망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법를 통해를 Transcleral 후방 접근

Summary

망막하 주사는 단백질 및 바이러스 벡터와 같은 큰 치료제를 광수용체와 망막 색소 상피에 전달하는 가장 일반적인 기술입니다. 최소한의 부수적 손상과 빠른 회복 시간으로 망막하 공간을 성공적으로 표적으로 삼는 마우스의 대체 방법이 여기에 설명되어 있습니다.

Abstract

망막 주사 성공적으로 직접 감광체로 노광 및 망막 색소 상피 (RPE)를 갖는 interphotoreceptor / 망막 구획 단백질의 치료 적 개입 바이러스제, 세포를 제공하는 사람과 설치류에서 모두 사용되었다. 플라스 미노 겐의 망막 주사뿐만 아니라 최근 전임상 및 임상 시험 고급 망막 질환과 개인에게 바이러스 성 벡터와 줄기 세포를 제공하는 안전 및 / 또는 효능을 증명하고있다. 망막 질환, 특히 유전 적 망막 이영양증의 마우스 모델은 이러한 치료를 테스트하기 위해 필수적이다. 설치류에서 가장 흔한 주입 절차 망막 전방 접근 작은 transcorneal transcleral 또는 절개를 사용하는 것이다. 이 방법, 주사 바늘은 기본 RPE 및 삽입에 영향을주지 감각 신경 망막을 관통 쉽게 닉 렌즈, 렌즈 혼탁 및 비 침습적 imagi의 손상을 유발NG. transcleral를 통해 망막 하 공간에 액세스, 후방 접근 방식은 이러한 문제를 피할 수 : 바늘은 망막 침투하지 않고, 시신경에서 약 0.5 mm 공막을 통과하고 유리체을 방해 방지 할 수 있습니다. 담보 손상 초점 공막 및 과도, 장액 망막 박리의 효과와 관련이 제한됩니다. 이 방법의 단순성은 안구 손상을 최소화 망막 재 부착 빠른 복구를 보장하고, 낮은 실패율을 갖는다. 망막과 망막 색소 상피에 최소한의 손상 효과의 명확한 평가와 치료제 자신의 직접적인 영향 수 있습니다. 이 원고는, 바이러스 벡터, 약리 에이전트를 대상으로 높은 효능, 최소한의 손상과 빠른 복구와 쥐의 망막 하 공간으로 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 줄기 세포에 사용할 수있는 새로운 망막 주입 기술에 대해 설명합니다.

Introduction

망막 주사는 광 수용체 및 기본 RPE ^{1, 2에} 미치는 영향을 연구하기 위해 쥐의 망막에 세포 및 바이러스 에이전트를 전달하는 주요 수단이다. 마우스에서 대부분의 망막 주입 프로토콜은 transcorneal 또는 적도에 transcleral 주사 부위 앞쪽 (그림 1)를 사용합니다. 이 방법은 새김 눈과 렌즈의 결과 혼탁의 감각 신경 망막과 홍채, 망막 출혈, 망막 박리 실질적이고 지속적인 망막 부종 ^3-9의 유리체, 침투의 무결성의 중단을 포함하는 고유의 담보가 손상 될 수 있습니다. 실험 조작은 치료 적 개입 ^3,7,10,11의 효과를 평가하기 위해 이러한 효과를 극복해야한다. 이 연구는, 이러한 합병증을 피할 후방 transcleral 주입 방법의 상세한 설명 및 유효성을 제공 외상을 최소화 서브 타겟팅 높은 성공률을 갖는다망막 공간.

쥐의 망막 하 공간을 대상으로 주사 종종 수행하는 것이 매우 어렵고, 대부분의 연구자들은 벡터가 잘못된 위치로 전달하거나 상당한 망막 손상은 전체 망막 박리 ^(6), 예를 들어 존재하는 시도 실패 고주파 발생. 때문에 사출 합병증 분석에서 제외 눈의 수는 일반적으로 마우스 연구에서보고되지 않고, 우리의 경험에서 다른 연구자와 논의 실패 주사의 수가 50 %만큼 높을 수 및 경험에 따라 달라질 수 있으며 주사를 수행하는 연구자의 기능을 제공합니다. 주입의 성공은 일반적으로 직접 안저 화상 및 / 또는 광 결맞음 단층 촬영 ^7,9에 의해 평가된다. 생쥐의 망막 주사에 대한 높은 성공률과 쉽게 습득 방법은 실험을 촉진하고 레의 전임상 연구의 비용을 줄일 수 있습니다미국에서 실명의 주요 원인은 망막 질환에 대한 atments.

후방은 여기에 설명 transcleral 망막 주사 기술은 임상 및 임상 프로토콜 ^9,12-에서 적응이다. 주입 된 쥐에서 수행 된 비 침습적 진단 평가는 온화하고 매우 지역화 피해를 입증하고 추가 담보 렌즈, 망막과 망막 색소 상피 손상이 부족하다. 따라서 이러한 연구와 연관된 비용을 감소, - (90 % 이상 80) 또한, 비교적 적은 연습, 실험자 높은 성공률 이러한 결과를 얻을 수있다. 이 절차는 전임상 연구에서 감광체 및 / 또는 행 RPE 세포 바이러스 또는 약물 치료 적 개입을 제공하도록 쉽게 실험 간섭을 평가할 수있다.

Protocol

동물 : 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학 (UCLA)에서 자란 야생 형 C57BL / 6J 마우스. 17주 세, 남성과 여성의 쥐를 포함 - 모든 동물 (11)이었다. 모든 마우스 그룹 수납 임의의 사료 및 물과 함께 12시 12분 / 암주기에서 유지시켰다. 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 UCLA 및 비전 연구 협회와 안과 정책의 제도적 지침에 따라 수행되었다.

참고 : 모든 약물과 주사 에이전트가 미국 약전 (USP) 등급이다.

1. 수술 준비

1. 식염수 믹스 100 ㎎ / ㎏ 케타민 8 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스가 더 발가락 핀치 또는 각막 터치 반사가 없도록 깊이로 마취를 관리 할 수 ​​있습니다.
2. 순환 물 패드와 37.0 ° C에서 체온을 유지한다.
3. 2.5 % 페닐에 눈 D와 학생들을 팽창ROPS 및 트림 수염이 시각화를 용이하게한다. 수염 따라서, 위스커가 눈에 명확 블록 액세스하지 위스커의베이스 부분만을 제거한다 트리밍 마우스 상당한 감각 입력을 제공한다. 우리의 경험에 의하면, 마우스는이 절차 후 정상 회복을 보여줍니다. 메틸 눈을 적용하면 건조를 방지하고 마취 유도 과도 백내장 ^(13)을 최소화하기 위해 삭제합니다.
4. 수술 (즉, betadine와 에탄올 또는 뜨거운 구슬) 이전에 악기를 소독.
5. 시각화를 수행 할 경우 무균 환경에서 희석 형광을 (0.01 % 0.9 % 식염수를 사용하여) 준비 (즉, 바이오 안전성 캐비닛) (아래 섹션 3 참조).

2. 사출 현장 준비

1. 적절한 주입 부피 (예를 들어, 0.3-1.0 μL) 주사기 (예를 들어, 5 μL 주사기)을 준비한다.
2. 눈이 디에서 명확하게 볼 위로 향하게되도록 마우스를 배치현미경을 ssecting.
3. 부드럽게 뾰족한 집게로 시간적 결막을 꼬집어. 곡선 Vannas 가위를 사용하여 약 90 도의 원주 절개를합니다.
4. 기본 장부의 캡슐 단계를 반복 2.3.
5. 비강 지구를 회전하면서 뾰족한 집게로 주변의 결합 조직을 절제. 시신경 약 0.5 mm 일시 주사 부위를 향해 작동한다. 복고풍 궤도 동을 방해하지 않도록 세심한주의를 사용합니다.

3. 공막과 망막 주입

참고 :이 절차를 배우면서 0.9 %의 식염수에 0.01 %의 형광의 주입이 시각화 지원하기 위해 사용하는 것이 좋습니다. 형광의 지형 분포를 효과적으로 안저 화상 (아래 섹션 4 참조)과 함께 설명 될 수있다.

1. 부드럽게 22.5도 안과 블레이드와 아이 컵을 긁는하여 주사 부위에 작은 공막 절개를합니다. 이 절개 수오단, 바늘 끝이 공막을 통과 할 수 있도록 충분히 커야 신분증.
2. 5 각도 경 사진 33 G 바늘 (삽입 -. 경사가 직면하고 망막에 각도 병렬로 공막에 10 °를 (원하는 볼륨을 주사 예를 들어, 학습 목적으로 0.01 % 플루 오레 0.3 ~ 1.0 μL).
   참고 : 철저하게 각 주입하기 전에 적당한 용매 및 탈 이온수의 연속적인 세척과 청소하여 주사기의 불임을 유지한다.
3. 바늘을 이동하지 않고, 심지어 압력으로 천천히 플런저 (이상 ~ 3 초) 우울.
   주 : 바늘이 망막 하 공간에있을 때, 상기 플런저를 누르면서, 약간의 저항이 느껴질 것이다. 바늘 공막 또는 RPE를 관통하지 않는 경우 바늘이 망막, 높은 저항을 천공하는 경우 최소한의 저항이 더 없을 것이다.
4. 역류를 최소화하기 위해 바늘을 인출하기 전에 몇 초 동안 기다립니다.
5. 멸균 완충 식염수로 눈을 씻어 눈 시간을 보장다시 정상 위치로 회전 할있다.

및 OCT 안저 영상에 의한 망막 박리 4. 평가

1. 즉시 주사의 품질을 평가하기위한 주사 후 적절한 시간에 간섭 단층 촬영을 수행하는 망막 구조를 평가하는 데 필요한 포스트 분사를 가리킨다.
   주의 : 유사한 연구에서의 OCT 사용의 예는 이전에 ^7,14을 설명 하였다.
   1. 조정 및 주사 부위를 대상으로 OCT의 이미지를 맞 춥니 다. 주사 부위는 중간 선 및 시신경 헤드 시간 0.5 mm이어야한다. 최적의 중심 이탈이 프레임 밖으로 경우에만 필요 여부로 반복합니다.
2. 망막 박리를 시각화하고 엉 - 얼굴 안저 영상 ^{7, 14과} 주입 영역을 염색.
   참고 :의 OCT 이미징 시스템을 사용할 수없는 경우, 연습 벡터와 형광 소량의 주입은 형광 angio을 수행하는 안저 카메라로 시각화 수 있습니다동일한 여기 파장을 사용하여 필터를 차단 그래피로. 하이퍼 형광의 지역화 된 영역은 혈관 아래에 표시되고 망막 하 공간이 제대로 대상으로하면 혈관이 선명하고 뚜렷한 경계를해야합니다. 사출에서 여과포의 가장자리는 하이포 형광에 하이퍼의 전환에 의해 경계가 될 것입니다. 여러 악기는 마우스이 기능을 제공한다; 여기에 사용 된 장비는 다른 ¹⁴ 설명한다.

5. 수술 후 케어

1. 주입 된 눈의 각막 표면에 트리플 항생제 안과 크림의 두꺼운 코트를 적용합니다.
2. 복구를위한 깨끗한 독방 새장에 마우스를 놓습니다. 그들은 완전히 회복 될 때까지 수술을받은 마우스를 함께 사용하지 마십시오.
3. 마취 회복 중에 호흡과 온도를 모니터링합니다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지할 수있을 때까지 동물을 모니터링합니다.
4. 추가 적절한 수술 후 모니터링을 수행및 수술후 통증 관리 카프로 펜의 서브 피하 주사 (5 ㎎ / ㎏)을 포함한 치료.

전위도에 의해 망막 기능의 6 평가 (ERG)

1. ERG 분석 미리 주입을 수행하고 적절한 시간에 망막 기능을 평가하기 위해 필요에 따라 포스트 분사. 주사는 망막 하 공간에 만들어진 경우, 망막 박리는 72 시간 내에 해결됩니다.
   1. 이전에 ^14,15을 설명한대로 전과 주입 후 망막 기능을 평가하기 위해 표준 ERG 기술을 사용합니다.

7. 3D 재건 및 여과포 볼륨 정량화

참고 : 고 대비가보기의 프레임 내에서 전체 분리를 포괄와 10월 스캔이 사용하기에 최적입니다. ImageJ에 / 피지 ^17,18 및 Imaris이 사용되었지만, 다른 소프트웨어를 사용할 수있다.

1. 관심의 B 검사를 내보내기 ImageJ에 / 피지 및 작물 (이미지> 자르기)은 OCT (SC)의 부분에 가져 오기는 사각형 선택 도구를 사용하여 모델링된다.
   1. 콘트라스트 조정 (이미지>> 밝기 / 명암 대비를 조정)과 선으로 두 부분을 연결하여 누락 된 경계를 묘사.
   2. 광 수용체 층에 RPE에 걸쳐있는 줄 도구 (들고 이동)과 직선을 그립니다. 측정 (측정> 분석) 라인의 길이는 단계 7.8에 대한 최대 박리의 크기를 얻을 수있다.
2. 가져 오기 "회색 RGB"플러그인 및 MATLAB 컴파일러 런타임을 사용해서 (재료의 표 참조) 3 차원 재구성 소프트웨어 프레임립니다.
3. OCT를 스캔 (X, Y, Z)에서 교정 매개 변수를 사용하여 (이미지 속성 아래) 복셀 크기를 설정합니다.
4. 네 번째 채널을 만들기 위해, 각 채널에 동일한 가중치와 (이미지 속성 아래) "RGB 회색에"플러그인을 실행합니다. 원래 빨강 - 녹색 - 파랑 채널을 삭제합니다.
5. 콘트라스트 변화를 이용하여 그레이 채널을 전환. 저장 이미지.
6. 의 "추가를 클릭합니다EW 표면의 "3D-보기 탭에서 버튼을 표면을 만드는 가이드 4 단계 과정을 시작합니다.
   1. 표면 레벨 세부 사항 (4 단계의 1)를 설정합니다.
      참고 : 우리의 경험에 12.0-8.0 가장 유효 범위이었다.
   2. (배경 선택에 따라) 최대 영역 크기 7.1.2에서 측정 된 최대 박리의 크기보다 약간 이하로 설정합니다. 회색 채널 반전 (4 단계의 2) 표면을 작성하고 취소.
   3. 망막의 외부 음의 공간과 분리의 표면이 접촉 (4의 3 단계)로 제공하지 않도록 최대 값으로 임계 값을 설정합니다.
   4. 복셀의 개수는 필터의 종류를 설정하고 크기별로 분리 사이트 네가티브 공간을 격리. 표면 (4 단계 4)를 완료합니다.
      참고 : 분리 표면의 볼륨이 통계 탭에서 볼륨 아래에 있습니다.

Results

접근 transcleral 망막 주사는 0.3 μL (N = 18), 0.5 μL (N = 8)과 0.01 %의 형광의 1.0 μL (N = 5)의 주사로 16 야생형 생쥐에서 31 건강한 눈을 수행 하였다 후방. 한쪽 눈으로 인해 구조 및 기능 분석을 방지 미리 기존의 각막 혼탁에 주입에서 제외 하였다. 모든 주입 눈이 보고서에 포함되어 있습니다. 의도하지 않은 망막 박리는 유리체에 감각 신경 망막 또는 누설의 천공은 검출되지 않았다하거나 관찰하는 눈에서 렌즈 칼자국을내는, 염증 반응, 포도막염, 또는 수술 후 감염의 증거였다.

망막 구조는 사전 주입 10 분 후 분사 간섭 단층 촬영하여 사주 후 분사 (도 2 및 3)을 평가 하였다. 9- 포인트 그리드, 최대 박리의 중심 위에 놓인 중심점, 10 분에 넣었다얼굴 스캔<...

Discussion

망막 주사 바이러스 벡터의 전달을위한 선택의 방법이며, 감광체와 기초 연구 및 임상 치료 모두에서 RPE를 조작하기위한 세포 유래 줄기 치료. 환자에서 망막 주사는 일반적으로 직접 시각화 바늘함으로써, 유리체에서 전방 공막과 망막의 뒤쪽 코어 유리체 절제술 및 침투를 수행하고 있습니다. 눈 수정체 이미 않는 백내장 형성 일찍 발생하는 가장 절제술 절차와 마찬가지로 일반적이다. 마우스에서, 망막 하 주사 전통적 유리체 포착 전체로 이어질 수 공막 망막 앞쪽 자주 눈의 후방 공간의 대부분을 차지하는 렌즈 모두 칼자국과 관련된 방법 및 transretinal 침투 완료 망막 박리. 마우스에서의 사후 - 접근 기술은 원치 않는 결과를 줄이고 EF를 해석 할 수있는 능력을 향상하여의도 된 조작의 fects.

여기에보고 된 망막 주입 기술의 장점은 최소한의 구조적 또는 기능적 효과 감소 부수적 인 피해를 포함 (예를 들어, 렌즈 칼자국을내는, 유리체 누출 또는 염증 흐리...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
해밀턴 모델 62 RN SYR	해밀턴	87942	주사기 x 1
해밀턴 바늘 33G, 1.0", 20도, 포인트 3 (304 스테인레스 스틸)	해밀턴	7803-05	바늘 x 6
반나 곡선 가위	Ted Pella, INC.	1347	5mm 블레이드
22.5도 미세 수술 나이프	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
케타젝트	Phoenix	NDC 57319-609-02	케타민
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazine
Fluorescein 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% 식염수 USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
항생제 연고	Akorn	NDC 17478-235-35	안과용
물 순환 펌프	Gaymar	TP-500 T/펌프	전화번호: 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-시리즈	상업용
안저 카메라	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
핀셋 유형 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% 페닐에프린	파라곤 BioTeck	NDC 42702-102-15	안과
IMARIS8	비트플레인		버전 8.1.2
이미지J	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2.5%	Goniovisc	AX0401	메틸셀룰로오스
점안액(린스)	Bausch &		식염수
용액 현미경	Zeiss	Stemi 2000	현미경
광원	Fostec	P/N 20520	광원