인간 내피 기능의 비 침습적 평가는 유동 매개 팽창 기술에 의해 결정될 수있다. 연구 수천이 기술을 사용하고 있지만, 어떤 연구는 쥐에서 비 침습적이 기술을 수행하지 않았다. 다음 문서에서는 상완의 흐름 중재 팽창과 쥐의 표면 대퇴 동맥의 비 침습적 측정을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
벽 전단 속도의 증가에 대한 동맥 혈관 확장은 혈관 내피 기능을 나타냅니다. 인간의 경우, 내피 기능의 비침습적 측정은 일반적으로 상완 또는 표재성 대퇴 동맥에서 수행되는 흐름 매개 확장 기술을 사용하여 달성할 수 있습니다. 간단히 말해서, 초음파 프로브의 원위부에 위치한 혈압 커프가 수축기 이상의 압력으로 팽창되어 사지 허혈을 초래합니다. 5분 가림이 수축되면 커프가 수축되어 반응성 충혈이 발생하고 벽 전단 속도가 증가하여 혈관 확장 분자가 내피에서 방출되어 혈관 확장을 유도하도록 신호를 보냅니다. 인간에서 흐름 매개 팽창을 수행한 수천 건의 연구에도 불구하고 놀랍게도 살아있는 쥐에서 이 기술을 비침습적으로 수행한 연구는 없습니다. 최근 중개 연구로의 초점이 옮겨진 것을 고려할 때, 쥐와 다른 설치류의 흐름 매개 확장에 대한 비침습적 측정을 위한 지침을 수립하는 것은 매우 중요할 것입니다. 다음 기사에서는 쥐의 상완 및 표재성 대퇴 동맥에서 흐름 매개 확장의 비침습적 측정을 위한 프로토콜이 제시되는데, 이는 이러한 부위가 인간에서 가장 일반적으로 측정되기 때문입니다.
서론
혈관 내피 세포는 선 동맥의 내강을 휴대 단층과 혈관 기능의 중요한 레귤레이터이다. 혈관 직경의 조절 될 내피로부터 방출 수많은 분자가있다. 이러한 분자 중 질소 산화물 (NO), 자극에 반응하여 혈관 내피 세포로부터 방출 주 혈관 확장 분자 것으로 보인다 (예를 들어, 전단 응력 인슐린, 아세틸 또는 변경) 1. 혈관 내피 세포에서 NO는 NO 합성 효소 (eNOS의)를 내피없는 효소에 의해 생성되며, 이후 내피 세포 (2)로부터 방출된다. NO는 휴식과 증가 된 혈관 직경 3의 원인이되는 혈관 평활근에 확산하지 않습니다.
내피 기능 장애는 유동 매개 팽창 (FMD) 기술을 사용하여 인간 4,5- 비 침습적으로 평가할 수있다. FMD가 기능적 생물학적 검정 나타내는 것이 제안되었다 내피 - 유래인간 NO 생체 이용률이, 그리고 일반적으로 ~ 5 분 사지의 폐색 (6) 다음 반응 충혈에 대한 응답으로 상완 또는 표면 대퇴 동맥에서 평가되지 않습니다. 반응성 충혈는 NO (8)의 방출 신호, 내피 세포 (7)에 형질 도입하는 층류 전단력을 증가시킨다. 최근, NO 릴리스 개시 혈관 확장의 비율이 9,10 논의되었지만, FMD는 내피 의존성 팽창 나타내는 일관 심혈관 11-13을 예측하는 것으로 나타났다.
지금까지의 연구 수천 인간의 내피 기능의 비 침습 측정을위한 FMD 기술을 사용하고있다. 중개 연구에 초점 최근의 변화를 고려, 설치류에서 FMD의 비 침습적 측정을위한 가이드 라인은 매우 도움이 될 것입니다. 병진 접근 방식을 유지,이 프로토콜은 상완과 공중으로의 FMD의 측정을 위해 설립되었다해당 사이트로 쥐의 rficial 대퇴 동맥은 가장 일반적으로 인간에서 측정된다. 래트에서 강력하고 반복 FMD 응답에서이 프로토콜 결과 그러나, 쥐에서 FMD 측정 기술적으로 요구하고 다른 연구자들은 비디오 데모없이 복제하기 어려울 수있다. 따라서, 다음 문서는 상완과 쥐의 대퇴 동맥 표면 FMD의 비 침습성 측정을위한 방법을 설명 할 것이다.
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프로토콜
모든 동물의 절차는 실험 동물 (14)의 관리 및 사용에 대한 가이드를 본와 유타 대학과 솔트 레이크 시티 재향 군인 의료 센터 동물 관리 및 사용에 의해 승인되었다.
1. 동물 준비
- 100 % 산소 3 %의 이소 플루 란을 포함 마취 유도 챔버에서 동물을 놓습니다. 그것은 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에서 동물을 둡니다.
- 유도 챔버에서 동물을 제거하고 심전도 (ECG) 전극이 장착 된 가열 시험 테이블에 놓습니다. 100 % 산소 3 % 이소 플루 란 마취를 유지한다. 상완 표재성 대퇴 동맥 FMD 동시에 수행 될 수 없다. 따라서, 각 측정을위한 준비 지침은 다음과 같습니다.
2. 상완 동맥 준비
- 동물 부정사의 위치를 왼쪽 상지와 각각의 하체를 억제수술 테이프로 시험 테이블에 imal.
- 상지의 하부 약간 플랫폼 상기 (~ 0.2-0.5 cm의)을 상승되도록 상기 동물의 우측 상지 억제.
- 머리를 제거하기 위해 동물의 우측 상지에 제모 제 (예 : 나이 르)을 적용합니다.
- 팔꿈치에 오른쪽 상단 사지 말단에 폐색 커프 (직경 표준 혈관 occluder에 루멘 10mm)를 배치합니다. 인플레이션 / 디플레이션이 사지를 이동하고 초음파 이미지를 방해하므로, 플랫폼에 occluder에 휴식하지 마십시오.
- 초음파 키보드를 사용하여 B-모드로 초음파 기계를 설정합니다.
- 폐색 커프 동물, 기단의 상지 초음파 겔 소량을 적용한다.
- 수동 상지와 정위 홀더에 부착 된 초고주파 선형 어레이 변환기 정렬. 상완 동맥은 2~3mm 깊이 볼 수 있어야합니다.
- 상완 동맥,하지 상완 정맥이되고 있음을 확인하려면영상화, 초음파 키보드를 사용 PW 모드로 전환. 연속 혈액 흐름을 미칠 인접한 정맥 반대로 동맥 박동성 혈류를 가질 것이다.
3. 피상적 인 대퇴 동맥 준비
- 동물 부정사를 놓고 상지 및 수술 테이프로 시험 테이블에 왼쪽 하체를 억제.
- 패드 (예를 들어, 접힌 된 종이 수건)를 사용하여 플랫폼 위의 높은 위치 (~ 0.5 cm)에 동물의 오른쪽 하체를 억제.
- 동물의 오른쪽으로 머리를 제거하는 낮은 다리를 제모 제 (예 : 나이 르)을 적용합니다. 머리 제거 후 대퇴 정맥 상부 허벅지 안쪽에서 명확하게 볼 수 있어야합니다.
- 오른쪽 발목에 폐색 커프 (직경 표준 혈관 occluder에 루멘 10mm) 근위부를 놓습니다. 인플레이션 / 디플레이션은 하체를 이동하고 초음파 이미지를 방해하므로, 플랫폼에 occluder에 휴식하지 마십시오.
- 에 초음파 기계를 설정B 모드.
- 폐색 커프 동물, 기단의 하체에 초음파 겔 소량을 적용한다.
- 수동으로 피부를 통해 보이는 대퇴부 정맥으로 정위 홀더에 부착 된 초고주파 선형 어레이 변환기 정렬. 피상적 대퇴 동맥은 1mm 깊은 <볼 수 있어야합니다.
- 피상적 인 대퇴 동맥이 아닌 대퇴 정맥이 이미지화되고 있음을 확인하려면, PW 모드로 전환합니다. 연속 혈액 흐름을 미칠 인접한 정맥 반대로 동맥 박동성 혈류를 가질 것이다.
4. 기준 상
- 이 인간 (15)에서 수행하는 방법을 동일한 B 모드 영상을 최적화. 모두 벽으로 시각화 중막과 선박의 가로, 세로 이미지가 관찰되어 있는지 확인합니다. 약간 가능한 동맥의 정도를 확인하기 위해 초음파 프로브의 위치를 조절하여 이미지를 최적화하여 캡쳐 윈도우를 볼 수있다.
- 대안 적으로, 밝기 / 콘트라스트 초점 영역, 주파수, 동적 범위, 및 선 밀도를 변경하여 더 나은 화상을 얻는 초음파 설정을 조정한다. 거기에 초음파 영상을 최적화하는 다른 방법이 있지만, 이들의 상세한 설명은이 프로토콜의 범위를 벗어난다.
- 동맥 이미지의 최적화 후, 수집 된 하나의 직경 프레임은 심장주기의 각 이완기 부분 동안 있는지 확인하기 위해 R 파 동안 촬영 된 이미지 만 표시 ECG-게이트의 전원을 켭니다.
참고 : ECG-게이팅은 생리 설정 옵션에서 ECG-게이팅을 선택하여이 프로토콜에 사용되는 초음파 시스템에서 사용할 수 있습니다, 그러나,이 기능은 모든 초음파 시스템에서 사용하지 못할 수 있습니다. 화상 최적화 후 ECG 게이팅은 낮은 프레임 속도로 화상을 얻는 것이 어렵 기 때문에, 온한다 (즉, 한번 R 파마다). ECG 게이팅 높은 프레임 높은 심장 쥐 속도 요구의 조합없이속도는 심장주기의 이완기 부분 만 ~ 10-20초 클립을 가능하게 촬영합니다. 각 클립 내의 데이터의 번거로운 크기와 양이 실질적으로 분석 부담을 증가시킨다. - 기록 B 모드를 사용하여 기준 데이터 60초.
주 : 초음파 클립에 기록 될 수 프레임 수에 제한이, 상기 초음파 장치는 항상 기록하고, 그러나, 사진은 초음파 시스템에 저장된다. 상기 클립의 길이 (즉, 프레임의 수)의 설정을 조정할 수있다. 클립 당 프레임의 최대 수를 설정하는 것이 좋습니다. 기록은 클립의 단부에있을 때, 기록이 계속된다 (즉, 프레임들의 최대 수에 도달), 그러나 클립이 전방으로 가장 최근의 프레임 캡처 롤. 이 경우, 최대 프레임 한계 밖에서 캡처 된 이전 프레임 이후에 삭제된다. 기록에서 이러한 복잡한 기계 사이에 차이가 있지만, 녹화 시간의 조정이 필요할 수 있습니다. - SWIPW-모드로 TCH. 루멘의 중간에 커서를 놓습니다. 샘플 게이트는 커서를 참조하여 자동으로 배치되지만, 초음파 키보드를 사용하여 폭 조절 될 수있다. ≤60 °의 insonation 각도를 유지한다.
- 도플러 빔 각도를 변경하여 insonation 각도를 조정합니다. 초음파 키보드를 사용하여 각도를 미세 조정합니다. 이 중 어느 것도 측정에 적합한 각도를 제공하는 경우, 수동으로 더 최적의 각도로 동맥을 기울여 초음파 프로브를 조정합니다. 초음파 각도 어떠한 조정이 수행된다면, B 모드 이미지를 캡처.
- 속도 데이터 10 초를 기록한다.
5. 폐색 단계
- 공기로 채워진 10 ㎖ 주사기를 사용하여 혈관 occluder에 팽창. 혈관 occluder에 공기 압력을 일정하게 유지하기 위해, 자체에 튜브를 접어 접힘 튜브 바인더 클립을 배치했다.
- 에 의해 입증, 커프스 폐색을 확인하기 위해 PW-모드로 전환혈액 속도의 큰 감소.
- 폐쇄 4시 45분 분까지, 60초 클립에 B 모드 및 기록 데이터로 전환합니다.
- PW-모드로 전환합니다. 심박수를 기록 및 분석을위한 초음파 각 클립의 시간을 유지한다.
6. 충혈 단계
- 접힌 튜브에서 바인더 클립을 제거하여 PW-모드로 녹화하는 동안 커프를 놓습니다. 기록 오초 이전에 5 초 커프 출시 된 이후.
- 폐쇄 후 삼분 때까지 60초 클립에 B 모드 및 기록 데이터로 전환합니다. 심박수를 기록 및 분석을위한 초음파 각 클립의 시간을 유지한다.
- FMD 종료 후의 검사 테이블에서 동물을 제거하고 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 모니터링한다.
7. 분석
- 분석을 위해, 편견을 허용 에지 감지 소프트웨어가 설치된 오프라인 컴퓨터에 DICOM 파일로 내보내기 초음파 저지각 프레임에서의 동맥 직경 mination. 그것은 매우 시간 집약적이고 연구자의 편견이 적용됩니다으로 분석, 초음파 시스템에 그러나, 그것은하지 않는 것이 좋습니다 수 있습니다.
- 기준 및 폐쇄 단계에서 60초 세그먼트에서 동맥 직경의 데이터를 분석하고, 충혈 단계에서 십초 세그먼트입니다.
- 자동 에지 검출 소프트웨어의 흐름 분석 기능을 사용하여 혈액의 속도 데이터를 분석한다. 기준 및 폐쇄 단계에서 균일 한 모양의 5 이상 연속 파형을 측정하여 평균 혈액 속도를 결정합니다. 즉시 커프 출시 된 이후 혈액 속도에 대한 반응성 충혈 동안 평균 혈액 속도를 결정합니다. 가장 높은 혈액 속도와 파형 피크 혈액 속도로 간주됩니다.
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결과
흐름 매개 팽창 8의 Wistar 래트의 상완 피상적 대퇴 동맥에서 수행 하였다. 래트의 위치는도 1에 도시된다.
피상적 인 대퇴 동맥의 대표 초음파 영상은 그림 2에 표시됩니다.
도 1 쥐 초음파 측위.
상완 (A)의 측정 및 표면 대퇴 (B) 동맥 FMD에 대한 쥐의 위치. 초음파 프로브와 상완 (C)의 측정 및 표면 대퇴 (D) 동맥 FMD에 대한 폐쇄 커프의 위치.
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토론
본 연구에서는 FMD의 비 침습 측정은 상완과 쥐의 표면 대퇴 동맥에서 입증되었다. 5 분 폐색 기간 다음 인간 (6)와 마찬가지로, 혈액의 속도 (즉, 반응성 충혈)하여 동맥의 연속적인 혈관 확장의 결과 동맥 벽 전단 속도의 증가가 급격히 증가 하였다. FMD는 상완 피상적 대퇴 동맥 모두에서 관찰되었다. 또한, 동맥 사이의 FMD에 강한 관계가 있었다. 최대 전단 속도는 표면 대퇴 동맥에 이상 이었지만, FMD는 전단 속도가 혈관 사이에 강한 관계를 유지 피크 정규화. 함께,이 결과는 FMD의 비 침습성 측정을 성공적으로 래트에서 수행 될 수 있음을 나타낸다.
FMD의 측정은 두 개의 서로 다른 혈관에서 수행되었지만 기준선으로부터의 변화 퍼센트로 표현 될 때, FMD의 크기는 유사 하였다. Howeve베이스 라인에서 절대 변화로 표현 때 동맥이 피상적 인 대퇴 동맥보다 ~ 25 % 더 큰 휴식의 직경이 같은 R, FMD는 상완 동맥에서 높았다. 이러한 ...
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감사의 글
모든 동물 이미징은 유타 대학교의 소동물 이미징 핵심 시설에서 수행되었습니다.
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금(R21 AG043952, R01 AG040297, K01 AG046326, K02 AG045339 및 R01 DK100505)의 보조금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Vevo 2100 고해상도 마이크로 초음파 이미징 시스템 | VisualSonics, 토론토, 온타리오, CAN | ||
| MicroScan 초고주파 선형 어레이 트랜스듀서 - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, 토론토, 온타리오, CAN | ||
| Vevo 이미징 스테이션 | VisualSonics, 토론토, 온타리오, CAN | ||
| 써마소닉 젤 워머 | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | 옵션 |
| Signacreme 전극 크림 | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore 수술 테이프 | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| 탈모 크림 (e.g., Nair) | 일반 공급 | ||
| 면봉 | 일반 공급 | ||
| 표준 혈관 폐색기, 10 mm 루멘 직경 | 하버드 장치, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml 주사기와 Luer-Lok 팁 | 일반 공급 | 폐색 커프 장치에 사용 | |
| 종이 클립 | 일반 공급 | 폐색 커프 장치에 사용 | |
| 피하 바늘 – 18 게이지 | 일반 공급 | 폐색 커프 장치에 사용 | |
| 중간 바인더 클립 | 일반 공급 | 폐색 커프 장치에 사용 |
참고문헌
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C. eNOS at a glance. J Cell Sci. 117, 2427-2429 (2004).
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070(2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
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