Method Article

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법를 통해를 Transcleral 후방 접근

DOI:

10.3791/54808

⸱

December 7th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막하 주사는 단백질 및 바이러스 벡터와 같은 큰 치료제를 광수용체와 망막 색소 상피에 전달하는 가장 일반적인 기술입니다. 최소한의 부수적 손상과 빠른 회복 시간으로 망막하 공간을 성공적으로 표적으로 삼는 마우스의 대체 방법이 여기에 설명되어 있습니다.

Abstract

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망막 주사 성공적으로 직접 감광체로 노광 및 망막 색소 상피 (RPE)를 갖는 interphotoreceptor / 망막 구획 단백질의 치료 적 개입 바이러스제, 세포를 제공하는 사람과 설치류에서 모두 사용되었다. 플라스 미노 겐의 망막 주사뿐만 아니라 최근 전임상 및 임상 시험 고급 망막 질환과 개인에게 바이러스 성 벡터와 줄기 세포를 제공하는 안전 및 / 또는 효능을 증명하고있다. 망막 질환, 특히 유전 적 망막 이영양증의 마우스 모델은 이러한 치료를 테스트하기 위해 필수적이다. 설치류에서 가장 흔한 주입 절차 망막 전방 접근 작은 transcorneal transcleral 또는 절개를 사용하는 것이다. 이 방법, 주사 바늘은 기본 RPE 및 삽입에 영향을주지 감각 신경 망막을 관통 쉽게 닉 렌즈, 렌즈 혼탁 및 비 침습적 imagi의 손상을 유발NG. transcleral를 통해 망막 하 공간에 액세스, 후방 접근 방식은 이러한 문제를 피할 수 : 바늘은 망막 침투하지 않고, 시신경에서 약 0.5 mm 공막을 통과하고 유리체을 방해 방지 할 수 있습니다. 담보 손상 초점 공막 및 과도, 장액 망막 박리의 효과와 관련이 제한됩니다. 이 방법의 단순성은 안구 손상을 최소화 망막 재 부착 빠른 복구를 보장하고, 낮은 실패율을 갖는다. 망막과 망막 색소 상피에 최소한의 손상 효과의 명확한 평가와 치료제 자신의 직접적인 영향 수 있습니다. 이 원고는, 바이러스 벡터, 약리 에이전트를 대상으로 높은 효능, 최소한의 손상과 빠른 복구와 쥐의 망막 하 공간으로 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 줄기 세포에 사용할 수있는 새로운 망막 주입 기술에 대해 설명합니다.

Introduction

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망막 주사는 광 수용체 및 기본 RPE 1, 2에 미치는 영향을 연구하기 위해 쥐의 망막에 세포 및 바이러스 에이전트를 전달하는 주요 수단이다. 마우스에서 대부분의 망막 주입 프로토콜은 transcorneal 또는 적도에 transcleral 주사 부위 앞쪽 (그림 1)를 사용합니다. 이 방법은 새김 눈과 렌즈의 결과 혼탁의 감각 신경 망막과 홍채, 망막 출혈, 망막 박리 실질적이고 지속적인 망막 부종 3-9의 유리체, 침투의 무결성의 중단을 포함하는 고유의 담보가 손상 될 수 있습니다. 실험 조작은 치료 적 개입 3,7,10,11의 효과를 평가하기 위해 이러한 효과를 극복해야한다. 이 연구는, 이러한 합병증을 피할 후방 transcleral 주입 방법의 상세한 설명 및 유효성을 제공 외상을 최소화 서브 타겟팅 높은 성공률을 갖는다망막 공간.

쥐의 망막 하 공간을 대상으로 주사 종종 수행하는 것이 매우 어렵고, 대부분의 연구자들은 벡터가 잘못된 위치로 전달하거나 상당한 망막 손상은 전체 망막 박리 (6), 예를 들어 존재하는 시도 실패 고주파 발생. 때문에 사출 합병증 분석에서 제외 눈의 수는 일반적으로 마우스 연구에서보고되지 않고....

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Protocol

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동물 : 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학 (UCLA)에서 자란 야생 형 C57BL / 6J 마우스. 17주 세, 남성과 여성의 쥐를 포함 - 모든 동물 (11)이었다. 모든 마우스 그룹 수납 임의의 사료 및 물과 함께 12시 12분 / 암주기에서 유지시켰다. 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 UCLA 및 비전 연구 협회와 안과 정책의 제도적 지침에 따라 수행되었다.

참고 : 모든 약물과 주사 에이전트가 미국 약전 (USP) 등급이다.

1. 수술 준비

  1. 식염수 믹스 100 ㎎ / ㎏ 케타민 8 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스가 더 발가락 핀치 또는 각막 터치 반사가 없도록 깊이로 마취를 관리 할 수 ​​있습니다.
  2. 순환 물 패드와 37.0 ° C에서 체온을 유지한다.
  3. 2.5 % 페닐에 눈 D와 학생들을 팽창ROPS 및 트림 수염이 시각화를 용이하게한다. 수염 따라서, 위스커가 눈에 명확 블록 액세스하지 위스커의베이스 부분만을 제거한다 트리밍 마우스 상당한 감각 입력을 제공한다. 우리의 경험에 의하면, 마우스는이 절차 후 정상 회복을 보여줍니다. 메틸 눈을 적용하면 건조를 방지하고 마취 유도 과도 백내장 (13)을 최소화하기 위해 ....

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Results

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접근 transcleral 망막 주사는 0.3 μL (N = 18), 0.5 μL (N = 8)과 0.01 %의 형광의 1.0 μL (N = 5)의 주사로 16 야생형 생쥐에서 31 건강한 눈을 수행 하였다 후방. 한쪽 눈으로 인해 구조 및 기능 분석을 방지 미리 기존의 각막 혼탁에 주입에서 제외 하였다. 모든 주입 눈이 보고서에 포함되어 있습니다. 의도하지 않은 망막 박리는 유리체에 감각 신경 망막 또는 누설의 천공은 검출되지 않았다하거나 관찰하는 눈에서 렌즈 칼자국을내는, 염증 반응, 포도막염, 또는 수술 후 감염의 증거였다.

망막 구조는 사전 주입 10 분 후 분사 간섭 단층 촬영하여 사주 후 분사 (도 2 및 3)을 평가 하였다. 9- 포인트 그리드, 최대 박리의 중심 위에 놓인 중심점, 10 분에 넣었다얼굴 스캔<.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막 주사 바이러스 벡터의 전달을위한 선택의 방법이며, 감광체와 기초 연구 및 임상 치료 모두에서 RPE를 조작하기위한 세포 유래 줄기 치료. 환자에서 망막 주사는 일반적으로 직접 시각화 바늘함으로써, 유리체에서 전방 공막과 망막의 뒤쪽 코어 유리체 절제술 및 침투를 수행하고 있습니다. 눈 수정체 이미 않는 백내장 형성 일찍 발생하는 가장 절제술 절차와 마찬가지로 일반적이다. 마우스에서, 망막 하 주사 전통적 유리체 포착 전체로 이어질 수 공막 망막 앞쪽 자주 눈의 후방 공간의 대부분을 차지하는 렌즈 모두 칼자국과 관련된 방법 및 transretinal 침투 완료 망막 박리. 마우스에서의 사후 - 접근 기술은 원치 않는 결과를 줄이고 EF를 해석 할 수있는 능력을 향상하여의도 된 조작의 fects.

여기에보고 된 망막 주입 기술의 장점은 최소한의 구조적 또는 기능적 효과 감소 부수적 인 피해를 포함 (예를 들어, 렌즈 칼자국을내는, 유리체 누출 또는 염증 흐리.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 중 누구도 상업적 공개를 하지 않았습니다.

Acknowledgements

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우리는 Harold and Pauline Price 안과 의장과 Jules Stein Eye Institute의 MBG, SN에 대한 NEI Core 보조금(EY00331-43)의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Sakaria 가족이 SN과 MGB에 기부한 후한 기부금과 안과에 대한 실명 방지 연구(Research to Prevent Blindness)의 무제한 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 망막하 주사의 초기 OCT 이미지를 입수해 주신 Berkeley School of Optometry의 Charlotte Yiyi Wang에게 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
해밀턴 모델 62 RN SYR해밀턴87942주사기 x 1
해밀턴 바늘 33G, 1.0", 20도, 포인트 3 (304 스테인레스 스틸)해밀턴7803-05바늘 x 6
반나 곡선 가위Ted Pella, INC.13475mm 블레이드
22.5도 미세 수술 나이프Wilson Ophthalmic Corp.91204
케타젝트 PhoenixNDC 57319-609-02케타민
AnasedLloyd LaboratoriesNDC 61311-482-10Xylazine
Fluorescein 10% AK-FluorAkornNDC 17478-253-10100 mg/ml
0.9% 식염수 USPHospiraNDC 0409-4888-500.9% NaCl
항생제 연고AkornNDC 17478-235-35안과용
물 순환 펌프GaymarTP-500 T/펌프 전화번호: 07999-000
sd-OCTBioptigenR-시리즈상업용
안저 카메라Phoenix Research LaboratoriesMICRON III
핀셋 유형 3Ted Pella, INC.5385-3SU
2.5% 페닐에프린파라곤 BioTeckNDC 42702-102-15안과
IMARIS8비트플레인버전 8.1.2
이미지JNIHV1.8.0_77
Hypromellose  2.5%GonioviscAX0401메틸셀룰로오스
점안액(린스)Bausch & 식염수
용액 현미경ZeissStemi 2000현미경
광원FostecP/N 20520광원
롬

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
  2. Pierce, E. A., Bennett, J.

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Subretinal InjectionTranscleral ApproachSclerotomy ProcedureViral Vector DeliveryStem Cell TransplantationRetinal Detachment ModelOptical Coherence TomographyFluorescein TrackingMouse OphthalmologyPostoperative Monitoring

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