종 물고기를 식별하는 데 충분한 정보가 들어있는 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 (163-185 BP)의 가변 영역을 대상으로. 에드나의 metabarcoding에서와 프라이머를 사용하여, 미야 등. (12)는 수족관 근처 알려진 종 조성과 산호초 수족관 탱크에서 230 개 이상의 아열대 해양 종을 발견했습니다.

metabarcoding 프로토콜을 최적화하는 물고기에서 에드나 농도 다양한 수준의 천연 해수를 수용 할 수 있지만, 우리는 MiFish 프라이머 가끔 후속 라이브러리 준비를위한 대상 영역을 증폭하지 못한 것으로 나타났습니다. 이 실패한 PCR 증폭 용 가능성 이유 중 하나는 TE 충분한 양의 부족여과 물 소량에 포함 mplate DNA (즉, 1-2 L). 특정 분류 학적 그룹에서 에드나 농도가 큰 물 볼륨 (> 1-2 L)의 여과가 증폭되기 전에 알 수없는하지만 것 희귀 물고기의 풍부한 바이오 매스, 같은과 수생 환경에서 더 많은 에드나를 수집 할 수있는 간단하고 효과적인 수단이 될 오픈 바다와 심해 생태계.

디스크 섬유 필터에 대하여 종래에 물고기 에드나 연구 (16)의 수에 사용 된 필터 카트리지 (17)를 폐색하기 전에 물 큰 볼륨을 수용하는 장점을 갖는다. 사실, 최근의 연구는 많은 양의 (> 20 L) 필터 카트리지 (18)를 사용하여 연안 해수 시료의 여과를 보였다. 또한, 이들은 개별 포장 및 멸균하여 실험 워크 플로우의 여러 단계가 이에 해당 기관 (19)로부터의 오염 가능성을 감소시키는 필터 하우징에서 수행 될 수있다. 후자의기능은 가장 큰 실험은 20, 21에 도전 중있는 오염의 위험이 남아 에드나의 metabarcoding 중요합니다. 필터 카트리지의 이러한 기술적 장점에도 불구하고, 그것은 두 가지 예외 8,15와 물고기 에드나 연구에 사용되지 않았다.

여기에서 우리는 주택을 열 절단 할 필요없이 필터에서 에드나의 필터 카트리지 및 추출 물 샘플의 여과를위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 물 볼륨 (≤4의 L 또는> 4 L)에 따라 두 가지 대체 물 ​​여과 시스템을 제공합니다. 새로 개발 된 프로토콜의 성능과 우리의 연구 그룹 12,14,22,23에서 유리 섬유 필터를 사용하여 이전에 사용되는 프로토콜을 비교하기 위해, 우리는 에드나는 거대한 수족관 탱크에서 해수의 분석을 metabarcoding 실시합니다 (7,500m 3 ) 알려진 종 조성물과 대표적인 결과로서 두 프로토콜로부터 유도 검출 종의 수를 나타낸다. 이 프로토콜의 시간으로는 물고기에서 에드나를 metabarcoding 위해 개발하지만, 다른 생물체에서 에드나에도 적용되었다.

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프로토콜

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참고 :이 프로토콜은 물 샘플링 및 metabarcoding 방법과 거래를하지 않습니다. 물은 연구 목적 (16)에 따라 다른 방식으로 샘플링 볼 미야 등. (12) MiFish 프라이머를 사용하여 metabarcoding 방법에 대한 자세한 내용은 될 수있다. 샘플링 된 물이 매우 추운 유지와 에드나의 저하를 방지하기 위해 몇 시간 내에 필터링해야합니다. 또한,이 프로토콜은 회전 진탕 배양기와의 사용을 포함 유의, 후자는 전자를 수용 할만큼 충분히 커야한다. 또한, 원심 분리기는 원추형 튜브 후 여과 필터에 남아있는 액체를 제거하고, 각각의 카트리지 내에서 추출 된 DNA를 수집 불가결 모두 15 mL 및 50 mL로 수용 할 수있다.

1. 스크류 캡과 1 L 플라스틱 가방 처리

참고 : 여과 볼륨> 4 L. 경우이 단계를 건너 뛰

  1. 나사 (C)의 중앙에 구멍을 뚫는다수형 루어 락 커넥터로부터 돌출 관과 동일한 직경 (4.8 mm)와 AP (L 1 회용 비닐 봉투에 부착). 대각선 집게를 사용하여 여과 한 후, 캡의 내부에 소량의 물 막힘을 방지하기 위하여 적절한 길이 (CA. 3mm)에 수형 루어 락 커넥터 튜브를 짧게.
  2. 각각 수형 루어 락 커넥터의 바닥면 모두에 폴리에틸렌 (PE), 폴리 프로필렌 (PP)에 특화된 접착제 접착제를 적용하고 캡 스크류. 좋은 접착을위한 몇 분 (제조업체의 지침을 참조) 기다립니다.
  3. 스크류 캡의 구멍에 남성 루어 잠금 커넥터를 삽입합니다. 두 부분 (보통> 24 시간)을 완벽하게 접착 될 때까지 기다립니다. 사용하기 전에 10 % 상업 표백제 (캘리포니아. 0.6 %의 차아 염소산 나트륨)와 남성 루어 잠금 커넥터와 스크류 캡을 소독.
  4. MES에서 걸어하기 위해 1 L 플라스틱 가방의 두 하단 모서리에 두 개의 구멍 펀치시간 패널 (3 단계). 구멍의 직경은 메쉬 패널 프롱보다 크다는 것을 보장한다.

여과 시스템 2. 총회

  1. 흡인기 펌프의 입력 커넥터에 높은 진공 튜브를 연결하고 매니 폴드에 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 매니 폴드의 3 개의 빨간색 T- 밸브가 "오프 위치"(즉, 수평)에 있는지 확인하십시오.
  2. 장갑 클린 세트 착용 각각 피팅 암형 루어를 삽입하고 여과 진공 고무 튜브의 상부 및 하부 단부에서 진공 커넥터.
  3. 조심스럽게 필터 카트리지의 배출구 피팅 암형 루어 연결 및 실리콘 마개로 진공 커넥터를 연결.

필터 카트리지를 사용하여 물 샘플 (≤4 L)의 3 여과

참고 : 여과 볼륨> 4 L.이 여과 시스템의 경우이 단계를 건너 뛰 자체 서 패널 F가 필요합니다또는 물 1 L로 가득 비닐 봉지에 매달려. 메쉬 패널, 여러 갈래 및 패널 용 스탠드, 온라인 상점에서 사용할 수있는 모든이 장치를 조립하는 데 유용 할 것이다. 입구를 압력솥 사용하기 전에 필터 카트리지 루어 캡을 출구.

  1. 비닐 봉지에 1 L 샘플링 물을 붓고 남성 루어 잠금 커넥터 나사 뚜껑을 닫습니다.
  2. 조심스럽게 비닐 봉투의 수형 루어 락 커넥터에 조립 된 필터 카트리지의 입구 포트에 연결한다. 루어 잠금 커넥터를 과도하게 조이지 마십시오; 펌핑이 시작되면 그렇지 않으면 기기가 누출됩니다. 모든 연결이 메쉬 패널에서 비닐 봉투를 끊기 전에 안전한지 확인하십시오.
  3. 조심스럽게 메쉬 패널 개의 프롱으로부터 필터 카트리지와 비닐 백을 중단하고, 매니 폴드의 유입구로 실리콘 마개를 삽입한다.
  4. 흡입기를 켭니다. 여과를 위해 빨간색 - 밸브를 엽니 다. 필터 카트리지가 건조 될 때까지 t, 매니 폴드를 실행암탉은 오프 위치로 빨간색 - 밸브를 켭니다.
  5. 물을 원하는 금액을 여과 될 때까지 3.1-3.4 단계를 반복합니다.
    참고 : 아열대 산호초에서 가져온 물 1 L를 들어,이 여과 약 3 분 소요됩니다.
  6. 조심스럽게 비닐 봉지와 진공 커넥터에서 필터 카트리지를 제거합니다.
  7. 입구 및 출구 루어 캡 카트리지의 양쪽 끝을 모자.
  8. 적절하게 빠른 건조 및 비 도포 라벨에 대한 용매 증거 펜을 사용하여 카트리지 입구 루어 캡 레이블.
  9. DNA 추출하기 전에 -20 ℃에서 필터 카트리지를 저장합니다.

물 4. 여과 (> 4 L) 필터 카트리지를 사용하여 샘플

참고 : 물 여과 볼륨 L.이 여과 시스템은 밸브와 일회용 10 ml를 피펫 팁이 장착 된 10 L 책 병을 필요로 ≤4 경우이 단계를 건너 뜁니다. 10 ml의 피펫 팁 (15.0 mm)의 내경과 선단의 테이퍼끝은 각각 필터 카트리지의 상기 밸브 (15.0 mm)의 외경과 입구 포트에 적합해야한다. 두 연결은 마찰에 맞는에서 여과하는 동안 안전하게 유지됩니다. 사용 전에 10 %의 상업용 표백제 (약 0.6 %의 차아 염소산 나트륨)가있는 피펫 팁을 소독.

  1. 북 병에 샘플링을 적당량의 물을 준비한다. 단단히 10 L 책 병의 밸브에 10 ml를 피펫 팁을 삽입합니다.
  2. 단단히 피펫 팁 단부에 필터 카트리지의 출구를 삽입하고, 매니 폴드의 유입구로 실리콘 마개를 삽입한다. 흡입기를 켭니다. 여과를 위해 빨간색 - 밸브를 엽니 다. 필터 카트리지가 건조 될 때까지 매니 폴드를 실행 한 후 오프 위치로 빨간색 - 밸브를 켭니다.
    참고 : 아열대 외부 산호초에서 가져온 해수의 10 L를 들어,이 여과 약 30 ~ 40 분 소요됩니다.
  3. 조심스럽게 비닐 봉지와 진공 커넥터에서 필터 카트리지를 제거합니다. 모자 모두입구와 출구 루어 모자와 카트리지의 끝납니다. 적절하게 빠른 건조 및 비 도포 라벨에 대한 용매 증거 펜을 사용하여 카트리지 입구 루어 캡 레이블. DNA 추출하기 전에 -20 ℃에서 필터 카트리지를 저장한다.

필터에서 에드나 5. 추출

참고 : 4 단계와 5 단계에서 우리는 크게 키트에서 제공하는 "핵 피"에 대한 프로토콜 다음, 상용 키트를 사용합니다. 단순성을 위해, 우리는 개별 카트리지를 처리하기위한 절차를 설명한다. 실제로, 우리는 한 번에 8 공정 (또는 원심 분리기의 최대 수) 이하의 필터를 추천한다.

  1. 56 ° C에서 인큐베이터를 예열.
  2. 튜브에서 힌지 캡을 절단하여 2.0 ML 튜브를 준비합니다. 뚜껑을 폐기하십시오.
    참고 :이 튜브는 필터에 남아있는 액체 수집 관으로 사용됩니다.
  3. 필터 카트리지의 입구 (NOT 출구) 루어 캡을 제거하고, 입구 포트 나 삽입포집 관 NTO. 밀접 자기 접착 필름을 이용하여 카트리지와 수집 튜브 사이의 연결을 밀봉.
  4. 15 ML 원뿔 튜브 원심 분리기 어댑터에 결합 된 장치를 삽입합니다. 필터에 남아있는 액체를 제거하기 위해 1 분 동안 5,000 XG에서 카트리지를 원심 분리기.
  5. 필터 카트리지로부터 포집 관을 제거하고 관 버린다. 다시 캡 카트리지의 입구.
  6. (그렇지 키트에서 제공하는 인산염 완충 생리 식염수) 및 200 μl의 AL 버퍼 20 ㎕의 단백질 분해 효소-K 용액의 혼합물 220 μl의 PBS를 준비합니다.
    참고 : 필터 카트리지 혼합물을 4 배 볼륨을 수용 (. CA 1.8 ㎖).
  7. 입구 캡을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 필터 카트리지에 혼합물 (440 μL)를 추가합니다. 피펫 팁 그냥 막 위의 카트리지 내부 볼 수 있도록 입구 포트에 완전히 피펫을 삽입합니다.
  8. 캡 재 유입 포트와 필터 차 배치회전 진탕에 카트리지.
  9. 56 ℃에서 예열 된 인큐베이터에서 회전 진탕를 놓고 20 분 동안 20 rpm의 속도로 통 켭니다.
  10. 배양하는 동안, 새로운 2.0 ML 튜브를 준비 적절한 용매 방지 펜을 사용하여 튜브 라벨과 50 ML 원뿔 튜브에 넣습니다.
    주 : 전 (2.0 mL) 및 후자의 튜브 (50 ㎖) 추출 DNA의 컬렉션에 대해 각각 2.0 ㎖의 튜브를 유지하기 위해 사용된다.
  11. 배양 후, 입구 캡을 제거하고 50 ML 원뿔 튜브 내에서 2.0 ML 튜브로 (출구 NOT) 카트리지의 포트 입구를 삽입합니다. 스크류 캡으로 50 ml의 원뿔 관을 닫습니다.
  12. 1 분 카트리지에서 추출 된 DNA를 수집하기 위해 5,000 XG에 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. 필터 카트리지 멸균 집게를 사용하여 2.0 ㎖의 튜브를 제거하고 튜브 캡. 필터 카트리지를 폐기하십시오.

추출 된 DNA의 6 정화

참고 : 우리는 100 μL 버퍼 AE 대신 상업 키트의 설명서에 지정된 200 μL와 에드나을 용출.

  1. 상기 단계 (약 440 μL)에서 2.0 ML 튜브에서 추출 된 DNA에 200 ㎕의 에탄올 (96~100%)를 추가하고 텍싱에 의해 철저하게 섞는다.
  2. 피펫 2 ml의 수집 튜브에 넣고 스핀 열에 혼합물. 1 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오.
  3. 새로운 2 ㎖의 포집 관에서 스핀 컬럼을 놓고 5,000 x g에서 1 분 동안 500 ㎕의 버퍼 AW1, 원심 분리기를 추가합니다. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오.
  4. g, 새로운 2 ㎖의 포집 관에서 스핀 컬럼을 놓고 X 2 만에서 3 분 동안 500 ㎕의 버퍼 AW2, 원심 분리기를 추가합니다. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오.
  5. (안 키트에서 제공) 새로운 1.5 ML 튜브를 준비하고 적절하게 빠른 건조 및 라벨을 비 도포를위한 방수 펜을 사용하여 튜브 라벨. 스핀 열 t 이동1.5 ML 튜브 오.
  6. 스핀 컬럼 막 중심에 100 ㎕의 완충액 AE를 첨가하여 DNA를 용출시킨다. 실온에서 1 분 동안 배양 한 후 1 분 동안 6000 × g으로 원심 분리기.
  7. 스핀 열을 취소하고 튜브를 모자. -20 ° C에서 정제 된 DNA를 저장합니다.

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결과

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그것은 MiFish 프라이머는 조류와 포유류와 같은 일부 비 물고기 척추 동물에서 대상 지역을 coamplify 때문에 같은 크기의 PCR 제품, 분리 및 추출 된 대량 에드나 만 물고기 에드나를 정량화하는 것은 기술적으로 어렵다 (캘리포니아. 170 bp의 ) 12. 대신 물고기 에드나를 정량화, 우리는 여과 및 DNA 추출의 두 가지 방법을 사용하여 알려진 종 구성 수족관 탱크에서 에드나의 분석을 metabarcoding MiFish을 수행하고,이 프로토콜에서 라이브러리 당 검출 된 종의 수를 비교합니다. 이 간단한 실험은 엄격하게 다른 사람을 통해 그 우수성을 보여주기 위해 "대표적인 결과"가 아니라 같은 본 프로토콜의 가능성을 보여주기 위해 설계되었습니다.

우리는 오키나와 츄라 우미 수족관, 오키나와...

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토론

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물, 토양 등의 환경 시료를 사용하여 많은 metabarcoding 연구를 다음과 같이, 필터 카트리지의 후 여과 처리는 일반적으로 24, 25 : 1)로 개방 절단 또는 손 도구 (튜브 커터 치)와 하우징 분해; 2) 필터 카트리지에서 제거; 3) DNA 추출을위한 면도날 작은 조각으로 절단 필터. 널리 사용되는 저가의 상용 키트를 사용하여 필터 카트리지의 하우징 내에 이러한 귀찮고 시간 소모적 인 실험실 오염되기 쉽다 절차 우리 시도 여러 DNA 추출 방법을 피하고 성공적 양호하여 본 프로토콜 개발하려면 에드나 metabarcoding 분석 결과 (그림 1).

본 프로토콜에서 더욱 중요한 단계 중 하나는 예열 된 인큐베이터에서 회전 진탕의 사용이다, 그 이후의 라이브러리 위해 준비 할 좋은 DNA 수율을 제공 할 수있다에드나 metabarcoding 분석 ATION. 최적의 온도에서 주택 내의 단백질 분해 효소-K 솔루션의...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 일본과학기술개발기구(JST)의 CREST와 JSPS/MEXT KAKENHI(번호 26291083) 및 Canon Foundation의 M.M. 보조금으로 기초 연구의 지원을 받았습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 어떠한 역할도 하지 않았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
메쉬 패널Iris OhyamaMPP-3060-BE
금속 단자Iris OhyamaMR12F
메쉬 패널용 스탠드없음4184-9507아마존 재팬에서 사용 가능
나사 캡이 있는 1L 비닐 봉지YanagiDP16-TN1000
수 루어락 커넥터ISIS11620
10ml 피펫 팁Eppendorf0030 000.765
10 L 책 병밸브 As One1-2169-01
Sterivex-HV 필터MilliporeSVHVL10RCms 동안 "필터 카트리지"로 표시되며 프로토콜에서 사용됩니다.
남성 루어 피팅As One1-7379-04
여성 루어 피팅As One5-1043-14   
인레트 luer capISISVRMP6
출구 luer capISISVRFP6
고진공 튜빙As One6-590-01
진공 커넥터As One6-663-02
실리콘 스토퍼As One1-7650-07
매니폴드As One2-258-01
흡인기-GAS-1As One1-7483-21
DNeasy 혈액 & 티슈 키트 (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex DNA 분리 키트MO BIO14600-50-NF
ms 탁상용 원심분리기Kubota모델 4000최대 속도 6,000 rpm
고정각 로터KubotaAT-508C
15ml 원추형 튜브용 어댑터Kubota055-1280
RNAlater 안정화 솔루션Thermo Fisher ScientificAM7020
파라필름PM992"자체 밀봉 필름"으로 표시됩니다.
브랜드 는

참고문헌

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