방법 논문

3D 인쇄 기술을 활용하여 조직학과 MRI를 병합하기 : 두뇌를위한 프로토콜 단면

15.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54780

⸱

2016년 12월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 전반적인 목적은 정확하게 정의 된 3D 인쇄 뇌 홀더 및 슬라이서 박스의 생성을 통해 조직학 섹션 자기 공명 영상 (MRI) 이미지 볼륨을 정렬하는 것이다.

초록

MRI(Magnetic Resonance Imaging)는 전체 조직 부피를 3차원으로 샘플링하여 거시적 규모로 정상 조직과 비정상 조직을 구분할 수 있습니다. MRI는 조직 이상을 감지하는 데 매우 민감한 도구이지만, 신호 변화와 근본적인 병리학적 과정의 연관성은 일반적으로 간단하지 않습니다. 예를 들어, 중추 신경계에서 염증, 탈수초화, 축삭 손상, 신경교증 및 신경 세포 사멸은 모두 MRI에서 유사한 소견을 유도할 수 있습니다. 따라서 MRI 스캔의 해석은 상황에 따라 달라지며, 따라서 방사선학적-조직병리학적 상관관계가 가장 중요합니다. 불행히도, 뇌 조직의 전통적인 병리학적 절편은 종종 부정확하고 일관성이 없기 때문에 조직학적 절편과 MRI의 비교가 복잡합니다. 이 논문은 영장류의 뇌 조직을 정확하게 절단하여 조직학과 MRI를 정확하게 일치시킬 수 있는 새로운 방법론을 제시합니다. 이 기사에 설명된 자세한 프로토콜은 연구자가 3D 프린팅 뇌 슬라이서 제작에 의존하는 이 방법을 적용하는 데 도움이 될 것입니다. 약간 수정하면 인간을 포함한 다른 종의 뇌에 쉽게 구현할 수 있습니다.

서론

생체 내 MRI는 거시적 수준에서 조직 무결성에 대한 비침습적이고 민감한 측정을 제공합니다. 생체 내에서 관찰되는 MRI 신호 강도의 변화는 현재 진행 중인 많은 임상 시험에서 결과 측정입니다. 1 MRI를 통해 보이는 강도 변화는 전체 뇌의 맥락에서 이상 영역을 식별할 수 있지만, 병리학적 과정을 구별할 만큼 충분히 특이적이지 않은 경우가 많습니다. 이것은 특히 여러 병리학을 포함하는 동적 과정에 해당됩니다. 예를 들어, 다발성 경화증(MS) 또는 그 동물 모델에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 염증, 부종, 미엘린 분해, 축삭 파괴, 신경교증 및 신경 세포 사멸이 겹칩니다. 2, 3 기저 병리학에 대해 필요한 특이성을 얻으려면 MRI로 식별된 비정상 조직의 조직학에 대한 지식과 함께 컨텍스트를 고려해야 합니다.

그러나 잘 통제된 동물 실험에서도 조직학을 생체 내 MRI와 일치시키는 것은 여러 가지 이유로 근본적으로 어렵습니다. 첫째, 조직학 절편과 MRI 사이의 차원 척도의 차이는 몇 자릿수의 크기입니다. 4 둘째, 적절한 비교를 위해 MRI 절편 평면의 방향은 절단 시 뇌 조직의 절단면과 일치해야 합니다. 뇌의 모양으로 인해 뇌가 평평한 표면에 있을 때 일관되게 직선적이고 정확하게 절단하는 것은 매우 어렵습니다. 셋째, 잠재적으로 작은 관심 영역(병변, 종양 등)에 비해 뇌의 크기가 크면 병리학자가 조직을 처리하는 데 "건초더미 속의 바늘" 시나리오가 생성됩니다. 넷째, 표적 조직이 발견되더라도 일반적으로 원본 MRI 데이터와의 연관성을 사실상 불가능하게 만드는 방식으로 처리됩니다. 마지막으로, 뇌 조직의 전통적인 병리학적 절편은 종종 부정확하고 일관성이 없어 조직학적 절편과 MRI 이미지 간의 비교를 더욱 복잡하게 만듭니다.

이러한 문제를 극복하기 위한 이전의 시도는 변형 알고리즘을 사용하여 데이터를 공동 등록하거나 조직 내부 또는 주변에 기준으로 기준 마커를 배치하는 데 의존했습니다. 5, 6, 7, 8 전자의 접근 방식은 데이터 형식, 이미징 아티팩트 및 조직 처리로 인한 변화로 인해 합병증에 특히 취약한 복잡한 계산 모델을 필요로 합니다. 4 반면에, 후자의 접근법은 조직 자체를 오염시키거나 달리 해를 끼칠 가능성을 내포한다. 9

개

여기에 설명된 접근 방식은 생체 내 MRI와 조직학 사이의 격차를 해소하기 위해 사후 MRI를 사용하여 양식 간의 전환을 개선합니다. 사후 MRI는 생체 내에서 달성할 수 있는 것보다 더 높은 해상도로 뇌의 3차원(3D) 이미지를 제공하며, 더 나아가 형태학적으로 정확한 뇌 표면 모델을 생성하는 데 필요한 데이터를 제공합니다. 그런 다음 이 디지털 모델을 사용하여 뇌를 위한 3D 프린팅 맞춤형 홀더를 만들 수 있습니다. 브레인 홀더는 신중한 위치 지정을 통해 MRI 중심의 정밀한 뇌 절편을 가능하게 하여 복잡한 수학적 알고리즘의 필요성을 줄이고 표적 샘플링을 위해 특정 영역에 집중할 수 있습니다.

우리 연구실은 최근 인간10 및 마모셋 뇌에 대한 사후 MRI 및 3D 프린팅 기술을 사용하여 맞춤형 뇌 홀더 및 슬라이서를 만드는 새로운 방법을 도입했습니다. 4 이 두 가지 방법을 통해 연구 환경에서 MRI와 조직학 간의 보다 정확한 상관관계를 확인할 수 있으며, 궁극적으로 MRI 이상의 기저에 있는 특정 병리학을 더 깊이 이해할 수 있습니다. 생체 내에서 시간이 지남에 따라 뇌를 반복적으로 샘플링하는 신중하게 설계된 실험은 병리학 해석을 위한 맥락을 제공할 수 있으며, 이는 다시 MRI 해석에 특이성을 더할 수 있습니다. 여기에서는 인간이 아닌 영장류, 설치류 또는 인간에서 파생된 모든 뇌 조직에 적용할 수 있는 통합된 프레임워크에서 수정된 프로토콜을 제시합니다. 마모셋 단면화에 대한 자세한 지침과 해당 비디오를 제공합니다. 전체 프로토콜은 모든 유형의 뇌에 적용되지만, MRI 획득 및 조직 크기의 차이와 특정 뇌 유형을 다룰 때 직면하는 문제로 인해 처리되는 뇌의 유형에 따라 접근 방식에 약간의 차이가 있습니다. 이 프레젠테이션에서 "human"이 포함된 섹션은 인간 뇌에 특화된 프로토콜의 차이를 나타냅니다.

프로토콜

모든 동물 처리 및 여기에 설명 된 절차는 신경 장애의 국립 연구소 및 뇌졸중 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 두뇌는 EAE 개발을 유도 비단 마모 셋 (마모 셋의 jacchus)에서 수집 하였다. (11) 뇌 3 주와 4 % 파라 포름 알데히드 transcardial 관류 안락사 1 년 후에 10 % 포르말린에 보관 하였다.

1. 사후 MRI 준비 및 취득

  1. 비단 원숭이의 뇌
    1. ~ 30 불소계 오일, 파라핀 ㎖, 및 비단 원숭이 뇌를 거즈와 워크 스테이션, 50 mL의 원심 분리 튜브 작은 주걱을 준비한다.
    2. 20 ml의 마크에 불소 오일과 거즈와 튜브를 입력합니다. 길을 따라 기포를 제거하기 위해 압축 거즈.
    3. 종이 타월로 뇌의 표면에서 부드럽게 건조 포르말린. 의 아래쪽으로 정면 극 뇌를 삽입튜브. 조심스럽게 자신의 위치를 ​​수정하는 측면 주위에 더 거즈를 사용하여 튜브에 뇌를 고정합니다. 추가 MRI 스캔 설정에 대한 MRI 뇌 크래들을 생성하는 방법에 대한 보충 부 (11)를 참조하십시오.
    4. 거즈와 불소 오일 튜브의 나머지 부분을 채 웁니다. 조심스럽게 길을 따라 기포를 제거합니다. 뚜껑을 고정하고 파라핀으로 튜브를 밀봉.
    5. 반구 균열에 맞춰 뚜껑을 표시합니다. 종이 타월에 튜브를 싸서 마크 최고 센터와 코일에 삽입합니다.
    6. 2D 에코 T2 스핀 취득. 파라미터는 표 1에 나타내었다.
    7. Mipav에서 10 해부학 150 미크론 T2-weigted 인수를 열고 6 번째 인수에 등록합니다.
      참고 : 등록은 파월의 호출 브렌트의 검색 알고리즘과 자유의 9도, 윈도 윙 싱크 보간, 정규화 상호 상관 비용 함수와 최적화 된 자동 등록 3.5D 알고리즘입니다. 회전은 10에서 샘플링했다6; 1 °를 증가 5도를 증가 거친 회전 및 미세 회전과 -10 ° ~. 그런 다음 등록 된 이미지를 평균 : 유틸리티, 이미지 계산기 - 대량 이미지, 평균.
  2. 인간의 두뇌
    1. 중뇌의 수준에서 잘라을 사용하여 뇌간에서 전뇌를 분리합니다. 10 반구도 중간 선 아래로 절단하여 분리 할 수있다.
    2. 일단 반구형 돔 타단 스파우트 원통형 튜브 전뇌를 배치.
    3. 주둥이를 통해 불소 오일 튜브를 입력합니다. 주둥이를 통해 ~ 30 분을 부드러운 흡입을 사용하여 기포를 제거합니다.
    4. 3D T1-MPRAGE 획득. 파라미터는 표 1에 나타내었다.

2. 뇌의 표면을 추출 : Mipav 7.2

  1. 관상 방향으로 MRI를 엽니 다.
  2. , 변환, 리 샘플을 알고리즘, 변환 도구를 선택합니다. 사용자 정의 크기를 선택하고 ISOT에 리샘플링ropic 복셀 : 0.1 × 0.1 × 0.1 mm. Brain_MRI_Resampled으로 리샘플링 MRI를 저장합니다. 인간 : 리 샘플이 복셀에게 0.3 × 0.3 × 0.3 mm를 등방성합니다.
  3. 알고리즘, 필터 (공간), 비선형 노이즈 감소를 선택합니다. 확인을 클릭, 기본 설정을 사용합니다.
  4. 표시 룩업 테이블을 선택하고 이중 임계 버튼을 클릭합니다. 전체 뇌를 충당하기 위해 그래프에 슬라이더를 드래그합니다.
  5. 알고리즘, 분할, 임계 값, 임계 값 사용하여 최소 / 최대를 선택합니다. 은 "하한"상자에 (단지 규모 이하) 강도 그래프의 왼쪽 하단 모서리에있는 값을 입력합니다. 출력 이미지 유형에 "이진"를 선택하고 취소 "반전 임계 값을."
  6. 알고리즘, 형태 학적을 선택, 구멍을 채 웁니다. "2.5D에서 프로세스를."확인
  7. 이것은 전체 뇌의 MRI 때문에 충전 될 필요 후뇌와 외피 사이에 빈 공간이 존재한다. 인간의 두뇌 :이 단계를 건너 뜁니다.
    1. 라인 VOI를 사용하여 연결 그려가장 외측 지점에서 뇌의 양쪽 후뇌 피질 사이. 뇌를 통해이 작업을 계속합니다.
    2. VOI, VOI 변환, 바이너리 마스크를 모두 선택합니다. 선택 유틸리티, 이미지 계산기. 선택 또는 운영자 드롭 다운 메뉴에서 뇌 마스크를 선택합니다. "대상 이미지 유형을 홍보"를 선택
    3. 알고리즘, 형태 학적을 선택, 구멍을 채 웁니다. 확인 "2.5D의 프로세스"
  8. Brain_Model.nii으로 바이너리 마스크를 저장합니다.
  9. 알고리즘, 추출면 (행진 큐브)를 선택합니다. 선택 마스크 이미지, Brain_Model.ply로 저장합니다.

3. 슬라이스 위치를 선택 : Mipav 7.2

  1. 관심 또는 시작 위치의 조직을 식별합니다. 의도 된 슬래브 두께를 계산합니다. 비단 원숭이의 뇌에서, 섹션 당 30 MRI 슬라이스, 블레이드 간격 당 5 MRI 슬라이스를 계산하는 것은 ~ 3.5 mm 석판의 결과로, 0.5 mm 블레이드 간격 3 mm 섹션을 만듭니다. 인간의 두뇌 : 섹션 당 20 MRI 조각, 4 MRI의 SL블레이드 간격 당 빙과는 ~ 7.2 mm 석판의 결과로, 1.2 mm 블레이드 간격 6 mm 섹션을 만듭니다.
  2. 첫 번째 블레이드 갭의 위치에서, "상자 VOI"를 클릭 한 후 뇌를 통해 상자를 그립니다. 선택하려면 상자 내부를 클릭합니다. 복사 및 블레이드 격차에 대응하는 각 MRI 슬라이스에 대한 윤곽을 붙여 넣습니다.
  3. 섹션 두께에 대응하는 MRI 조각의 숫자로 건너 뛸 복사하여 다음 날 갭에 해당 윤곽을 붙여 넣습니다. 뇌를 통해이 과정을 반복합니다.
  4. VOI, VOI 변환, 바이너리 마스크를 모두 선택합니다. Blade_Gaps.nii로 저장합니다.
  5. 알고리즘, 추출 표면 (행진 큐브), 마스크 이미지, Blade_Gaps.ply을 선택합니다.

4. MRI 블레이드지도 만들기 : Mipav 7.2

  1. Brain_MRI_Resampled과 Blade_Gaps.nii 이미지를 엽니 다.
  2. 선택한 Blade_Gaps.nii 이미지를 선택 유틸리티, 이미지 수학으로. 이미지 유형 및 곱하기 홍보를 선택합니다.값으로 10000을 입력합니다.
  3. 선택 유틸리티, 이미지 계산기. 추가 선택하고 이미지 드롭 다운 상자에서 Brain_MRI_Resampled 이미지를 선택합니다. 대상 이미지 유형을 홍보 선택합니다.
  4. Brain_BladeMap.nii로 이미지를 저장합니다.
  5. Triplanar보기를 클릭함으로써, 뇌가 분리되는 위치는 세 직교 뷰에서 보일 수있다.

5. 두뇌와 블레이드 갭 표면을 가져 오기 : Netfabb 전문

  1. 파트를 선택 부분을 추가합니다. 파일 Brain_Model.ply 및 Blade_Gaps.ply를 선택
  2. 뇌를 선택하고 복구 모드를 클릭합니다. 복구 모드에서 :
    1. 쉘 선택 버튼을 클릭 한 다음 뇌를 클릭합니다.
    2. 다른 메시를 선택 토글 선택 버튼을 클릭합니다. 다른 메쉬를 삭제하려면 제거를 클릭합니다.
    3. 클릭 복구를 적용하고 오래된 부분을 제거합니다.
  3. 오른쪽 뇌를 클릭합니다. 이동을 선택합니다. 온 클릭원 버튼. 표시되는 XYZ 매개 변수를 기록합니다. 이 변환 파라미터에 설정 Mipav 블레이드의 위치를 ​​유지하기 위해 필요하다. 번역을 클릭합니다. 그런 다음 창을 닫습니다. (한 번 이상 번역 클릭하지 마세요. 그것은 다시 같은 매개 변수를 사용하여 변환합니다.)
  4. Blade_Gaps 모델을 선택합니다. 오른쪽 부분을 클릭하고 이동을 선택합니다. XYZ 매개 변수 상자에 이전에 기록 된 XYZ 값을 입력합니다. 이제 번역을 클릭하고 창을 닫습니다.
  5. Brain_Model 모델을 선택하고 복구 모드를 클릭합니다. 복구 모드에서 :
    1. 쉘 선택 버튼을 클릭 한 다음 뇌를 클릭합니다.
    2. 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 부드러운 삼각형을 선택합니다. 4-5 반복을 입력합니다. 방지 볼륨 축소를 확인합니다. 인간의 두뇌 : 1-2 반복.
    3. 클릭 오른쪽 삼각형을 줄을 선택합니다. 대상 삼각형 개수에 200000를 입력하고 실행을 클릭합니다.
    4. 자동 수리, 기본 수리를 클릭합니다. 그런 다음에 클릭 복구를 적용
  6. 마우스 오른쪽 단추로, 이름 바꾸기를 클릭합니다. Smoothed_Brain_Model로 부드럽게 뇌의 이름을 바꿉니다.
  7. Smoothed_Brain_Model을 선택합니다. 오른쪽 클릭, 수출, STL.

6. 편집 뇌 윤곽 : Meshmixer

  1. Meshmixer에 Smoothed_Brain_Model를 가져옵니다.
  2. 메시 조정을 만들기 위해 조각 및 선택 도구를 사용합니다. 수정 사항은 다음과 같습니다 :
    1. 강력한 부드러운 스컬 프팅 도구를 사용합니다. VOI를 선에 대응하는 영역을 매끄럽게. 인간의 두뇌 :이 단계를 건너 뜁니다.
    2. 상자에 아래로 향하게됩니다 피질의 표면을 부드럽게.
    3. 맞물림 및 편집 과정에서 생성되었을 수 있습니다 작은 디 보트를 멀리 부드러운.
  3. 분석, 관리자, Autorepair을 모두 선택합니다.
  4. Smoothed_Edited_Brain_Model로 Smoothed_Brain_Model를 내 보냅니다.

7. 뇌 슬라이서 상자 만들기 : Netfabb 전문

  1. 제품을 선택 파트를 추가합니다. 채워진 가방을 선택전자 Smoothed_Edited_Brain_Model.
  2. 제품을 선택 파트를 추가합니다. 그런 다음 STL 파일 두뇌 슬라이서 Parts_Marmoset을 선택하고 열기를 클릭합니다. 인간의 두뇌 : 두뇌 슬라이서 Parts_Human (기업 코드 파일).
  3. 오른쪽 부분을 클릭 한 부분에 확장, 쉘을 선택합니다. 개별적으로 각 부분을 선택하고 마우스 오른쪽을 이름을 클릭합니다. (객체 옆에있는 눈을 클릭하면 그것을 숨기거나 볼 수 있습니다.) 큰 상자 홈페이지, 작은 상자 하위 및 절단 상자 Box_Cutout, 육각형 모양 Blade_Holder_Main, 작은 평면 상자 마이크로톰 블레이드와 반 이름 바꾸기 튜브 객체의 요람. 인간의 두뇌 : 없음 Blade_Holder_Main, 마이크로톰 블레이드, 또는 크래들.
  4. 메인, 서브, 블레이드, Blade_Holder_Main, 마이크로톰 블레이드 및 크래들을 숨기기 모든 육 및 Box_Cutout을 선택하려면 Shift 선택을 사용합니다. 만 Box_Cutout과 Smoothed_Edited_Brain_Model는 볼 수 있어야하지만, Smoothed_Edited_Brain_Model은 선택하지 않아야합니다.
  5. 클릭하고 뇌를 기준으로 상자의 위치를 ​​조정하기 위해 선택한 부분을 드래그합니다.
    1. 상자의 중앙에 뇌를 놓습니다. 상자에 충분히 깊은 뇌가 단단히 파지 할 위치보다,하지만 너무 깊이하지 적절한 배치를 방지 오버행을 만들 수 있습니다.
  6. 위치되면, 뇌는 상자 형상의 돌출에 대해 시험 할 수있다. Box_Cutout과 Smoothed_Edited_Brain_Model을 선택합니다. 부울 동작을 선택합니다.
    1. 이 빨간색으로 변합니다 Smoothed_Edited_Brain_Model을 클릭합니다.
    2. 부울 빼기를 선택하고 계산을 적용 할 수 있습니다.
  7. 안전 상자에 배치되는 뇌 조직을 방지 할 수 오버행에 대한 뇌의 확인란을 선택합니다. 이 돌출이있는 경우가 상자 내에서 덜 깊은하므로, 뇌를 조정합니다. 뇌 원하는 깊이와 오버행에있는 경우존재의 돌출을 제거하기위한 솔루션을 보충 (10)을 참조하십시오.
  8. Blade_Gaps 모델을 선택합니다. 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 이동을 선택합니다. 다음 창을 닫습니다, 위치의 Z 값을 기록한다. 이것은 가장 후방 블레이드 간극의 위치에있을 것이다.
  9. 뇌 슬라이서 부품에서 온 블레이드 STL을 선택합니다. 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 이동을 선택합니다.
    1. 절대 번역을 선택합니다. 7.8의 Z 값을 입력합니다. X 및 Y 값, 현재 위치 파라미터 박스에서 해당 값을 입력
  10. 블레이드 STL을 선택합니다. 클릭 마우스 오른쪽 단추로 복제를 클릭합니다.
    1. 부품을 정렬하십시오. 총 수에 블레이드의 총 수를 입력한다. 의 Z 카운트 상자에 같은 번호를 입력합니다. Z 축 간격으로 슬래브 두께를 입력합니다. 복제를 클릭합니다. 슬래브 두께를 변경 한 경우, 블레이드는 개별적으로 배치 될 필요가있다. (전방에 후방에서 이동) 이전에서 각각의 새로운 블레이드를 중복해당 섹션에 대한 섹션 두께와 동일한 Z 갭.
  11. 마이크로톰 블레이드에 대한 단계 7.9와 7.10를 반복하여 슬라이서의 블레이드와 똑같은 간격으로 마이크로톰 블레이드 부품을 배치합니다. 인간의 두뇌 :이 단계를 건너 뜁니다.
    1. Blade_Holder_Main 부분과 함께 마이크로톰 블레이드를 선택하고 부울 동작을 선택합니다.
    2. 빨간색을 강조 마이크로톰 블레이드의 모든 블레이드를 선택합니다. 부울 뺄셈을 클릭하고 계산을 적용 할 수 있습니다.
    3. 선택 복구 모드. 확장 된 수리를 수행합니다. 수리를 적용 선택하고 이전 부분을 제거합니다.
    4. 부품 블레이드 홀더의 이름을 바꿉니다. STL과 같은 부분을 보냅니다.
  12. Smoothed_Edited_Brain_Model, 이전 단계에서 생성 된 블레이드 모델의 모든 서브와 메인 시프트 선택. 부울 연산을 클릭합니다.
    1. 그 자체로 주요 빨간색을 제외한 모든 부분을 확인를 lecting 및 녹색 상자 아래에있는 화살표를 클릭하면 빨간색로 이동합니다.
    2. 계산을 적용 선택한 다음 부울 빼기를 선택합니다.
  13. 복구 모드를 클릭합니다. 복구 모드에서 :
    1. 오버행과 날카로운 점에 대한 확인란을 선택합니다. 이들은 Netfabb 또는 Meshmixer에 부드럽게 할 수 있습니다.
    2. 자동 복구, 확장 수리를 클릭합니다. 그런 다음 복구를 적용하고 이전 부분을 제거
  14. 오른쪽 수리 뇌 상자를 클릭하고 뇌 슬라이서 상자 이름을 바꿉니다. STL로 내보내기.

8. Ultimaker 2의 뇌 슬라이서 상자 인쇄

  1. 비단 원숭이 뇌 : 큐라
    1. 큐라로 뇌 슬라이서 상자를 가져옵니다.
    2. 회전을 선택하고 침대에 평평하므로 상자를 회전 원을 끕니다.
    3. 0.1 mm 층 해상도, 50 %의 충전 밀도, 뗏목 : 인쇄 설정을 조정합니다.
    4. SD 카드에 저장 도구 경로를 선택합니다. (인쇄 시간 ~ 12 시간).
    5. 가져 오기 블레이드 홀더에큐라로 그래서 슬롯 양쪽에 있고 육각면이 XZ 또는 YZ 평면 인 돌리.
    6. 개체를 복제.
    7. 0.2 mm 층 해상도, 20 %의 충전 밀도, 모자 챙 : 인쇄 설정을 조정합니다.
    8. SD 카드에 저장 도구 경로를 선택합니다. (인쇄 시간 ~ 3 시간)
  2. 인간의 두뇌 : 큐라
    1. 큐라에 뇌 슬라이서 상자를 가져 오기 및 8.1.2에서와 같이 회전합니다.
    2. 인쇄 설정을 조정 : 0.2 mm 층 해상도 30-35 %의 충전 밀도, 뗏목을.
    3. SD 카드에 저장 도구 경로를 선택합니다. (단일 반구 상자 ~ 70 시간 인쇄 시간입니다.)
  3. Ultimaker 2
    1. 플레이트를 구축하는 접착제 스틱 접착제의 얇은 층을 적용합니다.
    2. SD 카드를 삽입합니다. 인쇄를 선택하고 부품을 선택합니다.

9. 뇌를 절단

  1. 비단 원숭이의 뇌
    1. 고정 뇌, 뇌 슬라이서, 두 개의 블레이드 홀더, 마이크로톰 블레이드, 불소계 오일 1 ㎖, F와 워크 스테이션을 준비위도 집게, 보호 장갑 및 삽입 카세트.
    2. 블레이드 홀더의 슬롯에 새로운 마이크로톰 블레이드를 놓습니다. 각 블레이드의 경 사진 가장자리가 같은 방향을 향하고 있는지 확인합니다. 마이크로톰 블레이드를 처리 할 때 보호 장갑을 착용 할 것.
    3. 포르말린에서 뇌를 제거하고 부드럽게 건조.
    4. 슬라이서로 뇌를 놓습니다. 불소계 오일 몇 방울 쉬운 위치 있도록 뇌 슬라이서에 적용될 수있다. 확실히 뇌가 고정되어 있는지 확인합니다.
    5. 해당 블레이드 슬롯에 블레이드와 블레이드 홀더를 배치합니다.
    6. 블레이드 홀더에 단단히 밀어 뇌를 잘라 느린 균형 압력을 적용합니다.
    7. 뇌의 전면부터 한번에 각 슬래브를 제거한다. 그것은 슬래브 자체를 제거하기 전에 슬래브의 앞에 마이크로톰 블레이드를 제거하는 데 도움이됩니다. 각 슬래브의 전방 / 후방 방향에주의를 기울이십시오.
    8. 전방의의 사진을 촬영각 슬래브의 D 후방 표면. 후방 석판은 대부분 별도의 조각을 포함, 그래서 내장의 조각의 방향에주의를 지불 할 것이다. 매립 카세트에 각각의 슬래브를 놓고 10 % 포르말린 용액에 모두 넣어.
  2. 인간의 두뇌
    1. 조심스럽게 상자에 뇌의 적합성을 테스트합니다.
    2. 뇌가 서서히 기울어 진 컷을 사용하여 한쪽 끝에서 시작 단단히 슬라이스 조각입니다. 각 블레이드의 갭을 통해 뇌를 잘라.
    3. 수와 각 슬래브의 전방 / 후방 방향에주의를 기울이고, 한 번에 각각의 슬래브를 제거합니다.
    4. 각 슬래브의 전방 및 후방 표면의 사진을 촬영합니다. 밀봉 10 % 포르말린 가방에 슬라브를 놓습니다. 조직 블록은 슬래브 절단 임베딩 카세트에 배치된다.

브레인 박스 10. 제거 오버행 (보충 절)

  1. 슬라이스를 잡아 당겨 : Meshmixer
    1. Smoothed_Edit 가져 오기ed_Brain_Model.
    2. 편집을 선택, 슬라이스를 확인합니다. 메이크업 조각에서 :
      1. 누적 3 차원, Z는, 1-2mm 두께를 입력을 선택합니다. 계산을 클릭합니다. 슬라이스가로드 할 때, 수락을 클릭합니다.
    3. 피질 아래쪽에 큰 둘레와 1 또는 2 조각을 선택합니다. 이 조각은 하위 상자의 레벨 이하이어야한다.
    4. Brain_Slice_ 번호 등이 조각의 각을 보냅니다.
  2. 오버행을 제거하는 최대 조각을 확장 : Netfabb 전문
    1. Brain_Slice_ 번호 슬라이스를 가져옵니다.
    2. (선택된 경우 선택을 취소 부품을 배치) 각 Brain_Slice_ 번호를 중복.
    3. 마우스 오른쪽 단추로 각 Brain_Slice_ 번호를 선택 스케일의 복사본 하나를 클릭합니다.
      1. 선택을 취소 고정 배율. 이 하위 박스의 바닥 수준에 도달 할 수 있도록 그 후 Y 방향의 뇌 슬라이스 확장.
    4. 이 조각 Brain_Slice_Big_ # 이름을 바꿉니다.
    5. y 위치 O를 확인부분을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택 이동하여 원래의 Brain_Slice_ 번호 바. 원래 Brain_Slice_ 번호 슬라이스 각각에 대한 Y 위치를 기록합니다.
    6. 계산을 수행 Brain_Slice_ # [y 위치] - (Brain_Slice_Big_ # [Y 크기] - Brain_Slice _ # [Y 크기])
    7. 개별적으로 Brain_Slice_Big_ 번호를 각각 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이동을 선택합니다.
      1. 는 Y 변환 매개 변수 상자에 10.2.6에서 계산 된 값을 입력합니다. X 및 Z 변환 파라미터를 들어, 현재 위치 파라미터 박스에있는 값을 입력한다. 절대 번역을 선택합니다. 클릭 번역하고 창을 닫습니다.
        주 : 상자를 만드는 경우 Brain_Slice_Big_ 번호 슬라이스가 뇌와 블레이드와 함께 차감됩니다.

추가 검색 11. 비단 원숭이 뇌 MRI 요람

  1. 뇌 MRI 크래들 만들기
    1. Cr의 확신이 상부 표면을adle는 Box_Cutout 같은 높이에있다. 크래들의 깊이와 뇌의 위치는 슬라이서입니다 것처럼 설정해야합니다.
    2. Shift 키를 선택 Smoothed_Edited_Brain_Model와 크래들을 선택합니다.
    3. 부울 연산을 선택합니다. 그것은 빨강, 다음 부울 뺄셈을 선택 강조 두뇌를 선택합니다. 그런 다음 계산을 적용 할 수 있습니다. (또한 해당되는 경우 Brain_Slice_Big_ 번호 슬라이스를 선택합니다.)
    4. 슬라이서에 대해 이전 완료로 크래들 윤곽에 날카로운 점을 제거하기 위해 복구 모드를 입력합니다. 확장 수리를 선택합니다. 수리를 적용하고 오래된 부분을 제거합니다.
    5. 오른쪽 부분 MRI 뇌 크래들의 이름을 변경합니다. , STL을 내보내기를 선택합니다.
  2. 크래들 인쇄 : 큐라을
    1. 큐라으로 MRI 뇌 크래들을 가져 뇌 컷 아웃과 평평한 부분이 위로 향하게되도록 돌립니다.
    2. 0.1 mm 층 해상도, 100 % 충전 밀도, 뗏목 : 인쇄 설정을 조정합니다.
      3. <리> SD 카드에 저장 도구 경로를 선택합니다. (인쇄 시간 ~ 10 시간)
    3. 8.3에 설명 된대로 Ultimaker 2에 인쇄 할 수 있습니다.
  3. 크래들을 사용하여 획득 고해상도 T2 * MRI
    1. 종이 타월로 뇌의 표면에서 부드럽게 건조 포르말린.
    2. 슬라이서에 기재 한 바와 같이 요람에서 뇌를 놓습니다.
    3. 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뇌와 크래들을 밀어 넣습니다. 불소계 오일 가장자리에 입력합니다.
    4. 부드럽게 기포가 뇌에서 벗어날 수 있도록, 튜브 짠다. 거기에 형성되는 공기 방울을 방지하기 위해 튜브 캡의 삽입에 캡 삽입을 삽입합니다. 뚜껑을 고정하고 파라핀으로 튜브를 밀봉.
    5. 전술 한 바와 같이 코일에 튜브를 놓습니다. 3D T2 * 파라미터는 표 1에 제시되어있다.
    6. Mipav에서 18 해부학 100 미크론 T2 * -weighted 인수를 열고 10 일 획득에 등록합니다. 등록 파라미터는 1.1.7과 동일하다. 등록 된 이미지를 평균 : UT를ilities, 이미지 계산기 - 대량 이미지, 평균.

결과

이 방법의 흐름은 뇌가 분리되면, 슬래브의 표면면의 MR 이미지 및 이미지와 시각적으로 비교하여 여러 석판 걸쳐 양호한 방향이 일치 (도 2)을 나타낸다도 1에 요약 하였다. 슬래브는 파라핀에 포함 된 후, 그들은 마이크로톰에 절단 및 스테인드된다. 높은 해상도 사후 MRI와 스테인드 조직학 섹션 사이의보다 철저한 비교는 비단 원숭이 뇌의 모든 구조에서 정확하고 일관된 경기 (그림 3)를 보여줍니다.

MS이 동물 모델에서, 동물 뇌 백색질 퍼져 백질 병변을 개발한다. 이러한 병변은 MRI를 수행하여 비 침습적으로 검출 할 수있다. 도 4는 MRI 소견 병리학 기판 해명이 기술의 능력을 보여준다. 생체 내 MRI에서 발견 된 작은 병변 수사후 MRI 및 조직학 모두 추적 할 수. 인 세트에 도시 된 바와 같이, 병변 내 탈수 초화는 (주변 조직에 비해 hyperintensity)이 MR 신호 변화를 주도 주요 구성 요소 중 하나이다. 조직학 및 사후 MRI는 생체 내 MRI (그림 4)에서 놓친 병변을 표시 할 수 있습니다.

figure-results-1
비단 원숭이의 뇌 슬라이서 상자를 만드는 1. 워크 플로우 그림. 뇌는 포르말린 (A1)과 T2 강조 MRI는 에지 당 150 μm의 (A2)의 등방성 복셀로 취득으로 고정되어있다. 이미지 처리 및 바이너리 마스크 (A3)을 만들 임계 된 있습니다. 표면이어서 3D 모델링 소프트웨어 (A4)에 렌더링된다. 슬라이서 템플릿과 뇌 모델 사이의 부울 뺄셈은 뇌 슬라이서 (B1)의 디지털 모델을 생성합니다. 뇌 슬라이서 상자는 3D 프린터 (B2)에 인쇄되어 있습니다. 뇌는 다음 슬라이서 상자에 단단히 배치절단 (B3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2.에서 왼쪽에서 오른쪽으로 : 생체 내 MRI, 사후 MRI, 조직 슬래브 사진. 슬라이싱 평면은 대응하는 생체 MRI 슬라이스 (A)에 비해 시각적 사후 MRI (B)에 기초하여 설정 하였다. 뇌 후 절단하고, 얻어진 슬래브 일관성 (C) 인 것으로 밝혀졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3. 고해상도 사후의 MRI 및 조직학부분 일치. 슬래브는 4 μm의 섹션으로 마이크로톰 절단, 빠른 파란색과 크레 실 바이올렛 (B)로 염색, 파라핀에 포함되었다. 섹션은 다음 시각적으로 100 μm의의 T2 * 뇌 구조 (A)에 따라 MRI -weighted와 일치 하였다. 이 이미지를 획득하기위한 세부 사항은 프로토콜 및 표 1. 뇌 구조의 보조 섹션에서 : (1) 빨간색 화살표 = 내부 캡슐, 파란색 화살표 = 전방 접합면; (2) 빨간색 화살표 = 피질, 파란색 화살표 = 광학 기관; (3) 빨간색 화살표 = 미상, 파란색 화살표 = 해마; (4) 빨간색 화살표 = 뇌량, 파란색 화살표 = 대뇌 말라; (5) 빨간색 화살표 = 열등 둔덕, 파란색 화살표 = 피라미드 기관. B1의 점선 박스는 하나의 뇌 절단 또는 파라핀 매립 중에 에러가 좌측 전방 접합면의 불일치로 이어지는 상기 Y 축을 중심으로 약간 회전 의한 슬라이스를 나타낸다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.

figure-results-4
그림 4. 조직 학적 섹션으로 생체 내 MRI에서 병변을 추적. 생체 내 MRI 중 하나 광학 기관 (A1)의 병변을 제안하는 이상 hyperintensity 신호의 더 설득력있는 증거가 없었다. 그러나, 높은 해상도 사후의 MRI는 모두 광학 책자 (A2)의 명확한 하이퍼 강렬한 라인을 보여줍니다. 4 μm의 조직 학적 섹션의 빠른 블루 / 크레 실 바이올렛 얼룩은 생체 MRI에 본 hyperintense의 영역 (A3)을 탈수 초 것을 보여줍니다. 대뇌 백질에서, 생체 내 MRI 미묘한 양자 hyperintensity (B1, 인 세트의 확대)를 보여줍니다. hyperintense 지역은 높은 해상도 사후 MRI (B2)에 대한 명백하다. 4 μm의 조직 학적 섹션의 LFB 염색이 영역 (B3)를 탈수 초 것을 보여줍니다. 기준 I와 비교 한 후N 생체 MRI 및 hemotoxylin - 및 - 에오신 염색, 우측은 해부학 적 이상이 아닌 탈수 초 병변 인 것으로 측정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
기업 코드 파일. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. Brain_Slicer_Parts_Human.stl : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. Cap_Insert.stl : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 MRI 및 조직학 섹션 사이의 정확한 비교를 할 수 있습니다. 프로토콜은 이러한 마모 셋 또는 설치류 사람이나 작은 동물의 뇌에 적용 할 수있는 통합 된 형식으로 제공된다. 대형 (인간)에 대한 구체적이고 두뇌가 강조된다 (인간이 아닌 영장류와 설치류) 작은 및 첨부 된 비디오와 그림의 차이는 우리는 비단 원숭이에서 응용 프로그램을 보여줍니다. 접근 방법은 간단하지만,이 방법은 여러 단계뿐만 아니라 여러 종류의 소프트웨어의 사용을 요구한다. 또한, 잠재적으로이 방법의 정확도에 영향을주는 여러 가지 문제를 언급하는 것이 중요하다.

생체 MRI의 화질은 중요한 인자이다. MRI 디지털화 조직학 이미지 간의 이미지 해상도에서의 차이를 최소화하기 위해 가능한 한 작은 MRI 복셀의 크기가 사용되어야한다. 이 개념은 또한 사후 MRI의 화질에 적용된다. 증가하는 동안사후 MRI에서의 획득 시간이 제제는 기포 관련된 초점 신호 끊김 같은 이미지 아티팩트들을 도입 할 수있다, 더 높은 이미지 해상도를 허용한다. 이러한 아티팩트는 조직 영역을 모호뿐만 아니라 형상에 영향을 미칠 수있다. 또한, 사후 MRI에서 조직의 크기는 정착 과정 및 시간에 의해 영향을받을 가능성이 높다. 생체 내 생체 MRI 경기에 밀접 취득 중에 조각 형상 설정의 해부학 적 구조를 이용하여 근사화 될 수 있지만, 비선형 등록이 여전히 두 MRI 이미지 매칭 정밀도 높은 수준에 도달 할 필요가있을 것이다.

뇌 홀더와 슬라이서의 설계는 중요한 단계이다. 뇌의 디지털 모델을 만들 때, 평활 알고리즘은 다소 고정 뇌 모델 상대를 확대하는 것이 적용된다. 이 홀더 및 슬라이서로 뇌를 쉽게 삽입 할 수 있습니다 홀더에 날카로운 모서리를 줄여 &# 39;의 윤곽. 모델이 너무 클 경우 (예 : 5 % 이상), 뇌 MRI는 사후 및 / 또는 단면 동안 이동할 수있다. 또 다른 중요한 점은 소뇌 제대로 인쇄 3D 객체 내부에 배치되도록 뇌 모델의 설계를 적용하는 것이다. 소뇌가 부검 뇌에서 추출 중에 손상된 경우가 특히 어려울 수있다.

뇌 슬라이서 홀더를 인쇄 할 때, 3 차원 프린터 유형은 신중하게 선택되어야한다. 일부 다중 - 제트 프린터는 지지체 물질을 제거하기 위해 오븐을 이용하여 후 처리를 필요로한다. 이 프린터는 방수 및 데스크톱 융합 증착 모델링 (FDM) 프린터보다 상대적으로 내구성이 객체를 생성 할 수 있지만, 가열 공정은 뇌의 윤곽에 완벽하게 수직하지 않은 블레이드 격차를 작성, 약간 상자를 워프 할 수 있습니다 지원을 제거합니다.

뇌 절편 과정은 또 다른 중요한 단계입니다. 일을 절단하기 전에전자 석판으로 전체 뇌, 뇌가 뇌 슬라이서 내부에 단단하게 앉아 있는지 확인하는 것이 중요하다 : 약간의 압력이 뇌에 적용되는 어떤 움직임이 없어야합니다. 이로써 블레이드 연구자에 의해 설정된 위치에서 정확하게 뇌을 극복 할 수 있도록한다. 절단시 연속, 균형 잡힌 압력이 모두 블레이드 홀더 적용해야합니다. 블레이드의 선명도 및 조직의 강성에 따라 약간의 횡 절단 동작 평면 절단면을 유지하는데 바람직 할 수있다.

파라핀 매립 공정은 MRI 및 조직학 간의 오정렬의 원인이 될 수있다. 티슈 슬래브 매립 과정 카세트에 평평 앉아 있지 않으면, 마이크로톰의 절단면 및 슬래브의 표면 위치 사이의 기울기가있을 것이다. 이것은 모든 조직이 노출 된 평면을 찾을 수 없게 부분 절단이 필요하다. 틸트를 보정하는 한 가지 방법높은 등방성 해상도 사후의 MRI에서 보는면의 각도를 변경하는 것이다. 그러나, 이것은 일반적으로 이방성 해상도 (일반적으로 관상 슬라이스 두께)로 취득한 생체 MRI에서 수행하는 것은 거의 불가능하다.

마지막으로, 조직뿐만 아니라 (주름, 균열, 접이식) 슬라이드의 제조 동안 포르말린 고정 파라핀 기간 임베딩 (수축) 중 일부의 변형이 발생할 수있다. 이러한 변형 중 일부는 슬라이드 상에 전송하기 전에 수욕에서 4-5 ㎛의 섹션을 바꾸어 보정 될 수있다. 다른 변형 부분적 사후 MRI 이미지 조직학 디지털화 된 이미지의 변형 화상 coregistration를 수행함으로써 해결 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 신중하고 숙련 된 연습과 변형을 최소화하는 섹션을 조직학하기 위해 MRI 볼륨을 일치에 가장 효과적인 방법이다.

결론적으로, 여기에 소개 된 방법은 INV 수 있습니다estigators 정확하게 MRI 소견의 기본 병리를 평가합니다. 보다 일반적으로, 그것은 식별 및 / 또는 염증이나 재유 수화와 같은 특정 병리학 적 프로세스를 대상으로 조사 연구를위한 새로운 MRI 바이오 마커를 검증하기위한 유망한 방법이다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

NINDS의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)이 이 연구를 지원했습니다. NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility에 감사드립니다. 사후 MRI 촬영에 도움을 주신 Jennifer Lefeuvre와 Cecil Chern-Chyi Yen에게 감사드립니다. 3D 프린팅에 도움을 주신 John Ostuni와 Section on Instrumentation Core Facility에 감사드립니다. 이 작업의 그림 1은 3D-CoForm 프로젝트의 지원으로 개발된 도구인 MeshLab의 스냅샷을 사용했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7T/30cm USR AVIII Bruker MRIBruker Biospin
38mm Bruker Biospin 볼륨 코일Bruker Biospin
FomblinSolvay Solexis
50ml 팔콘 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 멸균코닝21008-951
Fisherbrand 거즈 스폰지Fisher Scientrific13-761-52
Parafilm M 다목적 실험실 필름Bemis
Leica RM2235 로터리 마이크로톰 Leica
Leica 일회용 블레이드, 로우 프로파일 (819)Leica
Cresyl Violet Acetate, 0.1% 수성전자 현미경 과학26089-01
Luxol Fast Blue, 95% 알코올전자 현미경 과학0.1
ETOH
Ultimaker 2 확장 Ultimaker.75
kg 공식 Ultimaker 브랜드 PLA  필라멘트, 2.85mm, 실버 메탈릭Ultimaker
Axio Observer.Z1Zeiss
Zen 2 (블루 에디션)Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1Netfabbhttp://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332Autodeskhttp://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2NIH CIThttp://mipav.cit.nih.edu
CuraUltimakerhttps://ultimaker.com/en/products/cura-software
%

참고문헌

  1. Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
  2. 't Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
  3. Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
  4. Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
  5. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  6. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  7. McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
  8. Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
  9. Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
  10. Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
  11. Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

3DMRI

관련 논문