형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

요약

형광 상관 분광법(FCS)을 사용하여 일차 면역 세포의 막에서 단백질 확산을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 논문에서는 형광 표지를 위한 항체의 사용에 대해 설명합니다.

초록

형광 상관 분광법 (FCS)은 높은 시공간 해상도 생체막 내 분자의 확산을 연구하는 강력한 기술이다. FCS는 세포막에서 형광 표지 된 분자의 분자 확산 계수 및 농도를 정량화 할 수있다. 이 기술은 (실제 측정 시간 동안의 결과에 영향을 미치는 일없이, IE) 정상 상태가 면역 세포의 세포막 분자의 분자 확산 특성을 조사하는 기능을 갖는다. FCS는 대부분의 내인성 단백질의 전형적인 수준으로 발현되는 단백질의 확산을 연구하는데 적합하다. 여기서, 차 림프구의 세포막 단백질의 확산 속도를 결정하기위한 간단하고 강력한 방법이 설명된다. 항체 염색 생균 및 수집 한 후 통상적으로 발생 관측에 대한 측정을 수행하는 효과적인 방법을 설명한다. 최근 발전광 안정 형광 염료의 개발에 광범위 측정 동안 표백하지 염료 적절한 관심 항체 컨쥬 게이트가 이용 될 수있다. 또한이 세포막에 발현 된 단백질의 공통 특징이다 천천히 확산 엔티티의 검출을 허용한다. 생성 된 자기 상관 곡선에서 분자 농도와 확산 매개 변수를 추출하는 분석 절차가 강조 표시됩니다. 요약하면, FCS 측정을위한 기본 프로토콜이 제공된다; 그것은 공 초점 현미경의 이해되지만, 분자 확산 속도와 같은 동적 매개 변수를 측정하기위한 기술의 다른 이전의 경험과 면역 학자 다음에 할 수 있습니다.

서론

많은 면역 세포의 기능을 분자 확산과 세포막 내에서의 상호 작용에 의존한다. 생체막들은 복잡하고, 세포막 단백질의 ^하나에서 병진 확산 속도에 영향을 미칠 수있는 면역 세포의 기능에 중요 할 수있는 많은 요소. 최근 선천성 면역계에 속하는 자연 살해 (NK) 세포, 림프구, NK 세포 활성화 ^(2)의 상태에 따라 세포막 단백질 두 연구의 차동 확산을 나타내는 것으로 나타났다.

형광 상관 분광법 (FCS)는 생체막 내의 분자 확산 속도를 정량화 할 수있는 기술이다. 그것은의 찬란 고정 볼륨 분자 표지의 평균 확산 속도, 공 초점 현미경의 일반적으로 초점을보고합니다. 그것은 분자 운동에 따라 발생하는 형광의 변동의 측정에 기초정상 상태에서의 시스템. FCS 널리 용액과 지질막 내에 두 형광 염료 및 단백질의 확산을 연구에 사용되었다. 확산 속도에 영향을 미치는 다른 출력 매개 변수는 또한 간접적 방식으로 조사 할 수있다 (예를 들어, 단백질이나 세포막의 분자의 상호 작용의 구조적 변화) ^{(3, 4).} FCS는 단일 분자 검출에 대한 가능성을 허용하는 높은 민감도로 인해, 다른 방법에 비하여 우수하다. 그것은 대부분의 단백질 ^5의 내생 발현 수준에 대한 전형적인 밀리몰 범위로 나노 몰, 분자의 농도에 적합합니다. 다른 대부분의 기술들은 단지 단백질 발현 수준에 대한 상대적 정보를 제공하면서 또한, FCS는 연구 볼륨 내의 단백질의 절대 값의 근사치를 제공 할 수있다. 막은 FLUO 포함 내의 다른 방법은 분자의 확산 속도를 측정(FRAP)을 photobleaching에 후 rescence 복구, 단일 입자 추적 (SPT), 다수의 핀홀 FCS 및 이미지의 상관 관계 방법. FRAP 및 이미지의 상관 관계 방법은 일반적으로 분자 ^(10)의 절대 수에 대한 정보를 제공하지 않는 앙상블 기법이다. SPT에 비해, FCS의 처리량은 모집단 평균의 특성에 관해서 높다. 레이저 초점 내에 존재하는 분자의 평균 확산 속도가 아니라 단일 분자의 속도보다, 측정 이후 분석은 덜 요구된다. 전문 현미경 ^(11)을 사용할 수 있습니다하지 않는 한 표준 SPT 라벨은 단일 분자의 식별을 허용하는 것은 매우 낮아야 때문에, SPT는 농도에 대한 정보를 제공 할 수 없습니다. 한편, FCS는 연구중인 분자가 이동되어야합니다. 그것은 단순히 매우 느리게 이동하는 추정 움직이지 분수 또는 분자를 감지하지 않습니다. 분자의 확산 속도 즉긴 획득 시간의 약 1/10 FCS 정확하게 측정 ^{(3) (12)에} 표시되지 않을 것보다 초점 내에 상주. 따라서, FCS에 의해 기록 된 확산 계수는에-움직이지-가까운 매우 느린 분수는뿐만 아니라 고려 FRAP와 SPT, 같은 기술에서보고 된 확산 속도보다 빠른 경향이있다. SPT는 것보다 FCS 분자 집단 내에서의 확산 률의 변동에 대한 상세한 설명을 제공 할 것이다.

FCS는 흥분 볼륨 내의 시간에 따른 형광 강도의 변동을 정량화한다. 멤브레인의 측정의 경우, 이는 멤브레인의 조명 영역으로 변환한다. 이 논문은 이러한 변동 브라운 확산을 나타내는 분자에 의해 유도되고, 따라서, 및 여진 부피 밖으로 이동된다는 사실을 이용한다. fluctua에 대한 몇 가지 다른 가능한 소스가있다이러한 바인딩 바인딩 해제 전체 세포막의 리간드, 또는 이동의 점멸 또는 형광, 환경 영향의 삼중 상태의 존재와 형광 신호 TIONS. 이러한 추정 에러 소스는 정확한 결과 ^{(12, 13)을} 해석하기 위하여 FCS 내의 실험을 설계 할 때 고려 될 필요가있다. 일반적으로 생물 세포막의 측면 확산 속도는 막 단백질 사이 단백질과 세포 골격 사이에 모두 밀집과의 상호 작용에 의한 낮다. 역사적으로, 멤브레인의 FCS의 사용, 따라서 여기 포커스 ^(14)를 통해 연장 된 전이 시간 동안 탈색을 방지하기 위해 필요한 광 안정 형광체의 부족에 의해 방해되어왔다. 그러나 오늘, 적합한 사진 안정 염료에 대한 많은 옵션이 있습니다. 감지기 및 기타 하드웨어 크게 향상 또한 형광 보호 자전거의 검출을 허용기능과 낮은 밝기의 염료. 여기서, 항체 태그 관심 단백질은 형광 물질로 표지되어 뮤린 차 림프구를 사용하여 FCS의 응용 프로그램을위한 기본 프로토콜이 설명된다. 확산 계수는 분자 밀도를 추출하기 위해 자기 상관 곡선 맞도록 접근법은 또한 도시되어있다. 프로토콜은 쉽게 분자의 확산을 연구하는 기술 된 이전의 경험 면역학 다음되는 것을 목적으로한다. 그러나, 공 초점 현미경의 기본 이해가 예상된다 (참조 ⁽¹⁵⁾ 참조 기본적인 이해를 위해). 이 프로토콜은 비교적 용이 다른 현탁 세포 세포주 및 일차 전지 모두 적용될 수있다. 숙련 된 FCS 사용자를 위해 더 정제 된 분석 방법 중 일부는 논의에 기술되어 존재한다.

프로토콜

FCS 1. 염색

1. 제조사의 프로토콜에 따라 ^16, 마그네틱 비드 레이블링하여 비장 림프구에서 쥐과 NK 세포를 분리. 다음 단계는 샘플 당 2-3 × 10 ⁵ 세포를 사용합니다.
   참고 : 세포가 혼자 차 항체를 사용하여 표시 할 수 있도록 그대로를 떠나, 목표 세포 인구를 풍부하게 부정적인 선택을 사용합니다. 마우스 ^2에서 세포 분리에 대한 자세한 내용은 참고 ^2를 참조하십시오.
2. Fc 수용체를 발현하는 쥐 세포, 인산염 완충 식염수 (PBS) 및 샘플 당 1 % 소 태아 혈청 (FBS), 25 μl의 5 μg의 / μL의 항체 클론 2.4G2와 Fc 수용체를 차단. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
3. 항체 혼합물의 제조.
   1. 사용 된 항체는 직접 광 안정 형광 접합. 만약 두 개의 서로 다른 단백질에 대한 두 개의 항체(예, 488 및 633 레이저 ^(2)에 의해 여기되어, 나중 프로토콜 각각 "녹색"및 "빨간색"레이저 및 형광이라 크로스 토크를 최소화하기 위해 잘 분리 된 방출 스펙트럼을 사용 사용 형광체는 ).
      참고 : 사진 안정 형광으로 표지 된 상업 항체가 선택한 바이오 마커에 사용할 수없는 경우, 형광에 공액 레이블이없는 항체는 제조업체의 지침에 따라. 본 연구에 사용 된 항체에 대한 자료 표를 참조하십시오.
   2. 단백질 또는 PBS + 1 % FBS에 대한 관심의 단백질에 대한 형광 표지 된 항체를 희석하여 항체 혼합물을 준비합니다. 샘플 당 50 μl의 최종 볼륨에 각 샘플에 항체 믹스를 추가합니다. 어둠 속에서 45 분 동안 얼음에 품어.
      주 : 항체가 포화 농도로 사용되는 것을 보장하기 위해 사전에 항체의 농도를 최적화 일반적1 ~ 10 μg의 / ㎖.
4. 배양 후, PBS 250 μl를 첨가하여 세포를 세척하고 3 분 동안 150 × g으로 원심 분리에 그들을. 상층 액을 버린다.
5. 단계를 반복 1.4.
6. PBS + 1 % FBS 200 ㎕를 상기 세포를 재현 탁. 얼음과 인수 될 때까지 어둠 속에서 보관하십시오.
   주 : 쥐과 NK 세포를 최대 10 시간 동안 얼음 상에 유지 될 수있다.

현미경 챔버의 coverglass 슬라이드 2. 준비

주 : 현미경에 최적화 된 것으로, 커버 글래스 두께의 # 1 또는 # 1.5 어느 함께 사용 챔버 커브 글라스 슬라이드 또는 요리. 현미경은 일정한 두께로 정렬되지 않으면 알 수없는 경우, 혹은, 현미경 칼라 링은 현재의 coverglass 두께 ^(17)에 대해 최적화 될 필요가있다.

1. 1:10의 비율로 증류수로 폴리 -L- 리신을 희석. 챔버에 희석 폴리 -L- 라이신의 200 μl를 추가하고 20 분 동안 품어.
2. 제거흡인 폴리 리신 L-적어도 20-30 분 동안 실온에서 뚜껑없이 남겨 챔버 공기 건조하자.

3. FCS 시스템 시작

주의 : 다른 현미경 셋업 소프트웨어 패키지가 또한 사용될 수 있지만,이 프로토콜은, (/ 시약 표 재료 참조) 특정 현미경 시스템 및 소프트웨어를 말한다.

1. FCS의 상관과 공 초점 레이저 주사 현미경을 켭니다. "전문가 모드"에서 소프트웨어를 엽니 다. 40X 물 침지 렌즈를 선택합니다.
2. 은 "취득"탭에서 눌러 "구성"및 "스캔"버튼은 "구성 관리"및 "스캔 제어"창 (그림 1의 창 A와 B, 각각)을 엽니 다. 은 "Confocor"탭에서 키를 눌러 "측정"은 "측정"창 (그림 1의 창 C)를 엽니 다.
3. FCS의를 저장할 폴더를 만듭니다측정. "파일"탭에서 "새"를 클릭하여 새 이미지 데이터베이스를 시작합니다.
4. 은 "레이저"버튼을 사용하여 할로겐 램프와 여진 형광체에 대한 관련 레이저를 켜 (예를 들어, "레드"여기 레이저 용 "녹색"여기 레이저 및 633 nm의 여기 488 ㎚).
5. 적합한 여기 및 방출 필터를 선택하고 해당 감지기를 활성화합니다.
   1. "구성 제어"윈도우에서 사용되는 여기 레이저 여기 및 방사 필터, 광 경로 및 검출기를 포함하여, 촬상에 대한 설정을 지정한다.
   2. 마찬가지로, "시스템 구성"탭에있는 "측정"창에서 FCS 측정에 해당하는 설정을 지정합니다. 이미징 및 FCS에 대해 가능한 한 비슷한 설정을 사용합니다.
   3. 녹색 채널을 활성화은 "채널 1"체크 박스를 선택하여 FCS 녹음에 대한 검색 채널을 활성화l이고 "측정"창에서 빨간색 채널 "채널 2".
      참고 :이 설정은 표준 공 촛점 이미징 실험에서와 같이 사용되는 형광 (들)에 최적화되어야한다. 후속 실험에서, 동일한 FCS 설정 오래 FCS 파일을 여는 사용자 인터페이스 상단의 'Confocor "풀다운 메뉴를 사용하고, 선택하여 재사용 할 수있는"파일 열기. " 신흥 획득 창을 누르고 "재사용". 마찬가지로, 영상 획득 설정이 저장된 이미지를 열고 눌러로드 할 수 있습니다 "재사용을."
6. 레이저가 FCS 측정을 수행하기 전에 안정 될 때까지 기다립니다. 다이오드 레이저는 빠른 안정화하면서는, 가스 레이저를위한 30 분까지 걸릴 수 있습니다. 기다리는 동안 핀홀을 조정합니다.

4. 핀홀 조정

1. 항체에 부착 된 여기 및 발광 스펙트럼에 대응하는 형광 또는 형광 염료의 0.2-0.5 μm의 솔루션을 준비합니다. 그만큼^{형광체는 19} 확산 계수 ^(18)를 알고 있어야합니다.
2. 챔버 커브 글라스 슬라이드의 웰의 중앙에있는 녹색 레이저 여기 된 형광 물질의 용액에 50 μl의 방울을 넣어. 40X 물 목적에 증류수 한 방울을 넣고 슬라이드를 놓습니다. 가시 광선을 시작하고 찾아 형광 드롭에 초점을 안구를 사용할 수있는 "비스"버튼을 누릅니다.
   참고 : 슬라이드 현미경 정렬에 영향을 미칠 수 사이에 유리 두께 추정 약간의 차이 때문에, 나중에 셀 측정과 동일 슬라이드를 사용합니다.
3. 초점이 잘 내부의 액체 방울 (하단 10-100 μm의)를 배치합니다.
4. 은 "측정"창에서 "취득"탭을 선택합니다. 눌러 "위치"에서 "현재 위치"(그림 1의 창 C).
5. 같은 창에서 "시스템 구성"탭으로 돌아갑니다. 높은 페이지 설정녹색 레이저 된 ower.
   주 : 높은 레이저 파워가 포화 전력 (레이저 출력이 더 증가되는 경우, 즉, 형광 신호가 선형으로 증가하지 않는다)를 말한다. 1 mW의 시스템 설정 전력 또는 최대 레이저 출력의 5-10 %의 주위에, 통상적 충분하다.
6. 눌러 신호의 안정성을 테스트 "시작합니다." 이것은 현재의 측정에 대한 시간 추적 및 자기 상관 곡선을 표시하는 별도의 창을 열 것이다. 형광 신호가 시간이 지남에 따라, 높은 안정적인지 확인하고 kHz에서보다는 Hz의 범위에서 보여주는 변동.
7. 은 "측정"창에서 "O 조정"버튼을 선택합니다. 오른쪽 검출 채널 (채널 1 또는 채널 2)가 선택되어 있는지 확인합니다. 보도는 "AutoAdjust X." 결과 곡선은 명확한 최대를 표시하지 않거나, 최대 가장자리에있는 경우, 다시 "거친"옵션을 누릅니다 "AutoAdjust X"를 표시합니다. x- 방향으로 생성 화면이 끝나면 SA 할"AutoAdjust Y."를 눌러 Y 저
8. 모두 명확한 최대가 있고 값이 측정 사이에 변경되지 때까지 "AutoAdjust"를 눌러 조정 X와 Y 사이에 "조"및 대체 선택을 취소합니다.
9. 세포는 두 개의 서로 다른 형광 물질로 표지하는 경우, 적색 형광 물질의 용액을 첨가 한 챔버로 이동한다. 적색 레이저에 대한 높은 레이저 파워를 선택하고 반복 붉은 여기 및 검출 채널에 대한 4.6-4.8 단계를 반복합니다.
   주 : X와 Y 값은 하나의 핀홀이 모두 검출 채널에 사용되는 시스템의 채널 사이에 이탈하는 경우, 중간 값을 선택하고 변경 사항을 적용하려면 확인을 누릅니다. 여기서, X = 79 Y = 189에서 최대로 488 nm의 레이저 및 X = 80, Y = 188, 값 X = 80, Y = 189에서 최대로 633 나노 레이저 선정되었다. 488 나노 미터 또는 633 나노 미터에 의해 여기 된 형광 물질로 표지 된 항체의 두 자극에 대한 488 nm 내지 633 nm의 레이저의 조합이 있기 때문에, 좋은 선택발광 ^{스펙트럼이 중첩되지} 않는 경우에 크로스 - 토크에 대한 위험은 최소화된다.

5. 무료 형광의 환승 시간을 측정

주 : 공지 된 확산 계수와 형광체의 초점 (TauD)를 통해 전송 시간을 결정함으로써, 검출 볼륨의 크기 및 초점 내에 세포막 따라서 면적이 산출 할 수있다. TauD의 계산은 단계 7.2에 설명되어 있습니다.

1. 핀홀 조정에 사용 된 것과 동일한 솔루션을 사용하여 "측정"창 (그림 1, 창 C)에서 "취득"탭에서 30 초 × 2 반복으로 획득 시간을 설정합니다.
2. 은 "측정"창 (그림 1, 창 B)의 "시작"을 클릭하여 측정을 시작합니다.
   1. 또는 근처부터 각 여진 레이저 용액 해당 형광체를위한 레이저 파워 시리즈를 수행전원 포화 각각의 측정에 절반으로 감소. 은 "측정"창 (그림 1, 창 C)의 "시스템 구성"탭에서 레이저 파워를 변경합니다. 측정을 시작하려면 "시작"버튼을 누릅니다.
      주 : 하부 범위에서 예정된 셀 측정을위한 레이저 출력을 포함 ⁽²⁰⁾ (예를 들어, 대물 전에, 16, 8, 4, 2 μW 전력으로 측정). 시스템의 레이저 출력 설정은 여기에 비해 일반적으로 더 높은이며 현미경 및 배향의 품질에 따라 크게 달라질 수있다. 이 시스템에있어서, 상기 전력 범위는 대략 60-500 μW 시스템 설정의 전력에 대응한다. 대물 전에 새로운 현미경 처음 사용될 때 출력 전력을 측정하는 전력 측정기를 사용하도록 권고한다. 레이저의 현재 최대 전력은 "측정"창의 "정보"버튼 아래에 있습니다.
   2. 몰 당 카운트를 기록해당 분자 : 각각의 레이저 파워 측정에서 (CPM 단위 KHZ).
   3. 두 채널 검출을 사용하는 경우, 크로스 토크에 대한 자기 상관 곡선을 표시하는 창을 확인한다. 검출 FCS의 적색 검출 채널의 자기 상관 및 녹색 감지 채널 검출을 평가하기 만 적색 형광체와 용액을 측정하기 만 녹색 형광체를 함유하는 용액을 사용한다. 엄지 손가락의 규칙으로, 적절한 형광에서 특정 신호의 5 % 아래의 "잘못"형광 물질에서 검출 된 CPM을 유지합니다.
   4. 값이 사용되는 레이저 파워에 따라 선형 적으로 확장 있는지 확인합니다. 가장 높은 레이저 파워에서 CPM의 채도 (즉, 선형 관계에서 예상보다 약간 낮은 값)가 허용됩니다.
      참고 : CPM은 거의 모든 현미경 시스템과 일반 형광 가장 높은 레이저 출력을 위해 잘 10 이상이어야하고 민감한 시스템에 대한 상당히 높은 수 있습니다. 새로 결합 형광 항체를 사용하는 처음을 수행항체의 FCS 측정 자유롭게 예상 CPM 정량화 용액의 확산. 측정에 앞서, 외투, 실온에서 1 시간 동안 (0.5 ㎎을 PBS에서 / ㎖로 희석), 폴리에틸렌 글리콜 그래프트 폴리 L 리신 200 μL로 측정 챔버. 피펫으로 액체를 제거하고 공기 건조에 실을 수 있습니다. 냉동실에서 (최대 이주에) 냉장고에 원액 및 분말 재고를 저장합니다. 현미경에서 PBS에서 1 ~ 10 μg의 / ㎖로 항체를 희석. 팔로우는 4.2-4.4이 프로토콜에 6.7 단계를 반복합니다. 표면이 붙지 않는 용액으로 코팅되어 있지 않은 경우, 항체는 유리 표면과 상호 작용하고 신속하게 용액으로부터 고갈 될 수있다.

6. 셀 측정

1. 항체 표지 세포 현탁액 (단계 1.5) 및 8 잘 챔버의 coverglass 슬라이드의 잘 하나에 투명 로즈웰 파크 기념 연구소 매체 1640 (RPMI) 150 μL에서 PBS + 1 % FCS 세포 125 μl를 추가합니다. 르FCS 측정을 시작하기 전에 적어도 20 분 동안 측정 온도에서 어둠 속에서 세포를 Ave이.
   주 :이 정착 웰의 바닥에 부착하여, 측정 온도로 세포 용액 평형화하는 셀을 허용한다.
2. 은 "스캔 제어"창 (그림 1, 창 B)에서, 줌 1을 설정하고 "빠른 XY"버튼을 눌러 빠른 XY 스캔을 시작합니다. 세포가 여전히 선명하게 보이는지하면서 가능한 낮게되도록 레이저 파워를 수정한다. 멤브레인은 명확하게 정의되고 세포질에는 형광 신호가 없다 평균 휘도의 둥근 세포의 이미지 중심. 셀이 이미지의 대부분을 커버까지 확대합니다.
3. 현재 셀이, 돌출, 또는 매우 밝은 반점을 이동하거나 표시 이루고 경우 새로운 셀을 선택합니다. 동일한 실험 중에 캡처 된 모든 셀에 대해 동일한 줌과 레이저 출력을 유지한다.
   주 : 프릴 막도 곧 아포의 표시 일 수있다안검 하수.
4. 세포막의 상단에 초점을 맞 춥니 다. 은 "측정"창 (그림 1, 창 C)의 "취득"탭에서 활성화하여 FCS 측정을위한 위치를 선택 "십자선을." 또는은 "LSM 이미지"탭을 선택 LSM 이미지의 원 측정 지점을 표시하고 Enter 키를 눌러 "위치를 추가합니다."
   주 : 세포막의 상단은 비특이적 폴리 L 리신에 결합 된 형광 항체 또는 형광 물질에 의해 영향을받을 수 없다. 그러나, 셀이 (결과 참조)를 측정하는 동안 이동하지 않는 것을 확인하는 것이 중요하다.
5. 은 "측정"창 (그림 1, 창 C)의 "취득"탭에서, 반복 당 10 초에서 설정 한 "측정 시간"으로, 6-10로 반복의 수를 설정합니다.
6. 은 "측정"창의 "시스템 구성"탭으로 돌아갑니다. 은 "L 아래 FCS 측정 용 레이저 파워 조정ASER "버튼. 대물 전에 1 내지 10 μW ²⁰ 사이의 범위에서 셀 측정을위한 낮은 전력을 사용한다.
   참고 : 권장 값은 세포에 신호 검출 및 광 손상 사이의 트레이드 오프입니다. 단계 5.2.1 주에게 이러한 값에 해당하는 레이저 파워의 비율을 참조하십시오.
7. 은 "측정"창 (창 C)의 "시작"을 누르면하여 FCS 측정을 시작합니다. (예는,도 3a에 하판을 나타낸다) 제 10 초 동안 30 % 이상의 강도 트레이스의 저하에 의해 검출로 크게 셀 표백제 측정의 시작에서, 만약 다른 셀 및 하부 이동 미래의 측정을위한 레이저 파워.
   1. 신호가 손실되는 경우, Z 방향의 초점을 조절한다. 측정이 완료되면, 셀은 여전히 중심에 있고 세포막 측정되었음을 확인하는 "스캔 제어"창 (도 1, 창 B)를 사용한다. 일 경우E 셀 측정을 버리고 이동했다.
   2. 측정이 표시되는 자기 상관 창에서 수동으로 확대 기동, 표백, 대형 클러스터, 또는 기타 유물 (그림 3의 예 참조) 포함 된 개별 반복을 삭제합니다. 그들을 표시를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택하여이 작업을 수행합니다 "삭제합니다." .fcs 형식으로 최종 파일을 저장합니다. 셀 당 적어도 네 개의 반복을 저장합니다.
8. 선택적으로, "주사제"창을 사용하여 (표시 멤브레인의 전체 둘레)와 중간 부에 위치하는 셀의 화상을 취득. 표백을 피하기 위해 FCS 측정 후의 이미지를 캡처. 이미지 캡처를 시작합니다 "싱글"버튼을 누릅니다.
9. FCS의 초점 위치에 대해 "위치 추가"를 사용하는 경우, 클릭 한 다음 세포로 이동하기 전에 "위치 제거".
10. 세포 생존을 유지 throughou 측정 시간이 최대 후 세포 현탁액의 분취 새로운 변경실험에서 t.

7. FCS 분석

1. (이 프로토콜에서 사용되는 소프트웨어에 대한 자재 / 시약 표 참조) 커브 피팅 기능이있는 소프트웨어의 .fcs 파일을 엽니 다.
   참고 : 현미경으로 제공되는 FCS 소프트웨어는 기본 피팅에 익숙해 질 수있는 좋은 장소이지만, 추가 소프트웨어는 두 개의 차원 막 확산에 맞게하는 것이 필요하다.
2. 먼저, 무료 형광 측정 분석에 의해 여진 볼륨의 크기를 결정한다. 자기 상관 곡선 ^(21)에 3 차원 확산 자유 곡선을 장착한다.
   (식. 1)
   참고 : 매개 변수의 정의 : N :이 상관 시간 τ의 _D (TauD) : 초점 볼륨, τ (타우) 형광 개체의 수를 의미 초점 볼륨의 평균 체류 시간, T 1 : 형광체에 대한 가능성이 될 수 있습니다 삼중 상태, τ <서브> T : 단일 항 - 삼중 상태 전이에 대한 완화 시간은, S는 : 높이 비율 초점 볼륨 직경 폭한다.
   1. TauD, 분자에 포커스를 전송하기위한 통과 시간의 압축을 풉니 다.
   2. 핀홀 반경 (ω)를 계산하는 보정 ^{(18, 19)에} 사용되는 형광체의 TauD 관찰 및 출판 확산 계수 (D)를 사용합니다.
      (식. 2)
3. 세포막에 대한 자기 상관 곡선의 분석.
   1. 분자 확산을 나타내는 곡선의 부분을 가시화하기 위해, 시간 프레임 자기 상관 곡선의 가파른 기울기 전에 시작하여 하나의 곡선 수렴 이후 엔딩 선택 (예를 들어, 0.001 뮤린 표면 수용체에 대한 5 초까지를,도 4 참조).
   2. 내가 저장 한 개별 반복의 평균 자기 상관 곡선을 생성n 개의 단계 6.7.2.
   3. 각각 수학 식 3 ^3하여 자기 상관 곡선을 평균화하는 2 차원 막 확산 곡선을 장착한다.
      (식. 3)
      주 : N은 여기 막 면적 내에 존재하는 분자의 평균 개수 다음과 같은 중요한 출력 파라미터이다. 밀도 (N / μm의 ^2)에 다시 계산. τ의 _D (TauD)의 초점 영역에서의 평균 체류 시간은, 막 (들)의 2 차원으로 제한. 결정된 핀홀 반경 (ω) 및 식 (2) T1 통해 확산 계수 ⁽² ㎛ / 초)로 평균 체류 시간을 재 계산하는 형광체는 삼중 상태에 대한 확률이다. 휘도 (CPM)는 N. 의해 측정의 평균 전체적인 강도 나누어 계산
   4. 적합 첫 번째 시도에서 달성되지 않을 경우, 생까지 변수의 시작 값 및 / 또는 상부 및 하부 제한을 변경할S가 얻어진다.
      참고 : 기본 세포막 단백질의 확산 속도에 대한 일반적인 위 하한은 TauD에 대한 10-500 밀리 초, T1에 대해 0 ~ 100 %, 그리고 TauT1에 대한 0.1 밀리 초입니다. 이러한 간격의 중간에 피팅 값을 선택 시작. 전형적으로 1 밀리 초 및 1 초 사이에 위치하는 확산층 유래의 형광 변화를 나타내는 곡선의 부분 (도 4 참조). 형광 물질에 따라, 때로는 확산 파라미터보다 짧은 시간 단위로 자기 상관 상승을주는 제 2 프로세스 본있을 수있다. 이은 (종종 형광 단백질 발생하는) 과도 어두운 상태 (삼중) 또는 점멸에 의해 발생합니다. 삼중 상태는 식 3을 차지하며, 제시된 모델은 따라서 이러한 상황에서 좋은 착용감을 제공해야한다.

결과

전형적인 결과는 막 단백질 400 밀리 초 내지 10 밀리 초 범위의 통과 시간과 자기 상관 곡선을 생성한다. 분자의 수는 내생 적으로 발현 된 단백질에 대한 약 200 μm의 ² 당 0.5 사이에 다를 수 있습니다. 노출 당 비용이 예상보다 낮지 것을주의 깊게 확인합니다. 이것은 백그라운드 신호의 영향이 있다는 것을 의미 할 수있다. 엄지 손가락의 규칙으로 분석을 받아 들여 세포의 CPM 신호 자유롭게 동일한 레이저 파워에 항체를 확산하기위한 CPM의보다 낮은 33 % 이하이어야한다. CPM은 레이저 파워에 따라 선형으로 확장한다. 주요 면역 세포 표면 수용체에 대한 자기 상관 곡선은 0.001 내지 1 초 사이의 가파른 부분 매끄러운 것으로 예상된다. 대표적인 자기 상관 곡선과의 시간 추적 그림 2를 참조하십시오.

토론

FCS이 프로토콜은 면역 세포 (뮤린, 인간 또는 다른 종) 모든 유형의 표면 분자의 분자 동력학 평가를 위해 사용될 수있다. 아래 살아있는 세포의 단일 분자 해상도 FCS 조치 시공간 분자 역학. 분자 밀도뿐만 아니라, 관심있는 단백질의 확산 속도 및 클러스터링 역학은 자기 상관 곡선으로부터 추출 될 수있다.

형광 라벨에 성공 FCS 실험에 대한 중요한 중요하다. 세포막에 관심이 단백질은 전통적으로 항체를 사용하여 라벨이되었고, 항체는 종종 순진 면역 세포의 표면 단백질에 사용하기에 가장 편리합니다. 레이블이없는 항체는 직접 고분자 밝기로 사진을 안정 형광 염료를 결합해야합니다. 항체 결합에 대한 형광의 선택은 측정들의 품질에 중요하다. 유동 세포 계측법에 대한 표준 라벨,이러한 형광 및 피코 에리 트린 기반의 염료로 인해 빠른 표백에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 항체에 직접 접합을위한 사진 안정 염료는 현재 여러 회사에 의해 제공됩니다. 제조자는 일반적으로 결합하고, 생...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MACS NK 세포 분리 키트 마우스 II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	NK 세포의 음성 선택
태아 소 혈청	Sigma-Adlrich	F7524	열 비활성화
인산염 완충 식염수	-	-	집에서 제조
로스웰 파크 기념 연구소 매체 1640	PAA 세포 배양 회사	E15-848	투명 매체
항체 클론 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Fc 수용체 차단용.
Anti-Ly49A 항체			집에서 만든 단클론 항체를 Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd 항체	BD Pharmingen	558915	MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	형광 염료
-L-라이신	시그마-알드리치	P8920	증류수(1.10)에 희석,
폴리-L-라이신(20kDa), 폴리에틸렌 글리콜(2kDa)과 접목	SuSoS, AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	PBS(pH 7.4)에서 0.5mg/ml로 희석.
Rhodamine 110 염화물	Sigma-Aldrich	432202	알려진 확산 계수 : 3.3 × 10− 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	알려진 확산 계수 : 4.4 × 10− 10 m2/sec 20
컨포칼 현미경	Zeiss	LSM510
소프트웨어: Confocor 3	Zeiss
소프트웨어: 곡선 피팅 툴박스가 있는 Matlab		버전 R2013b
Nunc Lab-Tek 챔버 커버글라스	Thermo-scientific	155411	8웰, 바닥 1.0 붕규산