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방법 논문

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과

20.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54767

⸱

2016년 8월 23일

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

초록

Zika 바이러스 (ZIKV)는 같은 소두증, 눈 결함 및 손상 성장으로 태아의 발달 이상에 연결되어 신흥 병원균이다. ZIKV는 플라 비비 리다 가족의 RNA 바이러스이다. ZIKV 주로 모기 전송뿐만 아니라 태아 수직 전송뿐만 아니라 성적 접촉을 모체로 확산 될 수있다. 현재까지 바이러스에 감염된 사람들을 보호하기 위해 가능한 신뢰할 수있는 치료 또는 예방 접종 옵션이 없습니다. 재현 효과 Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템의 개발 ZIKV 복제뿐만 아니라 약물과 백신 개발의 분자 메커니즘을 연구하는데 중요하다. 이와 관련하여, 바이러스의 생산 및 성장 분석을 위해 포유 동물 세포 기반 체외 Zika 바이러스 배양 시스템을 설명하기위한 프로토콜은 여기에보고된다. 바이러스 역가를 측정하는 세포 단층과 상패 분석​​에 Zika 바이러스에 의한 플라크의 형성에 대한 세부 사항이 표시됩니다. 바이러스 게놈 복제 속도론및 이중 가닥 RNA 게놈 replicatory 중간체가 결정된다. 이 문화 플랫폼은 인터페론 α (IFN-α)의 식별 결과 사이토 카인의 작은 세트의 라이브러리에 대해 화면으로 사용하고, IFN-β와 Zika 바이러스 성장의 강력한 억제제로 IFN-γ. 요약하면, 시험 관내 감염 Zika 바이러스 배양 시스템 및 각종 바이러스 학적 분석은 크게 더 바이러스 발병의 메커니즘과 바이러스 독성의 진화를 해명의 연구 커뮤니티에 도움이 할 수있는 잠재력을 가지고 본 연구에서 입증된다. 바이러스 IFN 알파는 또한 감염된 임산부 포함 고위험 인구 Zika 바이러스 감염에 대한 예방제, 노광 후 예방 및 치료 방법으로 평가 될 수있다.

서론

Zika 바이러스 (ZIKV)는 소두증와 가난한 임신 1,4를 성과와 관련된 중요한 인간 병원체이다. ZIKV는 같은 뎅기열, 웨스트 나일, 세인트 루이스 뇌염 바이러스와 같은 신경 학적 결함을 일으킬 수 의학적으로 관련 플라 비 바이러스의 집합에 속한다. 바이러스 전송의 주요 모드뿐만 아니라, 성적 전송은 5,6를보고되었습니다, 모기 벡터 Aedes aegypti에 의해, 그리고. ZIKV 인해 모기 벡터의 확대 지리적 분포 및 출생 결함과의 강한 상관 관계에 주요 글로벌 건강 문제가되고있다. ZIKV 먼저 Zika 숲에서 감시 붉은 털 원숭이에서 1947 년 고립 된, 우간다 및 제 인간의 경우는 1952 7,8보고되었다. 발열, 발진, 두통, 결막염, 근육 / 관절 통증 등의 가벼운 증상에 존재 ZIKV에 감염 될 개인. 감염된 임산부는 태아 1 ZIKV를 전송할 수 있습니다. 지IKV 감염은 길랑 바레 증후군, 말초 신경의자가 면역 탈수 초 질환 (9)에 연결되어있다.

Zika 바이러스 게놈의 길이는 약 10.8 킬로베이스이고 긍정적 인 의미, 단일 가닥 RNA 분자로 구성되어 있습니다. 게놈의 구조는 단백질 코딩 영역을 측면 비 코딩 영역 (NCR)와, 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A - NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR로 구성되어 있습니다 6. 하나의 폴리 프로테인 (3419 AA)는 그 공동 및 사후 병진 (10) 작은 펩타이드로 분해입니다 번역됩니다. 5'NCR 및 3'NCR RNA 줄기 루프 구조는 모두 바이러스 게놈 번역 및 복제의 개시에 중요한 역할을한다. 게놈의 구조적 성분은 캡시드, 막 및 외피 단백질로 구성된다. 비 구조 단백질은 게놈 복제를 위해 중요하다.

현재 Zika 바이러스 균주는 세 가지 주요 유전자형으로 분류된다 : 서 아프리카, 동 아프리카, 아시아 6,10-13. 그것은이 제안되어있다가 나중에 추가로 12 진화 서부 아프리카와 아시아에 확산 동부 아프리카 혈통. 아시아 유전자형은 미국에서 현재 발생에 대한 책임이 있습니다. Zika 바이러스는 모기와 포유 동물 세포 모두에서 배양 할 수있다. 기본 피부 섬유 아세포, 미성숙 수지상 세포, 대뇌 피질의 신경 전구 세포와 베로 세포 Zika 10,14,15 바이러스 감염에 취약하다. 모두 유형 I 및 유형 II 인터페론 피부 섬유 아세포 (15) ZIKV 성장을 제한하는 것으로 나타났다. 이 연구의 목적은 포유 동물 세포 배양 시스템에서 생산 및 아시아 유전자형 ZIKA 바이러스 스트레인 PRVABC59의 시금위한 단계별 상세한 프로토콜을 제공하고 약물 개발 플랫폼으로 이러한 감염 배양 시스템의 유용성을 입증한다. 이 자원은 크게 더 난을 규명 할 수있는 Zika 바이러스 및 신경 학적 연구 커뮤니티에 혜택을 가능성이있다바이러스의 발병 기전과 바이러스 독성의 진화의 TS 메커니즘.

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프로토콜

주 : 작업 흐름의 개략적 개요는도 1에 제시된다.

1. 세포

  1. Zika 바이러스 생산 및 바이러스 성 복제주기의 분석을위한 베로 세포를 사용합니다.
  2. 전체 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L- 글루타민, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신을 함유하는 성장 배지 (100 단위 / ml), 및 10 mM의 HEPES를 준비한다.
  3. 5 % CO 2, 37 ℃에서 특정 완료 성장 배지 베로 세포 배양.

2. Zika 바이러스 생산

  1. T-75 플라스크에 0.25 % 트립신을 사용하여 80 %의 세포 밀도의 베로 세포를 수확하고, 세포 수를 계산.
    1. T-75 배양 플라스크에서 미디어를 대기음 2 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세포를 씻어.
    2. 0.25 % 트립신 2 ML을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 플라스크를 품어.
    3. 트립신을 불 활성화하는 성장 매체를 포함하는 혈청의 8 ML을 추가합니다. 피펫 위 SUS 아래로PEND 세포를 15 ㎖의 튜브에 세포를 전송하고.
    4. 세포의 10 μl를 제거하고 0.4 % 트리 판 블루의 동일한 양으로 혼합한다. 셀 카운팅 챔버 슬라이드에 준비된 믹스를 넣고 자동 세포 계수기를 사용하여 카운트하여 생존 세포를 얻을 수 있습니다.
  2. 은 T-160 플라스크에 30 mL의 부피로 세포 7,000,000 개의 종자.
  3. 다음 날, 플라스크 당 10 ml의 무 혈청 배지에서 Zika 바이러스 접종의 (0.1 MOI 0.01) 감염의 적절한 다수를 준비합니다.
  4. T-160 플라스크에서 소비 된 용지를 제거하고 새로 제조 된 바이러스 접종 물 (10 ㎖)를 추가합니다.
  5. 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접종 플라스크를 품어. 부드럽게 모든 시간에 옆으로 플라스크를 기울여 접종을 확산.
  6. 배양 완료시, 각 플라스크 따뜻한 혈청 보충 성장 미디어 (30 ㎖)으로 접종을 교체합니다. 그런 다음 96 시간 동안 바이러스 문화를 계속합니다.
  7. 에서의 진행을 확인위상차 현미경을 이용하여 40 배 및 200 배 배율 필요한 이미지 (도 2)를 가지고 세포 단층에 바이러스 플라크의 외관을 관찰하여 fection.

figure-protocol-1
그림 2 :. 다양한 배율의 베로 세포의 단층에 Zika 바이러스에 의해 형성된 플라크 밝은 필드 이미지는 48 HPI에서 Zika 바이러스 플라크를 보여줍니다. 단일 층에 둥근 세포 병소의 존재를합니다. (스케일 바 = 50 μm의)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 96 시간 시점에서 원심 분리 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG의 상등액에서 수확 세포 배양 상청 균체 잔사를 제거했다.
  2. 조심스럽게 방해 펠렛 파편과 전송 t없이 뜨는을 제거15 ml의 튜브 오. 24,000 XG에 초 원심 분리 (옵션) 바이러스 입자를 집중 수행 할 수 있습니다.
  3. -80 ° C에서 여러 분취에서 바이러스 배양 상층 액을 저장합니다.

플라크 분석 3. 측정 Zika 바이러스 역가

  1. 12 웰 플레이트를 사용하여 2 ml의 볼륨에 웰 당 1 × 10 5 세포에서 종자 순진 베로 세포.
  2. 다음날, 혈청이없는 배지를 사용하여 T-160 플라스크에서 수집 바이러스 배양 상청액의 연속 희석 1/10 제조. 각에서 소비 된 미디어를 잘 제거하고 중으로 베로 세포에 준비 접종의 400 μl를 추가합니다.
  3. (37)에 접종 플라스크를 품어 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2와 C를 °. 조심스럽게 하나 하나 시간에 옆으로 판을 기울여 접종을 확산.
  4. 인큐베이션의 끝에, 세럼이 보충 미디어 접종 (웰 당 2 ml)로 교체한다.
  5. 48 시간 포스트 접종에서, 위상 제어 방식을 사용하여 바이러스 초점을 계산AST 현미경. ml의 당 플라크 형성 단위 (PFU)와 같은 바이러스 역가를 계산합니다. 플라크 분석 그림 3을 참조하십시오.
  6. 수정하고 플라크 명확한 시각화 20 % 에탄올 중에서 제조 된 4 % 포름 알데히드 셀 0.1 % 크리스탈 바이올렛 용액을 착색.

4. Zika 바이러스 성 게놈 복제 분석

  1. 12 웰 플레이트를 사용하여 2 ml의 볼륨에 웰 당 1 × 10 5 세포에서 종자 순진 베로 세포. 세중에서 혈청 무료 매체를 사용하여 낮은 및 높은 역가의, 그 다음날은 바이러스 접종 (400 μL / 웰 0.01 및 0.1의 MOI)를 준비합니다. 모의 감염, 혈청이없는 배지 (400 μL / 웰) 만 사용합니다.
  2. 3.4 단계 3.2를 반복합니다.
  3. 48 및 96 시간 시점에서, RNA 및 면역 세포 화학 (ICC)에 샘플을 수집한다.
    1. 수확 RNA 샘플의 경우, 미디어를 제거한 다음 해물을 잘 직접 각 용해 액 400 μl를 추가하고 수집합니다.
    2. ICC를 들어, 미디어 및 t 제거암탉 각 웰에 1 ml의 메탄올을 첨가하여 세포를 고정시키고, 30 분 동안 4 ℃에서 플레이트 배양한다.
    3. 세포 파쇄물, 제조자의 지시 당 RNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 분리. 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화.
  4. 수확 된 RNA로부터 ZIKV 게놈 콘텐츠를 결정하기 위해 두 단계의 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR에)을 수행한다.
    1. RNA의를 전사 바꾸려면, 먼저 0.2 ML 튜브에서 격리 RNA의 5 μg의,의 dNTPs (10 mM)을 1 μL, 1 μL 무작위 헥사 (250 NG)로 구성된 13 μL 반응 믹스를 설정합니다. 5 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어 다음 일분 얼음에 놓습니다. 그 후, 역전사 효소 1 ㎕를, 5 배 가닥 합성 완충액 4 ㎕를 0.1 M 디티 오 트레이 톨 1 μL, 반응 혼합물에의 RNase 억제제 1 μL를 추가한다. 50 ° C 및 inactiv 60 분이어서 25 ℃에서 추가로 5 분 동안 튜브를 부화15 분 동안 70 ° C로 가열하여 반응을 먹었다.
    2. qPCR에가 2 배 녹색 염료 슈퍼 믹스의 12.5 μl를 포함하는 DNA 중합 효소와 Zika 바이러스 [용 Zika 바이러스 범 유전자형 프라이머 (특정 10 mM의 각각의 프라이머 1 μL와 결과의 cDNA 1 μl를 사용하여 수행 : 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; 반전 : 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika 바이러스 아시아 유전자형 PRVABC59 균주 프라이머 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; 반전 : 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], 또는 C 형 간염 바이러스 (JFH RTQ F : 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3, JFH RTQ R : 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), 또는를 들어 휴대 하우스 키핑 유전자 GAPDH (: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; 계 : 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') 25 μL 반응 볼륨입니다.
    3. 실행 조건 15 초 동안 95 ° C 및 실시간 PCR 시스템에서 30 초 (40 회) 60 ° C를 사용하여 PCR을 수행합니다.
    4. 는 Z 정상화 사이클 임계 값에 기초하여 (CT)의 값을 GAPDH의 발현 수준을 사용IKA 바이러스 게놈 측정. GAPDH에 비해 Zika 게놈 델타 코네티컷 (ΔCT) 값을 계산하고이 값을 ΔCT 얻었다. 그리고, 표시된 시점에서 감염과 감염되지 않은 세포 사이의 정규화 Zika 게놈 내용물의 비율을 고려하여 스크롤 변화를 계산한다. ZIKV 게놈 복제 결과를 그림 4를 참조하십시오.
  5. 메탄올 고정 된 세포를 사용하여 ICC를 수행합니다.
    1. (PBS에서 0.1 % 트리톤-× 100, 3 % 염소 혈청, 3 % BSA) 1X PBS로 고정 셀을 세 번 씻고 ICC 차단 버퍼 차단합니다.
    2. 버퍼를 차단 100 4 ℃에서 밤새 품어 : 1의 희석에 마우스 단일 클론 항 dsRNA를 항체 J2 (1 μg의 / ㎖)를 사용합니다.
    3. 1X PBS로 세포를 세척하고, 1 차 항체를 염소 항 - 마우스 IgG-594 (1 μg의 / ㎖)을 추가 블로킹 완충액 1000 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    4. 훽스트 (Hoechst) 염료를 사용하여 핵에 대한 1X PBS와 얼룩 세포를 씻고100X 배율 형광 현미경 (도 4)를 사용하여 세포를 관찰한다.

Zika 바이러스 감염에 대해 사이토 카인 라이브러리를 스크리닝 (5)

  1. 웰 12 웰 플레이트를 사용하는 당 1 × 105 세포에서 순 베로 세포 종자. 세포가 (6 시간 후 - 시드)에 부착되면, 생물 중복에 표시된 농도 (2 ml의 볼륨 / 웰)에서 각각의 사이토 카인을 추가합니다. 차량 (PBS) 혼자 컨트롤을 포함합니다.
  2. 12 시간 후 처리에서, Zika 바이러스 감염 (물론 당 0.1 400 μL의 MOI)를 수행합니다. 감염 (모의)없이 부정적인 제어 우물을 포함합니다.
  3. 4 시간 게시물 감염에서, 사이토 카인 처리 된 미디어 (2 ㎖)와 함께 바이러스 접종을 교체합니다. 추가로 44 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
  4. 48 시간 게시물 감염에서, 위상차 현미경을 사용하여 바이러스 성 플라크를 계산하고 40X 배율 (그림 5)에 감염된 세포의 대표 이미지를 수집.

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결과

Zika 바이러스 변형, 아시아 유전자형 (PRVABC59 GenBank 액 번호 KU501215)은이 연구 (12)에 이용되었다. 80 % 컨 플루 언시 베로 세포는 새로이 Zika 바이러스 감염을 연구에 사용 하였다. 바이러스 생산과 바이러스 학적 특성화 이후, 초기 통로 (P3) Zika 바이러스를 사용 하였다. 바이러스 플라크를 감염 둘째 날에 관찰되었다. 초기에 감염된 세포로부터 방출 Zika 바이러스 자손은 단층 배양 (도 2)에 보이는 플라크의 형성을 초래할 인접 세포로 확산 할 수있다. Zika 바이러스 감염의 세포 변성 효과 (CPE)는 같은 라운딩 및 분리 세포뿐만 아니라 용균 세포 사멸 등의 형태 학적 변화에 의해 특징입니다.

바이러스 역가를 측정하기 위해, T-160 플라스...

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토론

여기에, 시험 관내에서 Zika 바이러스를 배양하기위한 간소화 된 프로토콜이 제공됩니다. 바이러스 배양을 확장 역가를 측정하고, 제공 한 게놈 복제를 정량화하기위한 최적의 엔드 포인트를 식별하는 단계를 포함하여 긴급. Zika 바이러스 감염 인자를 처리하는 동안, 바이오 안전성 절차를 엄격하게 따라야한다, 인간 병원체이기 때문에. 원숭이 신장 세포주 베로은 다양한 바이러스 학적 분석을 보여주는 사용 하였다. Zika 바이러스 복제의 반응 속도는 다양한 조직과 종의 세포에서 다를 수 있습니다. 이전 15 바와 같이 추가의 세포주가 사용될 수있다. Zika 바이러스 감염된 태아 (3)의 뇌 조직에서 분리 된 피질 신경 전구 세포를 감염 14 밝혀졌다. 따라서, 신경 세포 ZIKV 감염 병리학을 평가하는 추가 셀 고유 통찰력을 제공 할 수있다. 아프리카와 아시아 유전자형의 neurovirulent 표현형의 차이를 조사 할 수있다이 감염 배...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

지카 바이러스 균주 PRVABC59 제공해 주신 미국 질병통제예방센터(CDC)의 Aaron Brault 박사와 Brandy Russell 박사에게 감사드립니다. 이 원고를 카피 에디팅해 준 예일 대학교의 니콜라스 텐(Nicholas Ten)에게 감사한다. 이 연구는 V.A.에 수여하는 Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning25-054-C1
Trypan 블루 스테인 0.4%Life TechnologiesT10282
백작 부인 – 자동 세포 계수기ThermoFisher ScientificC10227
백작 세포 계수  챔버 슬라이드ThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
마우스 단클론 항dsRNA 항체 J2 영어 & 과학 컨설팅 Kft.
염소 안티-토끼 IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR 시스템Thermo Fischer4471088
RNase-Free DNasePromegaM6101
Vero Cell Line ATCCCCL-81
지카 바이러스 균주 PRVABC59Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6Peprotech200-06                         
IL-1 알파             페프로텍200-01A                   
TNF-알파페프로텍300-01A                   
인터페론 알파 A   R & D Systems11100-1
인터페론 베타Peprotech300-02BC
인터페론 감마Peprotech300-02
원심분리기 5415REppendorf5415R
원심분리기 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti 면역형광 현미경 Nikon Intenselight C-HGFINikon방문 Nikon 요청
10010200

참고문헌

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