방법 논문

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

DOI:

10.3791/54774

⸱

2016년 12월 1일

 , 
1Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

이 논문에서

요약

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우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

초록

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형광 현미경은 세포 내 특정 생체 분자를 직접 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 종래의 형광 현미경, 공간 해상도는 광축을 따라 결상면과> 내지 500nm에서 ~ 200 nm의 회절에 의해 제한된다. 결과적으로, 형광 현미경은 오랫동안 심각한 세포 내 미세 기능의 관찰에 한정되었다. 초 해상 현미경 방법의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고있다. 특히, 광전 환성 형광체의 출현 분자 길이 스케일에 접근 해상력을 제공하는 기반 지역화 초 해상 현미경을 가능하게한다. 여기서는 간섭계 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM)이라는 단일 분자 파악 현미경 다상 간섭에 기초하여 입체 초 해상 현미경 법의 적용을 설명한다. 이 방법은에 거의 등방성 해상도를 제공세 가지 차원에서 20 나노 미터의 순서. iPALM 악기의 시료 준비 및 운영을 포함하여 사상 액틴 세포 골격을 시각화 프로토콜, 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포에서 다른 미세 구조 기능 연구에 쉽게 적응과 교훈입니다.

서론

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복잡한 세포 구조의 시각화는 오랫동안 생물 통찰력과 발견을 통합하고있다. 형광 현미경은, 그 해상력이 ~ 200 화상면에 나노 (X, Y, 또는 측 방향 치수) 및> 500 nm의 광학 축 방향 (Z, 또는 축 방향 치수)에 회절 고분자 특이성 화상 세포 제한 할 수 있지만 1, 2. 따라서, 미세 기능 관찰 역사적 전자 현미경 (EM)로 제한되어왔다. 100 nm의 범위 1-6 - 다행히, 슈퍼 해상도 현미경의 최근 발전은 10에서 공간 해상도를 가능하게,이 제한을 회피했다. 특히, 슈퍼 해상도는 같은 PALM (광 활성화 현지화 현미경) 4, FPALM은 (형광 광 활성화 현지화 현미경) 5 (d)에 STORM (직접 확률 광학 재건 현미경) 6, 7, PAINT (같은 약어로 알려진 단일 분자 현지화에 기반 접근 방법 포이미징 나노 지형) 8 INT의 축적은, GSDIM (접지 상태 고갈 현미경 9) 개별 분자 반환 한 다음, 또는 SMACM (단일 분자 액티브 제어 현미경) (10),뿐만 아니라 그들의 3 차원 (3D) 구현, 간섭 PALM (iPALM) 11 3D-STORM (12)는 신경 세포의 축삭을, 다수의 생물학적 구조의 나노 조직에 새로운 통찰력을 드러내는 포함 귀중한되었습니다 및 초점 유착 14, 15, 세포 - 세포 접합 (16), 원자력이 17 모공, 13 시냅스 및 중심체 18 ~ 20 등이 있습니다.

슈퍼 해상도 현미경은 잠재적으로 유용하는 세포의 또 다른 미세 기능은 액틴 세포 골격이다. 셀 피질 필라멘트 (F) 액틴의 복잡한 그물 세공은 세포 형태 및 기계적 특성 (21)의 제어에 중요한 역할을한다. 조직 오F의 F-액틴 적극적 동적 강하게 중합, 가교, 회전율, 안정성 및 네트워크 토폴로지 (22)에 영향을 미치는 수많은 조절 단백질 비록 조절된다. 그러나, F - 굴지 그물 세공 구조의 특성은 세포 과정의 다양한 범위, 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 자신의 관찰을 방해은 F-액틴 필라멘트의 작은 크기 (~ 8 ㎚)에 기계적인 통찰력에 대한 중요하지만, 따라서 액틴 미세 구조의 시각화 종래 독점적 EM에 의해 수행되었다. 여기서는, 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격 F-시각화 3D 11,23에 매우 높은 정밀도 기능을 활용할 iPALM 초 해상 현미경 기술을 사용하는 프로토콜을 기술한다. iPALM 악기는 매우 전문 있지만, 이러한 장비를 설정하는 방법에 대한 지시는 최근 23 설명되어있는 호 주최 iPALM 현미경에 액세스하는 동안구 휴즈 의학 연구소는 또한 최소의 비용으로 연구 커뮤니티에 제공하고있다. 또한, 본원에 기재된 시료 제조 방법은 더 광범위하게 사용할 수있는 등의 점 확산 함수 (PSF)의 난시 디 포커싱 기반으로하는 다른 3D 슈퍼 해상도 방법, (12) 또는 이중면 검출부 (24)에 직접적으로 적용될 수있다.

우리는 일반적으로 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 필요한 성분이 충족되어야 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 세 가지 핵심 요구 사항을 수있는 광전 환성 형광 25이므로주의 : ⅰ) 높은 단일 분자 배경 신호의 밝기 및 대비 상대; ⅱ) 소정의 이미지 프레임 내의 단일 분자의 희박한 분포; 또한 나이 퀴 스트 - 샤로 알려진 기본 구조 (의 프로필을 캡처하기에 충분한 라벨 및 ⅲ) 높은 공간 밀도nnon 샘플링 기준) 26. 따라서, 만족스러운 결과를 위해, 형광체의 강조 photoswitching을 최적화하고 기본 미세 구조를 보존 할뿐만 아니라, 실험 기기 및 수집 측면하는 시험편의 적절한 준비를 모두 동등하게 배치되어야한다.

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프로토콜

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1. 이미징 표본 준비

  1. 배경 형광 신호는 형광 라벨 형광을 방해하기 때문에, 제 (DDH 2 O) 탈 이온수로 세정을 한 후, 압축 공기를 사용하여 공기 건조하여 coverglasses 청소. 그 후, 15 초 동안 플라즈마 클리너에 플라즈마 에칭을 수행하거나, 필요 이상.
  2. 드리프트 보정 및 iPALM 보정을 사용하려면, # 1.5 라운드 (22-mm 직경) 신뢰할 수있는 교정 및 드리프트 보정과 같은 높은 광 안정성 기점를 제공 기준 마크, 형광 나노 입자에 포함 된 사전 청소 coverglasses를 사용합니다. 때문에 충분한 형광 밀도 축적하는데 필요한 긴 획득 시간 (> 15-30 분), 샘플 드리프트는 불가피하다.
  3. 6 잘 조직 배양 플레이트에 각 fiducialed 커브 글라스를 놓습니다. 15 분 동안 층류 후드에서 자외선 (UV) 조사에 의해이를 멸균.
  4. 멸균 층류 후드에서 석면을 제조10 μg의 / ㎖ - 최종 농도 2 무균 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 원액을 희석함으로써 커브 글라스 코팅 nectin 용액. 각 DPBS로 3 회 커브 글라스 씻어 4 ℃에서 하룻밤 피브로넥틴 용액 2 ㎖로 배양. 이어서, 피브로넥틴 용액을 흡인하고 DPBS 회 헹군다.
  5. DPBS 짧게 세포를 씻어. 세포를 분리하여 신선한 혈청 - 함유 세포 배양 배지 ~ 10 ㎖로 급냉 될 때까지 37 ° C에서 몇 분 동안 2 ㎖ 트립신 - 1 부화. 예를 들어, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 경우, 큰 혈관 내피 성장 인자 및 페니실린 또는 스트렙토 마이신이 보충 된 대형 혈관 내피 세포 배양 배지를 사용한다.
    1. (희소 밀도 판 <커브 글라스 당 50,000 세포) 피브로넥틴 - 코팅 된 커버 글라스 위에 세포를 Replate하고 유지 배양액 95 % 습도, 5 % CO 2에서 설정된 항온 및 37 #176; C.
  6. f를 액틴 세포 골격의 미세 구조의 적절한 보존을 위해, 좋은의 버퍼 시약 (27)에 따라 완충 용액을 사용한다.
    1. 예를 들어, 2 × 원액으로 PHEM 버퍼를 준비 (120 mM의 파이프의 50 mM HEPES, 20 mM의 EGTA, KOH 4 밀리미터의 MgCl 2, pH를 7.0) HEPES 6.5 g, EGTA 3.8 g, 190 mg을 용해하여 진한 KOH 용액을 적하하여 7.0로 조정 된 pH를 2 O의 DDH ~ 300 ㎖, 2에서의 MgCl; 이어서, 500㎖의 발 부피를 가지고 DDH 2 O를 추가한다. , 0.22 μm의 필터를 사용하여 버퍼를 소독 4 ° C에서 보관하고, 1 희석 : 사용하기 전에 DDH 2 O 1이 (가)되었습니다.
  7. F - 굴지의 고밀도 라벨과 최상의 결과를 위해 사용 팔로이 딘은 다음과 같이 세포를 수정, 이러한 세포의 replating 후 원하는 시점에서 알렉사 플 루어 647 등의 유기 형광 물질과 결합 :
    1. 잘 가전을 포함하는 각 문화 미디어를 대기음LL 표본. 부드럽지만 신속 0.25 % 트리톤 X-100으로 PHEM 버퍼 0.25 % 글루 타르 알데히드를 포함 따뜻한 (37 ° C)의 추출 고정 제 2 ㎖를 분배. 2 분 - 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션을. 후속 단계는, 고정 제 2 ㎖를 사용하거나 달리 지시되지 않는 한, 당 커브 글라스 버퍼 급냉.
    2. PHEM 버퍼에 2.5 % 글루 타르 알데히드 정착액으로 추출 정착액을 교체하고 샘플 10 품어 보자 - 12 분. 이것과 다음의 단계는 모두 실온에서 수행된다.
    3. 고정 제 대기음 부드럽게는 PHEM 버퍼로 교체. 틸트 및 소용돌이 부드럽게 한 다음 PHEM 다시 씻는다. 두 번 반복합니다.
    4. 원하는 형광 신호를 압도 PHEM 0.1 %의 질량 농도의 NaBH 4 함유 새로 제조 급냉 버퍼 시험편 부화 수 글루 타르 알데히드에서자가 형광을 켄칭. 넘치 거품이 관찰됩니다. 때때로 disl에 부드럽게 샘플 요리를 누릅니다거품을 odge. 10 분 - 그것은 5 품어 보자.
    5. 담금질 버퍼 대기음 부드럽게는 PHEM 버퍼로 교체합니다. 거품을 멀리 취소 몇 번 씻어. PHEM 2 ㎖에 피펫 버퍼는 5 분 동안 어둠 속에서 배양한다하자. 두 번 반복 할 때 PHEM 버퍼의 표본 휴식을 할 수 있습니다.
    6. DDH 2 O. 10 ㎖ - 페트리 접시는 넉넉한 5에 적신 종이 타월의 조각으로 채워 큰 플라스틱을 사용하여 배양을 Phalloidin의의 습도 챔버를 준비 젖은 종이 타월 위에 깨끗한 파라 필름의 큰 시트를 놓습니다.
    7. 때문에 표지 팔로이 딘의 상대적으로 높은 비용, 각 라벨을위한 작은 볼륨을 사용합니다. 고밀도 라벨링 0.3 μM의 농도로 시작한다. PHEM 버퍼에 팔로이 딘 - 알렉사 형석 647를 사용하여 커브 글라스 당 ~ 60 μl를 준비합니다.
    8. 피펫 55 - 습도 챔버 내의 파라 필름 시트 상 팔로이 딘 용액 60 μL. 미세 집게를 사용하면 부드럽게 표본 coverg를 제거젊은 여자. 올바른 세포 함유 얼굴에 유의주의하십시오.
    9. 빠르고 부드럽게 섬세한 흡수 종이의 접힌 부분과 커브 글라스의 가장자리를 터치하여 여분의 버퍼를 멀리 누른 후 파라 필름에 팔로이 딘 솔루션의 드롭에 아래로 향하게 커브 글라스 세포 측면을 배치합니다. 커브 글라스에 의해 갇혀 기포가 없는지 확인합니다.
    10. 습도 실에 덮개를 놓습니다. 주변 광으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸서 챔버, 샘플 4 ℃에서 하룻밤 부화하자. 샘플을 며칠 동안이 상태를 유지할 수있다. 긴 저장을 계획하는 경우 습도 챔버는 습기가 남아 있는지 확인합니다.
  8. 촬영에 앞서, 부드럽게 PHEM 버퍼 2 ㎖ 당 잘 된 새로운 6 웰 플레이트에 가입 커브 글라스 세포 측면을 배치합니다.
  9. 다음의 원액을 사용하여 산소 소기 티올 계 영상 버퍼를 준비한다 : 1 M 글루코스, 1 M의 시스 테 아민 및 100X 포도당 산화 효소 / 카탈라제 효소를 믹스트URE (카탈라아제의 4 mg을하고 텍싱하여 잘 혼합 PHEM 버퍼 100 ㎕, 포도당 산화 효소 10 mg)을 28. 오른쪽 촬상 전에, 1 M 글루코스 용액 75 μL, 1 M 시스 테 아민 용액 30 μL 및 100X 스톡 효소 혼합물의 3 μL를 혼합한다. PHEM 버퍼 300 μL에 볼륨을 조정하고 샘플을 탑재 혼합 후 즉시 사용할 수 있습니다.
  10. iPALM 들어, 사전 세정 # 1.5 커브 글라스 (22 mm 직경)을 사용하여 영상 샘플을 준비한다.
    1. 대안 적으로, 비 점수차 기반 3D-STORM (12) 대신 사용되는 경우, 조립에 도움이 양면 접착 스페이서 유리 슬라이드 (3 "× 1")를 사용한다.
    2. 이미징 샘플을 조립, 부드럽게 잘 버퍼에서 표본 커브 글라스를 제거하는 미세 집게를 사용합니다. 그런 다음, 신속하고 부드럽게 접혀 흡수 종이와 커브 글라스의 가장자리를 터치하여 여분의 버퍼를 멀리 누릅니다.
    3. 깨끗한 렌즈 종이에 위를 향 커브 글라스 세포 측면을 배치합니다. 샘플을 씻어30 배치하여 - 그리고, 샘플에 영상 버퍼의 50 μl를 기울 접혀 흡수 종이로 눌러 여분의 버퍼를 제거합니다.
    4. 헹굼 단계를 몇 번 반복 한 다음 30 배치 - 샘플에 영상 버퍼의 50 μl를. 얼룩은 커브 글라스의 가장자리를 건조 및 건조 지역에 빠른 경화 에폭시의 여러 매우 작은 점을 배치합니다.
    5. 천천히 세포 함유 22 mm의 커브 글라스의 중심 상에 다른 사전 청소 # 1.5 커브 글라스 (일반, 둥근 커브 글라스, 18 mm 직경) 낮 춥니 다. 상기 영상 버퍼는 모세관 작용에 의해 두 coverglasses 젖은하자. 빠른 경화 에폭시의 작은 점은 모두 coverglasses을 준수해야합니다.
    6. 부드럽게 골고루 압력을 확산 접힌 흡수 종이를 사용하여 조립 샘플에 키를 누릅니다. 심지어 샘플 셀 얇고 (<15 μm의)를 만들 수있는 충분한 압력을 사용하지만, 세포를 분쇄 정도로 많지 않다. 뉴턴 링의 패턴을 관찰함으로써 적절한 두께 게이지. 또한,이 일을 수행해야합니다EP 부드럽게 공기 방울을 최소화한다. 필요한 경우, 사전에 빈 coverglasses 여러 번 연습.
  11. 용융 바셀린 - 라놀린 - 파라핀으로 샘플을 밀봉 (29) (VALAP가, 주식, g 바셀린, 라놀린, 파라핀 각각 100에서 준비 함께 용융), DDH 2 O와 함께 밀봉 된 샘플을 씻어, 압축 공기로 바람을 불어 건조. 샘플은 지금 이미징을위한 현미경에 장착하기위한 준비가되어 있습니다.

2. 샘플 배치 및 iPALM 정렬

  1. 샘플 홀더의 제거를 허용하도록 상향 스프링 상부 대물 렌즈를 이동. 샘플 홀더에 단계 1.10에서 제조 된 밀봉 된 시료를 놓고 여러 개의 작은 희토류 자석으로 고정합니다. 촬상 샘플의 양측에 액침 오일을 적용한다. 광학 경로로 다시 샘플 홀더를 놓고 조심스럽게 상단 대물 렌즈를 내립니다.
  2. 여기 레이저를 켭니다. 합니다 (전자 배가 전하 결합 소자에 EMC를 돌려프레임 전송 모드 CD) 카메라.
    1. 적절한 방출 필터에 돌립니다. 상단 빔 경로 (그림 1A)를 차단하고 바닥 빔 경로를 열 수있는 기계식 셔터를 활성화합니다. 압전 액추에이터를 사용하여 조금씩 번역에 의해 초점에 바닥 대물 렌즈를 가져옵니다.
    2. 기점 초점이되면, 하부 빔 경로를 차단하는 동안 상부 빔 경로를 열어 유사한 방법으로 초점 가기 대물 렌즈를 가져온다. 최적의 초점의 컴퓨터 디스플레이의 기점의 폭을 모니터링합니다.
  3. 적절한 자기 중심, 개방 상단 양쪽과 하단 빔 경로하십시오. 바닥 목적 초정밀 나사 세트의 쌍을 사용하여 일정하게 유지되는 동안 기점 이미지 이상적 하나의 화소 내에서, 가능한 한 밀접하게 중첩 될 때까지 수동으로 가기 대물 렌즈를 조정한다.
    1. 그 후, 미세 조정을 수행 EMCCD 픽셀의 10 분 이내 단계의 기점 이미지가 2.3 중첩되도록. 상단 조정제어 소프트웨어를 통해 2 축 압전 미러 마운트 모두 대물 렌즈를 유지하면서 바닥 반사 미러 상수. 프로세스를 안내하는 LCD 화면을 통하여 위쪽의 기점과 하단 대물 뷰의 중심을 비교한다.

iPALM 설치 3. 교정

주 : 형광 방출이 간섭하기 때문에 간섭 iPALM에서 관찰 될 때까지, 경로가 정상으로 길이와 하부 목적이 몇 마이크론 내에서 서로 가까이 있어야한다. 이는 다음과 같이 달성 될 수있다 :

  1. 카메라가 연속적으로 스트리밍 양쪽 상부 및 하부 빔 경로 개방에 레이저를, 400 nm의 크기에 걸쳐 연속 Z 축 진동에 대한 제어 소프트웨어에 의해 생성되는 정현파 전압 파형을 사용하여 샘플 홀더 Z-피에조를 발진 .
  2. 사실을 활용하면, 때 최적의 정렬 밖으로 것을 기점 강도는 t에 작은 변화그 발진 수동으로 인해 원하는 단일 광자 간섭 효과 위아래 기점 진동의 강도까지 전동식 빔 스플리터 조립체 번역. 이 광로 길이의 근접 매칭을 의미한다. > 10의 산곡 비는 최적의 경우 (도 1D)으로 달성 될 수있다.
  3. 간극과 경사 각도를 미세 조정할 작은 단계 빔 스플리터 조립체의 하부 미러 조정 각 표면에서의 진폭 및 위상 모두가 필드에 걸쳐 가능한 한 균일되도록. 800 nm의 이상 8 나노 Z-단계에서 샘플을 변환하여 빔 스플리터 잘 정렬을 수행합니다.
    1. 이러한 카메라 #의 발진 단계 1 상대 카메라 2가 최대화되도록, 이상적으로는 작은 스텝 빔 스플리터 조립체 내의 하부 미러의 높이 위치 및 기울기를 조정하여 3 - 카메라 # 1 사이의 기점 강도 모니터링 120 ° (그림 1B-D)에서.
    2. 초기되면정렬이 완료되면 인근 이미지와 여러 기점에게 모두 셀이보기의 적절한 필드를 검색하기 위해 샘플을 번역합니다. 미광 주위 교란을 차단하는 시스템 주위에 인클로저를 놓습니다. 이미징 영역이 발견되면, 다시 단계 34의 절차를 수행하고, 주요 인터페이스에서 "샘플 피에조 위치 VS 교정 스캔을 취득"명령을 사용하여 후속 Z 좌표 추출에 사용하는 보정 곡선을 기록한다.

4. 데이터 수집

  1. 원하는 영역이 발견되고, 검량선이 획득되면, 소프트웨어에 해당하는 파일명을 입력한다. 상단과 하단 빔 경로를 모두 엽니 다. 최대로 642 나노 레이저의 여기 전력을 증가. 알렉사 형석 647 들어 스위치 오프 형광의 초기 기간 (도 2A)를 필요로 할 수있다.
    1. 시 때까지 5 분, 또는 필요 이상 동안 일정한 642 나노 미터 여기에 노출깜박 ngle 분자 (그림 2B) 관찰된다. 이 소프트웨어는 수집 과정에서 405 nm의 포토 활성화 자동 증가를 허용한다. 필라멘트 기능을 명확하게 볼 수 있도록하기위한 포착 프레임의 큰 숫자는 일반적으로 필요합니다 (> 50,000 프레임). 준비가되면, 메인 인터페이스에서 명령 "시작 iPALM 취득"을 사용하여 RAW 이미지 세트의 인수를 시작.
  2. (도 2b의 예를 참조), 필요에 따라 취득하는 동안 조정은 405 나노 미터의 레이저의 세기를 조절하여 photoactivation 레벨 적절한 점멸 밀도를 유지한다.
    참고 취득이 완료되면, 소프트웨어는 자동으로 적절한 바이너리 포맷으로 화상 파일을 변환한다. 연산 서버의 데이터 저장소는 데이터가 직접 상기 처리가 복사 될 수 있도록, 네트워크 드라이브로 장착된다.

5. 데이터 처리및 분석

  1. 모든 단일 분자뿐만 아니라 기점 11,15,23위한 최적의 매개 변수를 추출하는 사용자 정의 개발 소프트웨어를 사용하여 현지화 분석을 수행합니다. 이것은 X, Y 좌표, 또한 검량선을 분석에 사용되어 강도뿐만 아니라 산출한다.
    1. 명령을 사용하여 단계 3.5에서 획득 한 원시 교정 데이터를 가져 오기 단일 분자 현지화을 수행하기 위해 '파일'메뉴에서 '봉우리 여러 레이블의 압축을 풉니 다 ". 초기 위치 파악 분석에 따라, 하나의 카메라 번호로부터 얻어지는 좌표 - (3)은 각각 적색, 녹색 및 청색 채널에 존재하고, 아래의 명령을 사용하여 추가 분석 "(.sav) IDL로 처리 저장"을 저장할 수있는 " 파일 "메뉴를 선택합니다.
  2. 카메라 # 1에서 데이터를 가져 - (즉, 커버 슬립에 포함 된 형광 기준점을 사용하여 등록에 3 중앙 이미지의 범위를 제공하기 위해 여러 밝은 기준점을 선택 예를 들면,"영상의 변환 '메뉴에서'앵커의 기준점 포인트"명령을 사용하여 그림 1B). 카메라 # 2 레지스터에 카메라 # 1과 # 3을 가져올 것이다 회전과 스케일링 행렬을 계산하는 단계 5.1의 밝은 기점에서 얻은 3 - 현지화가 카메라 # 1에서 좌표의 트리플 세트를 사용합니다. 기점 충분히 많은 수, 고차 다항식 휘어짐이 더 적합 행할 수있다.
  3. 합산 된 원시 데이터를 얻기 위해 함께 3 - 변환 매트릭스가 계산되면, 카메라 # 1의 원시 데이터를 변환. y 좌표와 합산 된 원시 데이터에 각 카메라 채널의 상대적 기여도를 결정하기 위해,보다 정확한 X를 산출하기 위해 현지화 분석의 또 다른 라운드를 수행; 명령이 "이미지 변환"메뉴에서 "원시, 저장 및 저장 합계 (.DAT)를 변환"를 사용합니다. 이 강도 비는 Z 좌표 정보가 포함되어 있습니다.
  4. 밝은 기준점을 선택하고 Z- 수행교정은 "특수 기능"메뉴에서 "작업을 Z 좌표"를 클릭하여 팝업 대화 상자에서 기능 "테스트 바람 포인트 3D"를 사용하여 피팅. 이 검량선을 결정하기 위해 3 개의 카메라 채널의 명암도 3 정현파 함수에 적합 할 것이다. 교정 파일은 메인 데이터 세트에 대한 자세한 사용을 위해 저장됩니다.
  5. 검량선의 품질을 테스트하기 이전에 23 바와 같이 추출 Z 좌표를 수행한다. 교정 데이터 세트가 Z-위치에서 선형 스위프로 촬영하고 있기 때문에 잘 보정 시스템에서 잘 작동 기점를 들어, Z 좌표는 선형 적으로 확장해야합니다. 또한, 모든 기준점의 z 위치는 동일한 기울기로 확장한다.
  6. 양호한 보정이 획득되면, 단계 5.1-5.3에서 설명한 동일한 절차에 따라, 단계 4에서 취득 된 원 화상 데이터 세트 지역화 및 변환 분석을 수행한다. 완료되면, 5 단계에서 보정 파일을로드합니다.(4) 수행 "WND 파일을 선택"과 "특수 기능"메뉴에서 "작업을 Z 좌표"를 클릭하여 팝업 대화 상자에서 "Z는 좌표 추출"기능을 사용하여 추출 Z는 좌표입니다.
    주 : 상기 취득 시간이> 15 분이기 때문에, 기계적 드리프트 예상한다.
  7. X에서 드리프트 보정을 수행하려면, y를, 현지화 좌표에서 밝은 기준점을 선택합니다. 이 기준점은 모든 프레임에 존재해야한다. 그런 다음, "이미지 변환 '메뉴에서'가이드 스타 / 쓰기 테스트"기능을 사용하여 (그림 3A-B) 등록에 다시 동일한 프레임 내에서 다른 모든 좌표를 정렬 기점의 드리프트를 y 좌표, X를 사용합니다. Z 좌표 등록은 "특수 기능"메뉴에서 "작업을 Z 좌표"를 클릭하여 "테스트 가이드 스타"팝업 대화 상자에서 "가이드 스타를 쓰기"기능에 액세스하여 유사하게 수행 할 수 있습니다.
  8. 샘플이 약간의 경사를 나타내고있는 바와 같이, "링크를 클릭 팝업 다이얼로그"XYZ 틸트 삭제 '기능을 사용하여 레벨을 설정해야 할 평면을 정의하는 세 참조 점의 X, Y, Z 좌표를 제공하여 틸트 보정을 수행 특수 기능 "메뉴의"에서 "작업을 Z는 좌표입니다.
  9. 드리프트 및 기울기 보정 이후, 현지화 좌표를 저장합니다. 메인 인터페이스의 "렌더링"명령을 사용하여 추가 분석 (그림 4A-D)에 대한 슈퍼 해상도 이미지를 재구성. 컬러는 Z 좌표를 나타 내기 위해 사용될 수있다. 선택적으로, 선택 영역의 측면도도 표현 될 수있다. 지역화 좌표는 더 정량 텍스트 파일로 내보낼 수 있습니다, 또는 재구성 된 이미지는 .tif 파일로 저장할 수 있습니다.

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결과

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iPALM 중요 요건은 광학 시스템의 정렬, 등록 및 교정된다. 추출 Z 좌표에 대한 이들 3 방향 빔 스플리터 내에서 필요한 적절한 간섭을 보장하기 위해 필요하다. 지속적인 모니터링을 사용하려면, 형광의 일정 지점 소스가 필요합니다. 이것은 형광 금 또는 그 포토 루미 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR)에서 발생하는 이중 금속 나노 입자 (23)를 사용하여 달성 될 수있다. 그들은 조명에 따라 안정적인 단일 다이폴 안테나의 역할을 일반적으로 5 지역화 할 수 있습니다 - 10 nm의 정확도. 이들 시판의 나노 입자는 채도가없는 (도 1b)의 형광체와 기점 모두가 EMCCD 카메라의 여진 강도 및 게인 설정 유사한 이미지화 될 수있는 대부분의 단일 분자 형광의 범위 내의 휘도 레벨을 방출한다. 또한,이 기점 크게 FAC도기점의 외관상의 폭은 상기 포커스 조정시에 모니터링 될 수있다 ilitate 포...

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토론

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도 1a에 도시 된 바와 같이 iPALM의 광학계는, 4 π 이중 대향 대물 설계에 기초한다. 표 1에 이전 (23) 설명 및 나열된 설정은 사용자 정의 가공 및 상업 모두 광학 기계 부품을 사용하여 구성된다. 우리의 설치뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI)는 Janelia 연구 캠퍼스에서 고급 이미지 센터에서 과학계에 액세스 할 수있는 시스템을 호스팅합니다. 전체 기계 도면, 제어 회로도 및 소프트웨어의 경우, 독자는 자세한 내용은 HHMI에서 랄드 헤스에 문의하는 것이 좋습니다. F 액틴을 시각화 iPALM뿐만 아니라 다른 단일 분자 파악 현미경 방법을 사용하는 주요 장점은 EM의 일반적 거친 샘플 처리를 필요로 기술 힘들고 준비, 숙련 된 실무자 3,23 비교 샘플 준비의 상대적 용이성 . AdditionallY는 형광 EM 어려운 남아 멀티 채널 영상에 자연스럽게 의무입니다. ...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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YW 및 PK는 감사 PK (NRF-NRFF-2011-04 및 NRF2012NRF-CRP001-084)에게 수여 싱가포르 국립 연구 재단에서 자금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 인프라 지원을위한 MBI 개방 실험실과 현미경의 핵심 시설을 주셔서 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
광학 테이블Newport, CARS4000iPALM, 4 Newport Stabilizer 진동 차단기
에 설치 광학 테이블Newport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055출력 = 100 mw
레이저 -561Newport, CA1168931출력 = 200 mw
레이저 -488Newport, CA1137970 출력 전력 = 200 mw
레이저 -405Newport, CA1142279출력 전력 = 100 mw
광대역 유전체 미러Thorlabs, NJBB1-E02레이저 결합기
이색성 빔 스플리터Semrock, NYLM01-427-25
음향 광학 조정 가능 필터AA Opto-Electronic, FranceAOTFnC-VIS-TN
Linear 편광판Newport, CA05LP-VIS-B
베이스 플레이트로컬 워크샵맞춤형
터닝 미러(22.5°C;)Reynard Corpporation, CA맞춤형22.5°; 미러
전동 광학 마운트New Focus, CA8816
전동 XYZ 변환 스테이지Thorlabs, NJMT3/M-Z6샘플 홀더
T-Cube DC 서보 모터 컨트롤러Thorlabs, NJTDC001
피에조 위상 시프터Physik Instrumente, 독일S-303.CD
대물 렌즈니콘, 일본MRD01691대물렌즈. Apo TIRF 60X / 1.49 오일
번역 스테이지새로운 초점, CA9062-COM-M
피코 모터 액추에이터새로운 초점, CA8301
로터리 솔레노이드 / 셔터DACO 기기, CT5423-458
3 방향 빔 스플리터록키 마운틴 기기, CO맞춤형빔 스플리터
피에조 Z / 팁 / 틸트 스캐너Physik Instrumente, 독일S-316.10
전동 5축 틸트 얼라이너New Focus, CA8081
Picmotor 이더넷 컨트롤러New Focus, CA8752
피에조 컨트롤러/증폭기/디지털 작동 모듈Physik Instrumente, 독일E-509/E-503/E-517
대역 통과 필터Semrock, NYFF01-523/20필터
대역 통과 필터Semrock, NYFF01-588/21
대역 통과 필터Semrock, NYFF01-607/30
대역 통과 필터Semrock, NYFF01-676/37
노치 필터Semrock, NYNF01-405/488/561/635
전동 필터 휠(컨트롤러 포함Thorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, UKDU-897U-CSO-#BV
카메라 및 동기화 제어를 위한 3세트 데스크탑 컴퓨터DellPrecision T3500PC,
Hestzig, VA600-100AuF커버슬립. 다양한 밀도 및 스펙트럼을 사용할 수 있는 기준 표시
FibronectinMillipore, MTFC010
파라포름알데히드전자 현미경 과학, PA15710고정.16%
글루타르알데히드전자 현미경 과학, PA1622025%
트리톤 X-100시그마 알드리치, MOT8787
HUVEC 세포생명 과학, CAC-015-10C
매체 200생명 기술, CAM-200-500
대형 혈관 내피 인자Life Technologies, CAA14608-01
Dulbecco의 인산염 완충 식염수14190367
페니실린/스트렙토마이신15140122
트립신/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPES시그마 알드리치, MOP1851PHEM
HEPES1베이스, 말레이시아BIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287염색
붕소화붕소나트륨(NaBH4)Sigma aldrich, MO480886담금질
포도당1염기, 말레이시아BIO-1101이미징 버퍼
포도당 산화 효소시그마 알드리치, MOG2133
카탈라아제시그마 알드리치, MOC9322
시스테아민시그마 알드리치, MO30070
에폭시Thorlabs, NJG14250
바셀린시그마 알드리치, MO16415샘플 밀봉
라놀린시그마 알드리치, MOL7387
파라핀 왁스Sigma aldrich, MO327204
침수 오일전자 현미경 과학, PA16915-04이미징. 카질 HF형
) 기준 샘플 준비를 사용한 4세트

참고문헌

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  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279(2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

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