신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
척수 신경교 반응은 신경 병증 통증의 발전에 크게 기여하는 것이 잘 인정되었다. 세포 및 분자 수준에서 신경교 활동에 대한 상당한 정보를 시험 관내 세포 배양 시스템을 통해 얻어진다. 사용 된 시험 관내 시스템은 주로 신생아의 뇌 피질 조직으로부터 유도 된 일차 신경교 포함 및 세포주 불멸. 그러나, 이러한 시스템은 생체 내에서 척수 신경교 세포의 특성을 반영하지 않을 수있다. 더 나은 생체 상태를 반영 배양 시스템을 이용하여 말초 신경 손상 - 유도 된 신경 병증 통증의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하기 위해, 우리 실험실에서 기본 척수 혼합 신경교 배양을 설정하는 방법을 개발했다 성인 마우스. 간단히, 척수는 성인 쥐에서 수집하고 굴과 수초 제거하여 파파인 소화를 통해 처리됩니다성만 구배 매체. 단일 세포 현탁액은 35.9 오 ℃에서 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME) 보충 완전한 둘 베코의 변형 이글 미디어 (cDMEM)에서 배양 이러한 배양 조건은 혼합 아교 세포의 성장을 위해 특별히 최적화된다. 이러한 조건 하에서, 셀 (12) 사이의 실험에 사용될 준비가 - 14 일 배양의 설립 (D 0) 후 (셀이 기간 동안 로그 단계에서 일반적 임) 및 D (21)까지의 배양 조건에서 유지 될 수있다. 이 배양 시스템은 다양한 물질 및 제제로 자극시 척수 신경교 세포의 반응을 조사하기 위해 사용될 수있다. 신경 병성 통증 외에,이 시스템은 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 포함하는 다른 질병의 폐해 반응을 연구하는데 사용될 수있다.
서론
만성 통증은 최대 $ (635) 10 억의 추정 연간 비용으로, 미국에서 약 1 억 성인에 영향을 미치는 심각한 건강 문제이다. 증거 확보는 신경 병증 통증, 만성 통증이 가장 파괴 한 가지의 개발 척수 신경교 세포의 상당한 기여를 표시하고있다. 적절한 시험 관내 배양 시스템은 세포 및 분자 수준에서 신경교 세포의 역할을 조사 크게 도움이 될 것이다.
현재 연구에서 사용되는 시험 관내 신경교 배양 시스템은 신생아 마우스 또는 쥐의 뇌 피질 조직 유래 주로 아교 세포를 포함하는 불멸화 및 신생아 마우스로부터 유도 된 아교 세포주 또는 일차 신경교 세포를 쥐. 신생아 세포 따라서를 제공, 추가 (주로 성상 세포 및 미세 아교 세포) 신경 교세포로 분화 할 수있는 미분화 세포의 큰 숫자를 포함실험 사용 3 bundant 세포. 그러나, 우리의 이전 연구는 신생아의 뇌 신경 교세포는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극에 성인 척수 아교 세포에서 크게 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 예를 들면, 인터루킨 (IL)는 -4 신생아의 뇌 신경교 4 비교 성숙한 래트 척수에서 신경교 (NO)의 생산 LPS 유도 된 산화 질소에 대한 억제 효과를 강화 표시됩니다. 또한, 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) 칼시토닌 신경 펩티드에 의한 자극에 따라 케모카인 생산의 프로파일은, (5. 참고 문헌에 기술 된 방법) 신생 마우스의 뇌 신경교 사이 말할 나위 다른 성인 마우스 척수 신경교 (도 1). 확립 된 세포주를 사용 및 유지 관리가 용이하고 단시간에 다수의 셀을 제공 할 수있다. 일반적으로, 세포주를 생성하거나 6, 7, 또는 다음의 제 (예 널리 사용 소교 세포주 BV2 등) 바이러스 - 매개 불멸화 시스템을 사용하는 불멸화자발 변환의 전자 식별 (예 성상 세포주 C8-D1A 및 소교 세포주 C8-B4)를 8, 9 세포주 개별적 성상 세포 및 미세 아교 세포의 분자 적 특징을 연구하는데 우수하다.; 그러나, 세포주에서 얻어진 결과는 항상 주요 세포 또는 생체 내 조건에서의 추가 확인을 요구한다. 또한 설치류의 척수 아교에서 유래하는 아교 세포주 보고서가 없었던 것을 주목해야한다.
신경 병증 성 통증, 성인 쥐 혼합 신경교 배양 (4)를 생성하는 데 사용되는 이전에보고 된 방법을 적용하여 개발 된 성인 마우스 척수로부터 유래 배양 시스템 (5)의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하는 데 도움 . 마우스 척수 폐해 문화는 더 최근에 (10)를 정제하고,이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 성인 척수 혼합 폐해 문화의 C는 특정 연구의 요구에 맞게 선택된 균주로부터 마우스를 확립하고, 세포를 배양 개시 게시 d는 최대 21 명까지 배양 유지할 수있다. 이 방법뿐만 아니라 -associated 근 위축성 측삭 경화증 (ALS), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감각 신경 병증, 복수 등의 척수 내 병리학 적 변화를 포함하는 다양한 신경 질환의 연구에서, 신경병 통증의 연구에 사용될 수있다 경화증 (MS).
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프로토콜
다음 프로토콜은 뉴 잉글랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 다음 프로토콜은 4 성인 마우스 척수에서 아교 문화를 준비입니다.
무균 조건 하에서 문화 후드에서 솔루션 1. 준비
- 배양 배지를 준비 : 이글 미디어 (cDMEM) DMEM을 함유하는 완전한 둘 베코 변형 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 100 IU / ㎖ 페니실린 (4.5 g / L의 포도당), 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 250 NG / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 50 μM 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME는, 1.1.1 참조). 믹스와 다른 모든 구성 요소를 소독 필터링하고 FBS를 추가합니다. 4 오 ℃에서 배양 배지를 저장
- 50 ㎜ × 2-ME / 인산 완충 식염수 (PBS) 스톡 용액을 제조 하였다 : 100 ㎕를 추가 농축 2 ME 28.6 1X PBS mL를 필터 소독 (용액을 4 ℃로 저장 될 수로 (14.3 M) 몇 달). 유문화 미디어의 1,000 mL의 2-ME 원액의 자체 1 mL를.
- 밀도 구배 매체의 제조
- 주식 등장 밀도 구배 매체 용액을 제조 하였다 (예를 들어, 100 % 퍼콜) 1 부 배 정규 멸균 PBS 9 부 멸균 스톡 밀도 구배 매체 (예를 들어, 퍼콜) 발.
- 20 %의 밀도 구배 매체 (예를 들면, 1X PBS 40 mL로 100 % 밀도 구배 배지 10 mL)을 만들기 위해 정기적 1X 멸균 PBS로 (1.2.1 제) 100 % 밀도 구배 매체를 희석 4에서 보관 오 C. 세포 배양을 준비하기 전에, 실온 (RT) 내지 20 % 밀도 구배 매체를 준비한다.
- 파파인 해리 시스템에서 용액의 제조
주 : 파파인 해리 시스템은 자료 표에서 확인할 수있다. (자체 조립 포함) 다른 유사한 분리 키트를 사용할 수도있다. 모든 compone국세청은 멸균해야합니다.- ovomucoid 억제제 혼합물 (분말)에 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)의 32 ML을 추가합니다.
- 하나 파파인 바이알 (분말)에 EBSS 5 mL를 추가합니다. 10 분 동안 또는 파파인이 용해 될 때까지 37 O를 C의 물을 욕조에있는 파파인 병을 놓습니다.
- 한 DNase의 바이알 (분말)에 EBSS 500 μL를 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
- 파파인 유리 병에 DNase의 솔루션 (위) 250 μL를 추가합니다.
- 필요한 상기 파파인 / DNase의 혼합물 (마우스 척수 당 파파인 / DNase의 혼합물을 약 800 μL)의 총량을 계산 및 조직 분해 (단계 3.2)에 대한 50 ㎖ 튜브에 필요한 혼합물을 옮긴다. 적어도 2 주 동안 4 ° C에서 원래 유리 병에 남은 저장합니다.
- 필요할 때까지 얼음에 키트의 모든 구성 요소를 유지합니다.
- 척수 수집 튜브를 준비 하나 멸균 15ml의 튜브를 5 ㎖ 행크 균형 염 용액 (HBSS로의 상기 파파인 해리 시스템에서,0; 1X PBS와 척수)와 하나의 멸균 15 ML의 튜브를 수집 (5 ML의 주사기를 채우는) 단계 2.4를 참조하십시오. 또한, HBSS의 5 mL로 한 멸균 페트리 접시 (35mm 또는 60mm)를 준비하고 문화 후드에 보관합니다.
2. 척수 컬렉션
주 : 모든 장비는 멸균해야합니다. IACUC 승인 지정된 지역에서 컬렉션을 수행합니다.
- 수확 마우스 척수에 대한 다음과 같은 도구를 얻 바로 날카로운 / 무딘 18 cm 수술 가위, 12 cm 표준 메스 (# 3 고체), 탄소 강철 멸균 메스 블레이드 # 10, 작은 동물 decapitator, 12 cm 표준 곡선 겸자 및 멸균 20G 바늘 5 ml 주사기에 부착.
- CO 2 동물을 안락사 마우스 헤드와 70 % 에탄올 (EtOH 중)과 후방 영역 소독.
- decapitator과 동물의 목을 벨. 근육 층을 노출시키는 하부 후면 중간 세로 절개를. 하다엉덩이 수준에서 척추 칼럼을 통해 깨끗한 절개는 멸균 바로 수술 가위 (18cm)와 (또한 척추 열을 덮고있는 근육 층을 통해 절단).
- 일회용 신선한 닦아 장에 동물을 배치합니다. 조심스럽게 주동이쪽으로 척추에 (멸균 1X PBS (단계 1.4)로 가득 찬 5 ML의 주사기에 부착) 20 G 바늘을 삽입합니다. 아래로 단단히 동물을 잡고 신속하게 주사기를 밀어 넣습니다. 전체 척수는 자궁 끝에서 나올 것이다. HBSS를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 척수 수집.
- 마우스의 나머지 단계를 반복 2.4. 각 동물 사이에, 70 % EtOH로 모든 중고 악기를 소독.
주 : 일반적으로, 12- 웰 플레이트는 매 4 마우스 척수 (4.3 참조)에 대해 설정 될 수있다.
단일 세포 현탁액 3. 준비
참고 : 무균 모든 것을 유지하기 위해 문화 후드의 단계 3과 4를 수행합니다.
- HBSS 함유 배양 접시 (단계 1.4)에 모든 척추 코드를 전송합니다. 멸균 가위와 집게로 많은 훌륭한, 작은 조각으로 척수의 각을 잘라. 이것이 상기 제조 된 희석 된 바와 같이 무균 핀셋 또는 10 ㎖ 피펫을 사용하여 제조 된 파파인 / DNase의 효소 혼합물 (단계 1.3.5)를 함유하는 50 mL의 원뿔 관 척수 조직을 트랜스퍼 (효소 혼합물로 HBSS를 추가하지 효소 용액과 효소의 성능이 저하 될 수 있습니다).
- 섞어 부드럽게 튜브를 소용돌이. 궤도는 150 rpm으로 진탕 배양기 / 쉐이커에 1 시간 동안 37 ℃로 튜브를 품어.
- 와류 튜브 다시 격렬 상기 해리를 촉진하기 위해 5 ㎖ 피펫을 사용하여 조직과 효소 용액을 씹다.
- RT에서 5 분 동안 300 XG에 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 원심 분리 동안, 재구성 알부민 ovomucoid INH 300 μL와 2.7 mL의 EBSS를 혼합멸균 튜브에 ibitor 용액 (1.3.1). DNase의 용액 (단계 1.3.3)의 150 μL를 추가합니다.
- 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 (단계 3.5) 상기 제조 한 용액과 세포 펠렛을 재현 탁. 소용돌이 잘 세포 펠렛을 깰 수 있습니다.
- 세포 현탁액에 재구성 알부민 ovomucoid 방지 액 (단계 1.4.1)의 3 ML을 추가합니다. 실온에서 6 분 70 XG에 원심 분리기 세포. (막 조각을 포함) 상층 액을 제거합니다.
단일 세포 현탁액에서 미엘린 4. 또한 제거
- 제동없이 RT에서 30 분 동안 800 XG에서 세포 펠렛을 방해 부드럽게 세포 펠렛을 함유하는 튜브에 와동 (단계 1.2.2에서 제조) 20 % 밀도 구배 매체 8 mL를 넣어 원심 분리. 조심스럽게 이물질 (주로 수초)과 상층 액의 상단 층을 제거하지만, 펠렛을 유지한다.
- resuspendi로 세포를 씻어, 밀도 구배의 잔해를 제거하려면희석 된 cDMEM 8 ㎖ (1 부 cDMEM 2 부분 HBSS)으로 세포 펠렛 겨. 4 O ℃에서 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리기 상등액을 제거하고 동일한 방식으로 희석 된 cDMEM (위)로 다시 세포를 세척 하였다. 를 파종 할 때까지 얼음 세포를 유지합니다.
- 상층 액을 제거하고 배양 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁 (cDMEM이와 함께 제공되는 2-ME (단계 1.1에서 준비)). 한 12 웰 플레이트를 들어, 3 ㎖ × 4 (사용하는 마우스의 수) + 2 mL의 = 14 mL의 미디어를 사용합니다. 이것은 전체 판에 충분한 세포 현탁액 (12 웰)가 확인되며, 웰 당 평균 셀 수와 배양 소교 콘텐츠를 결정하는데 이용 될 수있는 추가 우물을 제공한다. 배양 용기의 다른 형태가 사용되는 경우, 비례 적으로 필요한 배양 배지의 총 체적을 계산한다.
- 12 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다.
- 5 % CO 2 35.9 ℃로 세포를 품어. D 1에 용지를 (흡입을 통해 이전 용지를 제거) 변경 후 매 3입니다.
주 : 1 일째에 배양 의한 척수 조직으로부터 잔류 미엘린에 파편 상당량 함유 할 수있다; 따라서, 1 일에 미디어를 변경 (자세한 내용은 토론 참조)을 권장합니다. D (12)에 잘 당 약 10 만 세포를 12 웰 플레이트에가, 14 셀 일반적으로 D 12에서 80 % 합류하고 일반적으로 D (14)에 의해 100 % 합류 근처가 될 수 - 문화 (12)은 D 사이의 치료를위한 준비 .
그림 2 :. 혼합 아교 세포 문화의 설립 후 다른 시간에 혼합 된 아교 세포의 대표 이미지를 기본 척수 혼합 된 아교 세포는 성인 C57BL / 6 마우스에서 제조 하였다. 대표 이미지도금 후 아교 문화의 진행 상황을 보여줍니다. 1 일에, 일부 세포는 배양 접시에 부착하지만, 대부분은 여전히 둥근된다. 부동 세포와 중요한 파편 많은도 있습니다. 4 일에, 세포의 대부분은 배양 플레이트에 부착된다. 세포는 눈에 보이는 프로세스와 분지 나타납니다. 세포는 산발적으로 분포되어 문화는 현재 약 20 ~ 30 %의 합류이다. 일 8시, 문화 50-60 %의 합류 사이. 문화의 일부 영역은 세포의 큰 패치가 있습니다. 문화의 다른 영역은 세포의 스파 스 성장을해야합니다. 패치 내에서 일부 세포는 "광장 같은"모습에 걸릴. 12 일째에, 배양 물 (여기에 도시 된 이미지에서, 약 90 %의 융합 성) 또는 80 % 이상 융합 성이다. 셀이 시점에서 성장의 로그 단계에와 12-14 실험의 신경교 세포를 사용하기위한 최적의 시간이다 일 사이입니다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
- 안티 마우스 CD45 및 안티 마우스 CD11b를 단일 클론 항체의 조합을 사용하여 표준 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 염색 프로토콜 (11)를 통해 별도의 우물에서 세포를 (4.3 단계)를 사용하여 미세 아교 내용을 검사합니다. CD45 + CD11b를 + 세포는 미세 아교 세포로 식별됩니다.
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결과
이 방법은 마우스 및 래트에서 모두 혼합 아교 세포를 제조 할 수있다. 세포가 마우스 척수에서 파생 된 때 문화의 D (12) 이후 개시에 12 웰 플레이트에 웰 당 평균 총 세포 수는 물론 당 약 10 만 세포와 상대적으로 안정해야한다. 이 방법에서 얻은 신경교 세포 물질 및 관심 제의 투여시 성인 척수 신경교 응답을 검사하도록 설계된 실험에 사용될 수있다. (3)가 하나의 대표적인 실험에서 사이토 카인과 케모카인 응답의 예를도있는 성인 척수 미세 아교 세포에서 성인 BALB / c 마우스에서 얻은 및 문화의 D (13) 이후 개시에 LPS (살모넬라 균 미네소타 Re595)로 처리 하였다. 상청액 상업적 availab을 사용하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 통해 사이토 카인 및 케모카인의 농도를 결정하기위한 24 시간 후 LPS 처리 수거제작 키트.
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토론
는 모든 단계를 포함한 실험 간 재현성있는 결과를 얻기 위해 일관된 방식으로 일정 변화 매체를 수행하는 것이 중요하다. 다음 단계는 우수한 품질의 성인 혼합 된 아교 세포를 얻기에 특히 중요하다.
효소 소화는이 프로토콜의 중요한 측면이다. 이 조직 조각을 단일 세포 현탁액을 얻기 위해서 잘 소화하는 것이 중요하다. 그러나, 오버 소화 상당히 적은 세포에서 발생합니다. 각각의 실험실 배양에 사용되는 튜브의 유형에 기초하여 상기 실제 소화 시간을 결정하는 파일럿 테스트를 수행 할 필요가 평균 조직 량마다 사용하고, 진탕 기의 종류 (진탕 대 회). 또한, 관계없이 선택된 파파인 해리 시스템, 그것을 구성 요소 가끔 교체 수율에 상당한 변화를 초래할 수 있으므로, 일관 동일한 소스에서 동일한 구성 요소를 사용하는 것이 필수적세포의 총 수의.
이 프로토콜에서, 미엘린은 밀도 구배 매체를 이용하여 제거된다. 하고 이러한 솔루션의 밀도...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
성인 척수 혼합 배양은 NIH/NIDA R01 상(PI De Leo) 및 NIH T32 교육 보조금(PI Green)의 보조금 지원을 받아 쥐를 사용하여 처음 개발되었습니다. 이러한 방법은 NIH/NIDA 5K01DA023503(PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130(PI Cao) 및 NIH/NIGMS P20GM103643(PI Meng) 보조금의 지원을 받아 마우스 척수에 더욱 적용되었습니다. 저자는 또한 미세아교세포가 풍부한 혼합 신경교세포를 얻는 데 기술적인 도움을 준 Chicago College of Osteopathic Medicine의 약리학과의 Alejandro M. S. Mayer 박사에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 둘베코' Eagle'의 변형 4.5g/L 포도당이 함유된 s 배지(DMEM) | Lonza | 12-709F | cDMEM 배지는 널리 사용되는 표준 배양 배지입니다. 개별 연구자는 DMEM 및 cDMEM 배지를 만드는 데 사용되는 기타 모든 구성 요소를 어디에서 구입할지 결정할 수 있습니다. |
| L-글루타민 (100x) | Lonza | 17-605E | L-글루타민은 다양한 배양 배지에 널리 사용되는 표준 구성 요소입니다. L-글루타민은 개별 연구자가 어디서 구입할지 결정할 수 있습니다. |
| 항생제-항진균 용액 (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | 이것은 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신의 조합으로 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL 스트렙토마이신 설페이트 및 25 µ를 함유하도록 제조되었습니다. g/mL 암포테리신 B. 개별 연구자는 개별 구성 요소를 어디에서 구입할지 결정할 수 있습니다. |
| 2-메르캅토에탄올(2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | 세포 배양, 분자 생물학 및 전기영동에 적합한 생물 시약. |
| 파파인 해리 시스템 | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | 이 키트의 개별 구성 요소는 별도로 구매할 수 있습니다. |
| Percoll | GE 헬스케어 | 17-0891-01 | Percoll은 멸균 용액으로 판매됩니다. 희석되지 않은 Percoll은 필요한 경우 다시 고압멸균할 수 있습니다. |
| 랩라인 인큐베이터/쉐이커 | 바스테드/랩라인 | MaxQ4000 | 이것은 현재 우리가 가지고 있는 인큐베이터/셰이커입니다. 대신 다른 유형의 셰이커를 사용할 수 있습니다. |
| 리포다당류, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | LPS의 다른 균주도 신경교 반응을 유발할 수 있습니다. 그러나 응답의 정도는 다를 수 있습니다. |
| 마우스 IL-6 듀오셋 ELISA | R& D Systems | DY406 | 각 개별 연구원은 자신이 선호하는 ELISA 키트를 선택할 수 있습니다. |
| 마우스 TNF-alpha DuoSet ELISA | R& D Systems | DY410 | 각 개별 연구원은 자신이 선호하는 ELISA 키트를 선택할 수 있습니다. |
| 마우스 IP-10 (CXCL10) 듀오셋 ELISA | R& D Systems | DY466 | 각 개별 연구원은 자신이 선호하는 ELISA 키트를 선택할 수 있습니다. |
| 마우스 MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia 세트 | BD Biosciences | 555260 | 각 개별 연구원은 자신이 선호하는 ELISA 키트를 선택할 수 있습니다. |
| 마우스 케모카인 Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | 이 제품은 당시 자체 분석에 사용할 수 없었습니다. 대신, 분석을 위해 제조업체에 샘플을 보냈습니다. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | 같은 클론이지만 다른 판매처의 항체를 사용할 수 있습니다. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | 같은 클론이지만 다른 업체의 항체를 사용할 수 있습니다. |
| Accuri C6 유세포 분석기 | BD Biosciences | BD Accuri C6 | 각 개별 연구원은 자신이 선호하는 유세포 분석기를 사용할 수 있습니다. |
| FlowJo 소프트웨어 | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | 각 개별 연구원은 자신이 선호하는 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. |
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