인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

요약

이 작업은 인간 혈액 샘플에서 NK(Natural Killer) 세포 수와 NK 세포 독성을 정확하고 빠르게 측정하기 위한 고급 워크플로우를 설명합니다.

초록

NK 세포는 NK 세포 독성 세포 기능에 대한 외부 간섭의 영향을 결정하기 위해 널리 사용되는 척도이다. 그러나,이 분석의 정확성 및 재현성 때문에 사용자의 오류로 인해 또는 실험 조작에 NK 세포의 감도 역시 불안정한 것으로 간주 될 수있다. 이러한 문제를 제거하기 위해 최소로 줄여 워크 플로우에 설립되었으며 여기에 표시됩니다. 우리는 선수에서, 다양한 시점에서 혈액 샘플을 얻어 설명하기 위해 (N = 4) 운동의 강렬한 한판 승부에 제출 된 그. 첫째, NK 세포를 동시에 확인하고 직접 전체 혈액에서와 같은 작은 하나 밀리리터에서, CD56 태그 및 자기 기반의 정렬을 통해입니다. 정렬 된 NK 세포는 시약 또는 상한 항체의 제거됩니다. 이들은 혈액 밀리리터 정확한 NK 세포 수를 설정하기 위해 계산 될 수있다. 둘째, 분류 NK 세포 (이펙터 세포 또는 E)를 3,3'- Diotade와 혼합 될 수있다각 이벤트의 시각화 및 위양성의 제거를 허용하는 촬상 유동 세포 계측기를 사용하여 E 비율 분석 : 5 T : cyloxacarbocyanine 과염소산 (DIO)은 분석 최적 1의 K562 세포 (표적 세포 또는 T)를 태그 또는 (예 : 이중선 또는 이펙터 세포와 같은) 위음성. 이 워크 플로는 약 4 시간에 완료, 심지어 인간의 샘플 작업을 매우 안정적인 결과를 허용 할 수 있습니다. 가능한 경우, 연구 팀은 인체에서 여러 가지 실험적인 개입을 테스트, 데이터의 무결성을 손상시키지 않고 여러 시점에 걸쳐 측정을 비교할 수 있습니다.

서론

자연 살해 세포는 선천성 면역계의 필수 요소이다. 그들은 매우 조절 동안, 인식하고 세포 간 접촉을 통해 사전 활성화 ^일없이 비정상 세포를 제거하는 기능을 갖는다. 따라서, 그들은 감염에 대한 방어의 빠른 라인을 형성한다. 특히 심한 운동은, 일시적으로 면역 시스템 ^{2, 3, 4, 5를} 누르는 것으로 나타났다. NK 세포가 효과적으로 질병 향상된 감도의 창을 생성이 효과 ^{4, 6, 7,} 특히 쉽다. 따라서, 개입의 연구는 전, 중 또는 NK 세포 기능에 미치는 영향을 줄이는 목적으로 강렬한 운동 후하는 운동 선수 후 대회의 복지에 대한 특별한 관심입니다.

그러나, 이러한 개입의 연구는 다양한 요인에 의해 복잡하게된다 : NK 세포는 백혈구 실의 약 1 %에서 ⁸....

프로토콜

참고 : 모든 혈액 수집 절차는 애팔 래 치아 주립 대학 (ASU) 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 규정 된 지침에 따라 실시 하였다.

1. 전체 혈액 컬렉션

1. 공인 phlebotomist는 세계 보건기구 (WHO)의 가이드 라인에 따라 혈액을 채취 있습니다.
2. 디 에틸렌 디아민 산 칼륨을 함유 한 4 mL의 혈관 (K ₂ EDTA)으로 혈액을 채취. 제조업체의 지시에 따라 혈관을 전환. 분리 될 때까지 벤치 탑 로커에 실온에서 혈관을 유지합니다.

DIO 표지 된 표적 세포의 제조 2

1. K562 세포의 성장 완료 Iscove 개변 둘 베코 미디어 세포의 상태를 확인하기 위해 검정에 앞서 몇 주 동안 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 (IMDM). 정광을 조정3 × ¹⁰⁵ 세포로 세포의 이온 / ㎖ 매일 세포의 완료를 통해 카운트 세포 후속 통로. 매 2 ~ 3 일 전체 미디어의 변화를 수행합니다.
2. 혈구 1 : 분석 당일 1을 이용하여 세포 수를 수행한다.
   1. K562 플라스크....

결과

NK 세포 수의 결정
전혈에서 NK 세포 수 무거운 실행의 효과는도 2에 기재된 운동 프로토콜을 사용하여 측정 하였다. 혈액 샘플은 초기 채혈 후 최종적으로 24, 48 시간을 1.5 시간 운동 후, 즉시 운동 후, 운동 전에 그려진 하였다. 전혈 밀리리터 NK 세포의 농도는 각각의 러너 (도 3A)에 대한 각 타임 포인트에 대한 평균 (도 3b)상에서 측정 하였다.

우리의 결과 (도 3a) 1 2 주자 쇼 4 본 직전 천천히 24 및 48 시간 후에 정상으로 복귀 급감 하였다 운동 후 NK 세포 수의 약간의 증가와 유사한 패턴. 이러한 경향은 특히 주자의 그룹에 대한 NK 세포의 평균 플롯으로 표시가 있지만 유의 한 차이에서 있었.......

토론

본 연구에 기재된 방법은 직접 (특히이 경우, 장시간 운동) 자극에 응답하여 개인의 NK 세포의 특이 적 활성을 측정한다. 일반적으로, NK 세포는 마커의 조합을 사용하여 분류 밀도 구배 또는 셀을 사용하여 하나의 혈액으로부터 분리된다. 그들은 시간이 걸리는 다수의 조작을 수반 한 사용자 심하게 의존하는 이러한 방법이 널리 사용되지만, 그들은 여러 단점을 가지고있다. 그 결과, 과도한 스트레스, 또는 동일한 실험에서 실험 실험 증가 변화 될 수있는 격리 된 NK 세포에 배치된다. 본 논문에서는 자기 기반 격리를 사용하는 프로토콜을 설명했다. 혈액 또는 NK 세포의 조작을 최소화하면서이 개인의 전혈에서 NK 세포의 높은 숫자의 신속하고 신뢰성있는 정렬을 허용한다.

이 방법은, 샘플이 드문 드문 인간 연구에 특히 적합하지만,너무 많은 샘플을 함께 처리 할 필요가있을 때 역설적으로의 방법은 매우 어렵다. 실제로 세포 독성 분석을위한 획득 창은 경험에 많아야 한 번에 5 샘플로 변환.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
K-562 림프모세포	ATCC	CCL-243
Iscove의 변형된 Dulbecco's Media	ATCC	30-2005	고포도당, L-글루타민, HEPES 포함, 멸균 여과
알파 최소 필수 매체	ATCC	CRL-2407	리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드가 없지만 2mM L-글루타민 및 1.5g/L 중탄산나트륨
판 블루 용액 0.4%	Amresco	K940-100ML	조직 배양 등급
프로프리듐 요오드 염색 용액	BD Pharmingen	51-66211E
Vybranto DiO 세포 라벨링 솔루션	Vybranto	V-22886
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
autoMACS 세척 버퍼	Miltenyi Biotec	130-092-987
autoMACS 열	Miltenyi Biotec	130-021-101
전혈 CD56 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-090-875
ImageStream X Mark II 이미징 유세포분석기	EMD Millipore
Speedbeads	Amnis Corporation	400030
0.4-0.7% 차아염소산염(살균기)	VWR	JT9416-1
Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546929
70% 이소프로판올(Debubbler)	EMD Millipore	1.3704
D-PBS(Sheath fluid)	EMD Millipore	BSS-1006-B (1X)	칼슘 또는 마그네슘 없음
INSPIRE Software	EMD Millipore		Version Mark II, 2013년 9월
아이디어 응용 소프트웨어	EMD Millipore		버전 6.1, 2014년 7월

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