형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

요약

형광 상관 분광법(FCS)을 사용하여 일차 면역 세포의 막에서 단백질 확산을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 논문에서는 형광 표지를 위한 항체의 사용에 대해 설명합니다.

초록

형광 상관 분광법 (FCS)은 높은 시공간 해상도 생체막 내 분자의 확산을 연구하는 강력한 기술이다. FCS는 세포막에서 형광 표지 된 분자의 분자 확산 계수 및 농도를 정량화 할 수있다. 이 기술은 (실제 측정 시간 동안의 결과에 영향을 미치는 일없이, IE) 정상 상태가 면역 세포의 세포막 분자의 분자 확산 특성을 조사하는 기능을 갖는다. FCS는 대부분의 내인성 단백질의 전형적인 수준으로 발현되는 단백질의 확산을 연구하는데 적합하다. 여기서, 차 림프구의 세포막 단백질의 확산 속도를 결정하기위한 간단하고 강력한 방법이 설명된다. 항체 염색 생균 및 수집 한 후 통상적으로 발생 관측에 대한 측정을 수행하는 효과적인 방법을 설명한다. 최근 발전광 안정 형광 염료의 개발에 광범위 측정 동안 표백하지 염료 적절한 관심 항체 컨쥬 게이트가 이용 될 수있다. 또한이 세포막에 발현 된 단백질의 공통 특징이다 천천히 확산 엔티티의 검출을 허용한다. 생성 된 자기 상관 곡선에서 분자 농도와 확산 매개 변수를 추출하는 분석 절차가 강조 표시됩니다. 요약하면, FCS 측정을위한 기본 프로토콜이 제공된다; 그것은 공 초점 현미경의 이해되지만, 분자 확산 속도와 같은 동적 매개 변수를 측정하기위한 기술의 다른 이전의 경험과 면역 학자 다음에 할 수 있습니다.

서론

많은 면역 세포의 기능을 분자 확산과 세포막 내에서의 상호 작용에 의존한다. 생체막들은 복잡하고, 세포막 단백질의 ^하나에서 병진 확산 속도에 영향을 미칠 수있는 면역 세포의 기능에 중요 할 수있는 많은 요소. 최근 선천성 면역계에 속하는 자연 살해 (NK) 세포, 림프구, NK 세포 활성화 ^(2)의 상태에 따라 세포막 단백질 두 연구의 차동 확산을 나타내는 것으로 나타났다.

형광 상관 분광법 (FCS)는 생체막 내의 분자 확산 속도를 정량화 할 수있는 기술이다. 그것은의 찬란 고정 볼륨 분자 표지의 평균 확산 속도, 공 초점 현미경의 일반적으로 초점을보고합니다. 그것은 분자 운동에 따라 발생하는 형광의 변동의 측정에 기초정상 상태에서의 시스템. FCS 널리 용액과 지질막 내에 두 형광 염료 및 단백질의 확산을 연구에 사용되었다. 확산 속도에 영향을 미치는 다른 출력 매개 변수는 또한 간접적 방식으로 조사 할 수있다 (예를 들어, 단백질이나 세포막의 분자의 상호 작용의 구조적 변화) ^{(3, 4).} FCS는 단일 분자 검출에 대한 가능성을....

프로토콜

FCS 1. 염색

1. 제조사의 프로토콜에 따라 ^16, 마그네틱 비드 레이블링하여 비장 림프구에서 쥐과 NK 세포를 분리. 다음 단계는 샘플 당 2-3 × 10 ⁵ 세포를 사용합니다.
   참고 : 세포가 혼자 차 항체를 사용하여 표시 할 수 있도록 그대로를 떠나, 목표 세포 인구를 풍부하게 부정적인 선택을 사용합니다. 마우스 ^2에서 세포 분리에 대한 자세한 내용은 참고 ^2를 참조하십시오.
2. Fc 수용체를 발현하는 쥐 세포, 인산염 완충 식염수 (PBS) 및 샘플 당 1 % 소 태아 혈청 (FBS), 25 μl의 5 μg의 / μL의 항체 클론 2.4G2와 Fc 수용체를 차단. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
3. 항체 혼합물의 제조.
   1. 사용 된 항체는 직접 광 안정 형광 접합. 만약 두 개의 서로 다른 단백질에 대한 두 개의 항체(예, 488 및 633 레이저 ^(2)에 의해 여기되어, 나중 프로토콜 각각 "녹색"및 "빨간색"레이저 및 형광이라 크로스 토크를 최소화하기 위해 잘 분리 된 방출 ....

결과

전형적인 결과는 막 단백질 400 밀리 초 내지 10 밀리 초 범위의 통과 시간과 자기 상관 곡선을 생성한다. 분자의 수는 내생 적으로 발현 된 단백질에 대한 약 200 μm의 ² 당 0.5 사이에 다를 수 있습니다. 노출 당 비용이 예상보다 낮지 것을주의 깊게 확인합니다. 이것은 백그라운드 신호의 영향이 있다는 것을 의미 할 수있다. 엄지 손가락의 규칙으로 분석을 받아 들여 세포의 CPM 신호 자유롭게 동일한 레이저 파워에 항체를 확산하기위한 CPM의보다 낮은 33 % 이하이어야한다. CPM은 레이저 파워에 따라 선형으로 확장한다. 주요 면역 세포 표면 수용체에 대한 자기 상관 곡선은 0.001 내지 1 초 사이의 가파른 부분 매끄러운 것으로 예상된다. 대표적인 자기 상관 곡선과의 시간 추적 그림 2를 참조하십시오.

토론

FCS이 프로토콜은 면역 세포 (뮤린, 인간 또는 다른 종) 모든 유형의 표면 분자의 분자 동력학 평가를 위해 사용될 수있다. 아래 살아있는 세포의 단일 분자 해상도 FCS 조치 시공간 분자 역학. 분자 밀도뿐만 아니라, 관심있는 단백질의 확산 속도 및 클러스터링 역학은 자기 상관 곡선으로부터 추출 될 수있다.

형광 라벨에 성공 FCS 실험에 대한 중요한 중요하다. 세포막에 관심이 단백질은 전통적으로 항체를 사용하여 라벨이되었고, 항체는 종종 순진 면역 세포의 표면 단백질에 사용하기에 가장 편리합니다. 레이블이없는 항체는 직접 고분자 밝기로 사진을 안정 형광 염료를 결합해야합니다. 항체 결합에 대한 형광의 선택은 측정들의 품질에 중요하다. 유동 세포 계측법에 대한 표준 라벨,이러한 형광 및 피코 에리 트린 기반의 염료로 인해 빠른 표백에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 항체에 직접 접합을위한 사진 안정 염료는 현재 여러 회사에 의해 제공됩니다. 제조자는 일반적으로 결합하고, 생.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MACS NK 세포 분리 키트 마우스 II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	NK 세포의 음성 선택
태아 소 혈청	Sigma-Adlrich	F7524	열 비활성화
인산염 완충 식염수	-	-	집에서 제조
로스웰 파크 기념 연구소 매체 1640	PAA 세포 배양 회사	E15-848	투명 매체
항체 클론 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Fc 수용체 차단용.
Anti-Ly49A 항체			집에서 만든 단클론 항체를 Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd 항체	BD Pharmingen	558915	MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	형광 염료
-L-라이신	시그마-알드리치	P8920	증류수(1.10)에 희석,
폴리-L-라이신(20kDa), 폴리에틸렌 글리콜(2kDa)과 접목	SuSoS, AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	PBS(pH 7.4)에서 0.5mg/ml로 희석.
Rhodamine 110 염화물	Sigma-Aldrich	432202	알려진 확산 계수 : 3.3 × 10− 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	알려진 확산 계수 : 4.4 × 10− 10 m2/sec 20
컨포칼 현미경	Zeiss	LSM510
소프트웨어: Confocor 3	Zeiss
소프트웨어: 곡선 피팅 툴박스가 있는 Matlab		버전 R2013b
Nunc Lab-Tek 챔버 커버글라스	Thermo-scientific	155411	8웰, 바닥 1.0 붕규산

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